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31. Le Menn, F., Rochefort, H. & Garci...
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Maitre 1985

  1. 1. BIOCHIMIE, 1985, 67, 215-225 Caract6risation de r6cepteurs sp6cifiques /t l'cestradiol, induction de la vitellog6nine et de son m R N A dans le foie de truite arc-en-ciel (Salmo gairdnerii). J e a n - L o u i s M A I T R E , Louis M E R C I E R , L a u r e n c e D O L O et Yves V A L O T A I R E . Laboratoire de Biologie Moldculaire, Campus de Beaulieu, UER SVE, Universitd de Rennes L 35042 Rennes Cedex. ERA C.N.R.S. no 56Z (Refu le 5-11o1984,acceptd apr~s rdvision le 9-l-1985). R ~ s u m ~ - - Chez toutes les espdces ovipares ~tudides h ce jour, la synthOse et l'utilisation de la vitellogdnine (Vg) est un phdnom~ne intimement lid ~ la reproduction. La synth~se de la Vg dans le foie de truite arc-en-ciel (Salrno gairdnerii) est sous la ddpendance de l'cestradiol (E2) qui agit vraisemblablement selon le schdma classique du m~canisme d'action des hormones stdroMes. AprOs liaison de l'hormone ~ un rdcepteur spdcifique, le complexe ¢estradiol-rdcepteur peut interagir avec la chromatine et moduler l'expression du gone de la Vg, ce qui se traduit par une augmentation de la synthOse de RNAm Vg et de Vg. Nous montrons ici : (1) la prdsence de rdcepteurs spdcifiques des oestrogdnes (constante de dissociation Ko = 1,5 x 10-9M pour E2) dans le cytosol du foie de truite mdle; (2) que le foie du male constitue un contr61e experimental idOal au niveau ~(zdro ~, permettant de suivre, aprOs stimulation par E2, la cindtique d'induction du mRNA Vg par hybridation avec le cDNA Vg; et (3) l'apparition de Vg dans le sdrum en utilisant une technique de dosage original (rocket immuno-dlectrophordse). Le modkle vitellogdnine du foie de truite mMe et les techniques originales mises au point seront trOs prdcieuses pour dtudier l'influence des facteurs endogOnes et exogdnes sur les diffdrentes dtapes (rdcepteurs, transcription, traduction) de la rdgulation de la synthOse de Vg. Mots-cl~ : vitellog~nine / ~stradiol / r6cepteurs / RNAm vitellog~nine / truite.. S u m m a r y m In all egg laying vertebrates, synthesis and use of vitellogenin (Vg) are intimately bound to the.active phase of reproduction. In the liver of the rainbow trout (Salmo gairdnerii), Vg synthesis is influenced by estradiol (E2) which, we believe, acts through the classical mechanism of steroid hormone action. After binding of the hormone to a soluble specific receptor protein, the estradiol-receptor complex can interact with chromatin and modulate the expression of Vg genes, leading to increased synthesis of specific mRNA and Vg. We show here : (i) the presence of specific cestrogen receptors (dissociatiOn constant KD ~-- 1.5 x lO-gM for E2) in the cytosol of the male trout liver. (ii) The male liver, offering, an ideal experimental control of "zero" background, we followed -- in the liver of mide trouts 1 the kinetics of induction of Vg mRNA by hybridization with Vg cDNA, after Ez stimulation; and (iii) the apparition of Vg in the serum by using an original rocket immuno-electrophoretic,technique. The male trouts Hver vitellogenin model and the original techniques we developed will be very useful to,study the influence of endogenous and exogenous factors on t.le different steps (receptors, transcription, translation) of vitellogenesis regulation. Key-words : vitellogenin / estradiol / receptors / mRNA viteliogenin / trout.
