NGS現場の会第2回_アメリエフ株式会社_がんExome解析

がんゲノムのエクソーム解析

2012年5月24日
アメリエフ株式会社

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要旨
次世代シーケンサー（NGS）から出力される膨大なデータから、生物学的意味付けまでの一連の解析を、常に
最新の解析ツールにアップグレードできるフレキシブルなパイプラインの構築は、研究の効率化に有効である。
我々は、GATK、SAMtools、VarScanなどを用いて、がん細胞と正常細胞から、ソマティックな変異を検出するた
めの、解析パイプラインの構築を行った。

＜ソマティック変異を検出する流れ＞
【方法１】
SAMtoolsを用いて、がん細胞と正常細胞から intersectBedなどで偽陽性を除外するために
各々のSNV/Indelを検出 → がん細胞特異的なSNV/Indelを抽出 → GATKでも検出されたSNV/Indelを検出

Tumor.vcf Normal.vcf Somatic? Somatic!

【方法２】
偽陽性を除外するために
SAMtoolsを用いてpileupファイルを出力 → VarScanを用いてSNV/Indel検出 → GATKでも検出されたSNV/Indelを検出

Tumor.pileup Normal.pileup Somatic
Germline Somatic LOH Unknown Somatic!
※Pileupを入力することで、各々のマッピング情報を
比較しながらソマティックな変異を検出できる

方法１と２はどちらが有効なのか？？考慮すべき問題点は？
2

方法
■データ
Nature Genetics Volume: 43, Pages: 875–878 Year published: (2011) DOI: doi:10.1038/ng.907 Received 13 May 2011 Accepted 15 July
2011 Published online 07 August 2011

Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cell carcinoma of the
bladder
・移行上皮癌（TCC）は、膀胱癌の中で発生頻度が最も高い。
・Discovery screenとして、患者9人のエキソーム解析を行った。
・Prevalence Screenとして、発見された全ての変異遺伝子に対して、異なったステージとグレードの患者88人の試料を用いてスクリーニングを行った。
・患者97人のうち59% にクロマチンリモデリングにかかわる遺伝子（UTX、MLL-MLL3、CREBBP-EP300、NCOR1、ARID1A、CHD6）に変異が認められた。
・UTX は、ステージとグレードのより低い腫瘍において、はるかに高い頻度で変化しているため、膀胱癌における分類と診断において役に立つ可能性
がある。
・クロマチン制御の異常が膀胱癌の特徴であることを示唆した。

上記のデータのうち、下記の4検体8サンプルを使用した。
・ Illumina Genome Analyzer IIを使用した。
・NimbleGen Sequence Capture 2.1M Exome Array（SeqCap EZ Exome発売前の商品）を使用した。

num SRR SRX sample
1 SRR290592 SRX079167 B2_Blood
2 SRR290593 SRX079168 B2_Cancer
7 SRR290599 SRX079174 B10_Blood
8 SRR290600 SRX079175 B10_Cancer 3

方法
■ソフトウェア

1. FastQC ： FastqファイルのQC
QC 2. FastX ： Fastqファイルをフィルタリング
3. TagCleaner ：混入しているアダプターを予測
4. compfastq ：ペアリードのうち片側のみのリードを除外

Mapping 1. BWA ：アライメント＆マッピング
2. Picard ：重複リードの除去

1. SAMtools ： SNV/Indel検出、BAMファイル操作
SNV/Indel 2. VarScan ： Tumor/Normal比較
3. GATK ： SNV/Indel検出、カバレージ算出
4. QuickAnnotator ：アノテーション付与

