O documento discute técnicas de transformação genética em fungos, incluindo a produção de protoplastos, fusão de protoplastos e transformação de DNA exógeno em protoplastos competentes para permitir a integração gênica e a produção de novos genótipos fúngicos.

1. UERGS – Bento Gonçalves
Genética de microorganismos
Prof. Dra. Adriana Dantas

2.  Dificuldade de cruzamentos intergenéricos ou
interespecificos
 Incompatibilidade que ocorre entre duas
linhagens por impedimento de anastomose das
hifas
 Possibilidade de produzir células sem parede
celular (protoplasto) e a fusão destas celulas
antes incompativeis
 Cruzamentos entre especies ou generos distintos
de fungos

3. Protoplastos:
Protoplastos
•células livres de parede celular
A ausência da parede: sistema útil
•extração de organelas celulares
•transferência gênica através da técnica de transformação
genética – eletroporação
•produção de novos genótipos por hibridação somática

4.  Em 1957 isolado de leveduras
 Células esféricas em ambientes osmóticos
 Totalmente desprovidas de parede celular
 Enzimas de isolamento: driselase, helicase,
zimolase e Novozyn 234
 Constituídos por celulases e quitinases
 Utiliza-se micélio de fungos filamentosos, células
de leveduras, conídios germinando ou conídios
intactos

5.  Não deve causar rompimento do protoplasto
 Estabilizadores osmóticos em meio liquido
 Sal (KCl, NaCl, MgSO4)
 Açucar – sacarose
 Valores de 0,5M a 1M

7.  Dois processos
 Substância fusogênicia polietilenoglicol (PEG)
 Induzformação de agregados de células e
formação de pontes citoplasmática entre elas
 Eletrofusão
 Células expostas a uma fonte de corrente alternada
e ficam em linha como um colar de pérolas, em
seguida um pulso de corrente continua é dado e há
uma quebra reversível da membrana, permitindo a
fusão.

8. Desenvolvimento de produtos de fusão em meio contendo Aneurina (esquerda) ou
inositol (direita), utilizando as técnicas de seleção. Protoplastos fundidos foram
semeadas em discos de celofane contendo os suplementos apropriados e incubados
a 25°C por 4 dias.

10.  Duas formas:
 Duas linhagens auxotróficas distintas
 Em média 105 celulas parentais
 Produtos da fusão recuperados em MM
 Seleção de produtos de fusão com mutantes a
agentes inibidores
 Cloranfenicol e eritromicina

11. Linhagem A Linhagem B
Auxotrofica a-b- Auxotrofica c-d-
Obtenção do protoplasto
Fusão (PEG ou eletrofusão)

12. Recuperação em MM
heterocário
diploide
Seleção para obter diploides (MM)
Anaçlise genetica igual ao ciclo parassexual

13.  Quebras das barreiras de incompatibilidade
 Interespecíficas:
 Aspergillus nidulans x Aspergillus rugulosus
 Obtenção de segregantes com cromossomos dos dois
fungos
 Intergenéricas:
 Aspergillus x Penicillum; Candida tropicalis x
Saccharomyces fibugera; S. cerevisiae x
Schizossacharomyces pombe; S lipolytica x Pichia
guillemondii

14. Hibridação somática
Híbridos nucleares ou
citoplasmáticos
(cíbridos)
•fusões
interespecíficas , Fusão
Perda de um nuclear
núcleo
•intergenéricas entre
parentais sexualmente
compatíveis;
•intergenéricos entre
Cíbridos Synkarions
parentais sexualmente (Híbridos
incompatíveis. citoplasmáticos)

15.  Organelas celulares são transferidas para estudos de
herança citoplasmatica
 Obtenção de protoplastos anucleados e sua fusão com
células nucleadas
 Restauração da capacidade respiratória por ação de
mitocôndrias
 Biossíntese de produtos do metabolismo secundário
 Obtenção de cariótipos moleculares
 Transformação genética
 Utilizados na separação e análise de cromossomos