  2. 2. 216 Jean-Louis Maitre and coll. Introduction Preparation du cytosol Le cytosol a 6t6 pr6par6 par homog6n6isation du C h e z les vert6br6s ovipares, les prot6ines du foie dans 4ml de tampon I (20mMTris, 1,5 mM vitellus sont synth6tis6es dans le foie sous forme EDTA, l mM D'IT, 10mM Na:MoO~) pH 7,4. L'ho- d ' u n e grosse mol6cule pr6curseur : la vitellog6- mog6nat a 6t6 centrifug6 fi 3 5 0 0 0 x g ~t 0°C pendant nine qui se scinde en phosvitine et lipovitelline 20minutes et ensuite fi 2 0 0 0 0 0 x g ~t 0°C pendant apr6s incorporation p a r les oocytes [1-4]. 90 minutes. La synth~se et l'utilisation de la vitellog6nine sont des ph6nom~nes intimement li6s fi la repro- Purification partielle des r~cepteurs duction. C o m m e chez les autres vert6br6s, la La pr6cipitation fractionn6e des prot6ines solubles synth6se de vitellog6nine chez les poissons est a 6t6 r6alis6e sur une fraction de cytosoi ~t des sous le contr61e direct des oestrog6nes : cestradiol concentrations en (NH4)2SO4 (AS) de 30 % et 50 % de [5-10] et oestrone [11, 12]. C e p e n d a n t , fi part les saturation. Une solution satur6e de (NH~)2SO~ dans le travaux de R o a c h et Davis [13] sur le poisson-chat tampon I a 6t6 ajout6e goutte :~ goutte, avec agitation, et, plus r6cemment, ceux de C h e n [14] chez la ~t des fractions de cytosol. Apr~s 30 mn, la suspension truite arc-en-ciei, il n'existe gu~re de donn6es sur a 6t6 centrifug6e ~ 3 600 x g pendant 10 minutes. Les culots AS 30 % et AS 50 % ont ensuite 6t6 dissous dans les m6canismes mol6culaires de la r6gulation de le tampon I, dans un volume d6fini par le nombre la synth6se de cette prot6ine chez les poissons. d'essais :~ traiter. L'objet de ce travail a 6t6 de montrer, :~ l'aide de techniques que nous avons mises au point ou Mesure de la liaison de 3H-E2 adapt6es (dosage de la vitellog6nine et de son R N A messager), que les diff6rentes 6tapes du Les constantes de dissociation ont 6t6 d6termi- n6es en ajoutant des concentrations croissantes m6canisme mol6culaire d'activation des g6nes de (7,5x 10-~°M fi 5 x 10-SM) de (3H)-E2 --- un exc~s la vitellog6nine : liaison de l'cestradiol ~t un r6cep- (100fois) de (~H)-E2, ~ 751.d de cytosol brut ou de teur sp6cifique, i n d u c t i o n ou modification de preparation partiellement purifi6e de r6cepteurs. Le l'expression des g6nes c o n d u i s a n t ~ la synth~se de volume final de chaque essai a 6t6 ajust6 h 250 I.tl. m R N A et de vitellog6nine, 6taient 6galement La sp6cificit6 de la liaison a 6t6 d6termin6e par pr6sentes chez la truite arc-en-ciel. addition de 75 I.tl de cytosol brut h des fractions de 175 I11 de (3H)-E2 (2,88 x 10-gM) contenant des concen- trations croissantes de st6roides comp6titeurs darts le Materiel et m~thodes tampon I. Apr~s incubation, pendant 3 h ~ 0°C, l'hormone Animaux et produits chimiques radioactive li6e aux r6cepteurs a 6t6 mesur6e par addition de 25 I.tl de charbon-dextran ~ I0% (DCC) Les truites arc-en-ciel (Salmo gairdnerii) en prove- dans le tampon I, centrifugation fi 3 600 x g pendant nance de la pisciculture de Gournay/Aronde (Oise) 10 minutes fi 0°C et comptage de 150 lal de surnageant sont 61ev~es dans les bassins du Laboratoire de Physio- dans 10 ml d'ACS (Amersham). La liaison non sp6cifi- logie des Poissons (I.N.R.A Rennes) dans un syst~me que a ~t6 d6termin~e par la quantit6 de (3H)-E2 li6e en d'eau recycl6e [15]jusqu'fi utilisation pour les exp6rien- pr6sence d'un exc6s de'( IH)-E2. Elle a 6t6 soustraite des ces. autres valeurs pour obtenir la quantit6 de (3H)-E2 li6e Les r~actifs ont 6t6 obtenus chez les fournisseurs sp6cifiquement. ci-apr~s indiqu6s: 17l]-oestradiol (E2), ~estrone (E~), cestriol (E~), di6thyl~tilbestrol (DES), 5ct-dihydrotestos- Extraction des st~roMes et chromatographie sur t6rone (5ct-DHT), 5ct-androstane-3[3, 17[3-diol (3[3-diol), couche mince bleu de Coomassie, bromure d'6tbidium, ficoli, polyvi- nylpyrrolidone, s6rum albumin bovine (BSA), DNA Le cytosol incub6 pendant 3 h fi 0°C en pr6sence de de testicule de saumon (Sigma Chemical Company, (3H)-E2 (5 x 10-gM) a ~t6 extrait par 2 fois 5 volumes Saint-Louis, U.S.A.). D6oXydbonucl6ase I, DNA po- d'un m61ange cyclohexane-ac6tate d'6thyle (1/1). Apr6s lym6rase I, les 4 d6oxyribonucl6otides dATP, dCTP, centrifugation ~t 3 600 x g pendant 10 minutes, la phase dGTP et dTI~P (Boehringer Mannbeim, R.F.A.). D6oxy organique a 6t6 6vapor6e :~ sec. L'extrait see a 6t6 repris (I',2',5-3H) cytidine 5' triphosphate 50 Ci/mmo]e, par du m6thanol contenant les st6roides t6moins El, E2 m6thyl (1',2',5-~H) thymidine 5' triphosphate 109 Ci/ et E3 (1 mg/ml) et d6pos6 sur plaque (20 x 20cm) de gel mmole, (6,7)H)1713-cestradiol 55Ci/mmole (Amers- de silice. La s6paration des st6roides a alors 6t6 ham France SA). effectu6e ~ temp6rature ambiante dans le syst6me de solvants chloroforme-ac6tate d'6thyle (80/20). Apr6s rep6rage de la position des st6roides t6moins :~ 254 et 366 nm, le gel de silice a 6t6 gratt6 par fraction de
  3. 3. Expression du g~ne de la vitellog~nine de la truite 217 0,5 x I cm. Les st6roides ont alors 6t6 extraits de chaque refroidissement de l'agarose, on r6alise 9 puits de 2 mm fraction par 2 x 2 ml d'ac6tate d'6thyle, 6vapor6s ~ see, de diam6tre par succion de ragarose h raide d'une repris par 200 lal de m6thanol, et compt6s dans 2 ml aiguille reli6e ~ une trompe gt vide. Neuf 6chantillons d'ACS. de 2 I11 peuvent ainsi ~tre analys6s par plaque de 5 cm de c6t6. Apr6s 61ectrophor6se (18h ~ temperature ambiante, voltage constant=2,3 volts/cm) les plaques Extraction des RNA sont lav6es pendant 24 h dans le NaCI A 0,9 % et 1 h Les foies des animaux sont pr61ev6s rapidement, dans l'eau distill6e. Elles sont ensuite s6ch6es sur congel6s dans I'azote liquide et stock6s au cong61ateur papier Whatman 3 MM fi l'6tuve gt 40°C et color6es au g~ - 8 0 ° C jusqu'fi utilisation. Le RNA total est extrait bleu de Coomassie. La quantit6 de vitellog6nine est par la technique d'Auffray et Rougeon [16], modifi6e d6termin6e par mesure de la hauteur du pie d'immuno- par Tenniswood et Simpson [17]. Le RNA poly A + a 6t6 pr6cipitation par comparaison avec des pics standards pr~par6 par chromatographie sur oligo-dT cellulose obtenus avec des quantit6s croissantes de vitellog~nine d'apr6s la technique d'Aviv et Leder [18], a~,ec un taux purifi6e. de r6cup6ration de 10 g~30 lag de RNA poly A ÷ par mg de R N A total [19]. Les pr6parations du RNA sont Dosage de l'oestradiol analys6es par 61ectrophor~se sur plaque d'agarose 1,2 % dans des conditions d6naturantes [201 pour s'as- I1 a 6t6 r6alis6 par Radio Immuno Assay (R.I.A.) au surer de la qualit6 des pr6parations. La concentration Laboratoire de Physiologie des Poissons [24]. en RNA est d6termin6e sur une aliquote par mesure de l'absorption ~ 260 nm. Resultats Hybridation du RNA messager vitellog#nine Les RNA sont immobilis6s par liaison covalente sur Ddtermhlation des caractdristiques du rdcep- des filtres de papier trait6s ~ l'amino-thio-ph6nol et teur soluble du 17fl-oestradiol diazot6s selon la technique d6cr[te par Seed [21]. Des aliquotes de 10 lal contenant 10 lag de RNA total ou 5 L ' i n c u b a t i o n de (6,7-3H)-E2 _ un exc~s 10 ng de RNA poly A ÷ sont d6pos6es sur les filtres (100 fois) de (~H)-E2 et de cytosol, ~t 0°C, permet et incub6es 12 h entre 2 feuilles de parafilm scell6es. de m o n t r e r une liaison sp6cifique du 17[3-oestra- Les hybridations sont ensuite r6alis6es dans les condi- diol dans le cytosol de foie de truite. Cette liaison tions d6crites par Wahl et aL [22] puis les filtres sont est maximale d~s 30 minutes et reste stable pen- brfil6s dans un ~ autooxidizer)> Packard Tricarb mo- dant au moins 2 4 h (L. D o l o et L. Mercier, d61e 306, et la radioactivit6 d6termin6e par scintillation r~sultats n o n publi6s). liquide au moyen d'un appareil Isocap 300 (Nuclear La mesure des param~tres de liaison du Chicago). 