集計 1. snpEFF ：アノテーション付与/集計
2. 弊社開発スクリプト
4
4

方法
■エクソーム解析の手順
参考コマンド
FASTQ形式チェック
QC # FASTQデータのクオリティチェック
htmlやサマリーが出力される
データクオリティチェック（FastQC）
$ fastqc -o FILE -f fastq FILE1.fastq
# クオリティ20未満の塩基が80%以上のリードを除去
Illumina CASAVA filter [Y] を除去
$ fastq_quality_filter -i FILE1.fastq -o
Mapping FILE1.qual.fastq -q 20 -p 80 -Q 33 -v
クオリティ20未満が80%以上の
リードを除去 # クオリティ20未満の末端をトリム
弊社開発
スクリプト $ prinseq-lite.pl -fastq FILE1.qual.fastq -
クオリティ20未満の末端をトリム Qcleaner使用 out_format 3 -log -trim_qual_right 20 -
trim_qual_left 20
SNV/Indel
未知の塩基(N)が多いリード除去 # 配列長が20未満のリード除去
$ prinseq-lite.pl -fastq
配列長が短いリード除去 FILE1_prinseq_good_Su1_.fastq -
out_format 3 -min_len 20
集計片側のみのリードを除外

データクオリティチェック（FastQC）

※Qcleanerの詳細につきましてはT38のポスター、または、アメリエフのブースへお越しください。
5

方法
参考コマンド
# アライメント
$ bwa aln -t 4 hg19.fa FILE1.treated.fastq -f
FILE1.sai
アライメント
QC # マッピング→BAMに変換→ソート
BWA
マッピング $ bwa sampe -r
"@RG¥tID:FILE¥tSM:FILE¥tPL:Illumina" -n
SAMファイルを 3 -N 10 -a 500 hg19.fa FILE1.sai FILE2.sai
BAMファイルに変換 FILE1.treated.fastq FILE2.treated.fastq |
Mapping samtools view -Sb - | samtools sort -
SAMtools FILE.sorted
BAMファイルをソート
# Duplicated reads を除去
BAMファイルをインデキシング $ java -jar MarkDuplicates.jar
I=FILE.sorted.bam
SNV/Indel Duplicated reads を除去 Picard O=FILE.sorted.redup.bam
METRICS_FILE=jeter.metrics
カバレージを計算 BEDtools REMOVE_DUPLICATES=true
ASSUME_SORTED=true
SAMtools VALIDATION_STRINGENCY=SILENT
集計 SNV/Indel検出

# Duplicated reads を除去
$ samtools mpileup –Bgf hg19.fa
FILE.sorted.redup.bam | bcftools view
-vcg - > FILE.vcf
6

方法
参考コマンド
QC # ソマティックな変異検出
がん細胞特異的な多型検出 $ java -jar VarScan.v2.2.11.jar somatic
①ケースとコントロールでカバレージが b2_blood.pileup b2_cancer.pileup
10以上
②Base Qualityの平均が15以上
b2.varscan.vcf --output-vcf
③癌のリードの10%が変異支持
VarScan
④癌のリードの5本以上が変異支持 # ソマティックな変異フィルタリング
Mapping ⑤コントロールと同じ変異 $ java -jar VarScan.v2.2.8.jar somaticFilter b2.
varscan.vcf.snp --min-coverage 10 --min-avg-
qual 15 --min-var-freq 0.1 --min-reads2 5 --
output-file b2.varscan.vcf.filterd.snp
リアライメントして多型を再検出 GATK
SNV/Indel # GATK入力用にBAMファイルを並び替え
java -jar ReorderSam.jar
I=FILE.sorted.redup.mapped.bam
VarScanとGATKで BEDtools
共通するSNV/Indelを抽出 O=$FILE.karyotypic.bam
REFERENCE=hg19.karyotypic.fa
集計
# GATKによるSNV検出
$ java –jar GenomeAnalysisTK.jar -T
UnifiedGenotyper -R hg19.karyotypic.fa -I
FILE.karyotypic.realigned.alnRecal.bam -o
FILE.gatk.snv.vcf
7