16.  1973 – Neurospora crassa – DNA isolado de
linhagens selvagens transferidos para
linhagensm deficiente para inositol
 1978 – S. cerevisae, protoplastos de mutantes
deficientes para leucina (leu-) receberam DNA
de celulas de leu+
 1979 – Plasmidio de E. coli carregando genes
de levedura

17.  Células providas de espessa parede celular
 Fungos filamentosos – micélio – nitrogênio liquido
 Utiliza-se vetores com plasmidios bacterianos que
carregam genes de fungos
 Para tanto, o DNA é tratado com enzimas de restrição
que quebram em pontos específicos e colocam o
plasmidio da bacteria E. coli
 São selecionados e multiplicados na E. coli
 Plasmidio E.coli com fragmento contendo gene ga-2 de N.
crassa; sintese de triptofano (trpC); arginina (argB);
piridoxina (pyr-4); uracila (ura-5) de N.crassa, A. nidulans

18.  Em estado de competência
 Conídios intactos ou germinados são tratado com acetato de íitio
(0,1M)
 Excelente estado de competência:
 protoplastos na presença de PEG e CaCl2, ou por eletroporação, são
altamente receptivos ao DNA exógeno
 Absorção do DNA
 Colocação do DNA junto com os protoplastos é feita com PEG e CaCl2.
PEG causa fusão celular com auxilio do CaCl2.
 DNA total – ação das nucleases é intensa e parte é degradada;
proteção usando lipossomos
 Inibiçãod as nucleases: espermidina, heparina

19.  Realizar tanto a mutagênese insercional aleatória, como também a
mutagênese dirigida.
 Mutagênese dirigida permite a realização da superexpressão de um ou
mais genes, ou também o silenciamento gênico, seja ele parcial ou
completo.
 Técnicas utilizando protoplastos, Agrobacterium tumefaciens e biobalística
permitem a superexpressão de um gene tanto por integração heteróloga ou
por recombinação homóloga.
 Técnicas baseadas no RNA são capazes de realizar o silenciamento gênico
por meio de regulação pós-transcricional do mRNA.
 Silenciamento gênico parcial pode ser conseguido com a utilização do RNA
antisense e RNA de interferência; já o silenciamento completo é possível
utilizando a interrupção do gene em vetores que permitam a recombinação
homóloga, via ribozimas e transposons.

20.  Usado plasmidios de E. coli que contem um ou mais genes empregados no
processo de transformação
 Três destinos:
 Uma permuta entre o plasmidio carregando o gene, e o gene no
cromossomo do fungo provoca a integração no sitio homologo, ficando
então o cromossomo do fungo com o gene mutante e o plasmidio
carregando o gene selvagem
 O plasmidio é incorporado em um outro local não homologo do
cromossomo. O fungo fica com dois genes, um original mutante e outro
selvagem
 Por uma permuta dupla ou mesmo conversão gênica, o gene do fungo
no plasmidio bacteriano substitui o gene mutante no cromossomo do
hospedeiro

21.  Tipo padrão é o pan7-1
 Se duplicam independentemente dos
cromossomos
 São instáveis, podendo dar
pseudotransformação ou transformação
abortiva
 Seleção é feita na regeneração dos
protoplastos que receberam o DNA exógeno

23.  (A) Atividades biológicas do GFP-tagged variantes de proteína NUDE. Uma cepa (SF2-9) e
thenudF7 ts mutante foram transformadas com genes indicados no vetor.
 Transformantes foram cultivadas por 3 d em meio completo (YAG) sem ou com 0,6 M KCl a 43
° C, que é uma temperatura restritiva para o mutante nudF7.
 A cor de conídios na cepa ΔnudE é semelhante ao de cor acastanhada do micélio.
 A cor de conídios na cepa nudF7 é amarelo.
 (B) GFP:: NUDE variantes são expressos em níveis semelhantes. Extratos de proteína total
foram feitas a partir de uma cepa ΔnudE transformado com genes indicados no vetor .
 Dois transformantes diferentes foram usados ​para cada GFP:: variante NUDE. Proteínas (12 mg
/ pista) foram separados em 10% SDS-PAGE e immunoblotted com um anticorpo anti-GFP.