方法

参考コマンド
SNV/ Indelをフィルタリング
QC ① Mapping qualities ≧ 30 SAMtools # SNV/ Indelをフィルタリング
② SNV qualities ≧ 20
③ Indel qualities ≧ 50 $ awk '/^#/ || (/INDEL/&&$6>=50) ||
(!/INDEL/&&$6>=20)' b2.snv.vcf >
b2.filtered.snv.vcf
Indelをフィルタリング
①一方の向きのリードのみが
支持するIndelは除外 #アノテーション付与/集計
Mapping ②30base以内にSNVがある弊社開発 $ java -Xmx4G -jar snpEff.jar eff -c
Indelは除外スクリプト snpEff.config -i vcf -o vcf hg19
b2.filtered.snv.vcf > b2.filtered. eff.snv.vcf
偽遺伝子と反復配列に含まれる場
合は、変異支持するリードの10%以
上がユニークなSNV/Indelを抽出
SNV/Indel
アノテーション付与/集計 snpEFF

情報付与弊社開発
dbsnv135,1000 genomes スクリプト
集計 OMIM, GO QuickAnnotator

※QuickAnnotatorの詳細につきましては、アメリエフのブースへお越しください。

8 8

結果

・QCおよびマッピングの結果
B2_Blood B2_Cancer B8_Blood B8_Cancer B9_Blood B9_Cancer B10_Blood B10_Cancer
SRR290592 SRR290593 SRR290594 SRR290597 SRR290595 SRR290598 SRR290599 SRR290600
フィルタリング率
クリーニング前 271,286,968 259,326,348 286,222,172 259,677,208 282,187,548 254,273,550 258,459,568 265,407,220
クリーニング後 260,322,476 248,161,648 274,677,306 248,021,142 273,326,192 244,913,382 252,955,308 257,523,242
95.96% 95.69% 95.97% 95.51% 96.86% 96.32% 97.87% 97.03%
マッピング率
マッピング前 260,322,476 248,161,648 274,677,306 248,021,142 273,326,192 244,913,382 252,955,308 257,523,242
マッピング後 228,755,759 206,183,044 241,507,897 197,004,644 242,104,730 202,828,283 210,955,736 220,644,478
87.87% 83.08% 87.92% 79.43% 88.58% 82.82% 83.40% 85.68%
カバレージ
Average of Coverage 12.27 11.88 10.22 8.60 10.59 9.84 8.25 9.07
Averageof Coverage (>=5) 72.88 67.36 42.67 27.06 48.11 41.53 27.08 54.83
Averageof Coverage (>=10) 109.56 93.26 90.71 63.25 94.44 81.35 56.90 95.83

クリーニング前クリーニング後

9 9

結果

B2サンプル

・方法２. VarScan出力例 ※VCFフォーマットも出力可能
QC

Mapping

SNV/Indel

集計

Germline, Somatic, LOH, Unknownに分類

10 10

結果
B2サンプル

・集計／情報付与
方法１ . SAMTools 方法２ .VarScan

11 11

結果
B2サンプル

・集計／情報付与

方法１ . SAMTools 方法２ .VarScan
Coverage

Changes by chromosome

12 12

結果
B2サンプル

・方法１
SAMtoolsを用いて、がん細胞と正常細胞から intersectBedなどで偽陽性を除外するために
各々のSNV/Indelを検出してフィルタリング → がん細胞特異的なSNV/Indelを抽出 → GATKでも検出されたSNV/Indelを検出
QC

Tumor.vcf Normal.vcf Somatic? Somatic!
148,724 145,812 25,224 22,102

Mapping 約17.0%ががん特異的 391,461
・方法２ GATKと一致/がん特異的
偽陽性を除外するために約87.6%
VarScanを用いてSNV/Indel検出 → GATKでも検出されたSNV/Indelを検出

SNV/Indel Somatic!
Germline Somatic LOH Unknown 1,813
128,988 6,170 7,091 158
GATKと一致/がん特異的
TOTAL 154,748 約29.4%
集計 391,461
約3.99%ががん特異的

VarScanは偽陽性（はずれ）が多い？
GATKおよびSAMtoolsは偽陰性（見落とし）が多い？実験的に調べる必要
13 13

お知らせ
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