1713mestradiol darts le cytosol a et6 effectu6e apr6s La sonde utilis6e, pr6par6e en collaboration avec M. 3 h d ' i n c u b a t i o n h 0°C. D a n s ces conditions, on Tenniswood, D. Bailey et J.R. "rata (National Institute for Medical Research, Mill Hill, Londres), est un n'observe pas de t r a n s f o r m a t i o n du (6,7-3H)-E2 plasmide pAT 153 dans lequel a 6t6 ins6r6 un fragment (Fig. 2). de 0,6 Kb correspondant ~ une s6quence du RNA La repr6sentation de S c a t c h a r d de la liaison du messager de la vitellog6nine [23]. Cette sonde a 6t6 1713-cestradiol dans le cytosol n'est pas toujours caract~ris6e par Northern Blot (Fig. 1), eta 6t6 marqu6e lin6aire, s u g g 6 r a n t la pr6sence d ' a u moins 2 types par ~t nick translation >>en utilisant les d6oxynucl6oti- de sites de liaison. Par contre, apr6s pr6cipitation des triphosphates tdti6s. L'activit6 sp6cifique est com- par (NH4)2SO4, on retrouve dans la fraction prise entre 7 et 12 laCi/lag de DNA. AS 30 % un c o m p o s a n t u n i q u e de haute affinit6 KD----1,52x 10-aM. La pr6cipitation fractionn6e Dosage de la vitellog~nine des prot6ines du cytosol par (NH4)2SO4 permet de Le sang est pr61ev6 chez les animaux en exp6rience s6parer les sites de haute affinit6 (fraction AS par ponction dans la veine caudale ~ l'aide d'une 30 %) des sites de faible affinit6 (fraction AS 50 %) seringue h6parin6e. Apr6s 24 h de d6cantation, 1~ s6rum et permet une purification partielle des r6cepteurs est obtenu par centrifugation gl 2 000 x g. Les 6chantil- de l'cestradiol. Le n o m b r e de sites de liaison dans Ions sont ensuite stock6s au cong61ateur ~ - 2 0 ° C . Le la fraction AS 30 % ( n = 1,69 x 10-~3moles/mg de taux de vitellog6nine est d6termin6 par une technique prot6ines) est en effet s u p 6 d e u r ~ celui mesur6 d'immuno61ectrophor6se que nous avons misg au point dans le cytosol total (n = 5,81 x l 0 - ~4m o l e s / r a g de apr~s pr6paration d'un anticorps sp6cifique. Les films prot6ines) (Fig. 3). de plastique (F.M.C. Gelbond films) sont d6coup6s en carr6s de 5 cm de c6t6. L'anticorps antivitellog6nine est La Figure 4 m o n t r e la sp~cificit~ 6troite de la dilu6 au 1/400 °dans la solution d'agarose fi 1%. Apr~s liaison du 1713-eestradiol. Parmi les st6ro'fdes
  4. 4. 218 Jean-Louis Maitre and coil 1 2 m .! ,i i ~_Vg m RNA 28S ¢..18S FzG. 1. -- Northern Blot des RNA.totaux : 101tg~ de RNA total de foies de tndtes m~les tdmoins (1) et stimulds ~ l'eestradiol (2) ont dt~ transforms sur papier activ~ gt raminothioph~nol nprds ddnaturation et ~lectrophor~se sur gel d'agarose 1,2 %. Le papier a 6t6 ensuite hybrid~ dans les conditions d~crites avecla sonde vitellog6nine marqu6e au 32p, puis autoradiographi~e (24 h d'exposition ~ --80°C; film Kodak X Ray Film DEF5). La position des RNA 28S et 18S r~v~l~e au bromure d'fithydium parall~lement sur le gel est indiqu,~e par les fl~ches.
  5. 5. Expression du gdne de la vitellogdnine de la truite 219 F II r = 0.980 Kd: 1,41 x lO'gM n= 5,EI2 x l O - ° ~ m o l e / m g o,~o r = 0,918 K d = 1 , 5 2 x IO-~IM n=1,69 x lO-t~mole/mg 0 5 10 15 FIG. 2. - - S~paration par chromatographie sur gel de silice, o.o~ dans le systkme chlorofonne-ac~tate d'dthyle (80/20), des stdrot'des extraits apr~s incubation du O'tosol pendant 3 h £t O'C, en presence de (6,7-JII~E: (5 x ]O-~M). La position des stEroides t~moins est indiquEe par un trait plein situ6 sous raxe des abscisses (E~=~estriol, E2=cestradiol, E, = eest rone). FIG. 3. -- Representation selon Scatchard de la liaison ......~ spdcifique de (JH}-Ez dans le cytosoL O 1 *¢ 3 • IO'~OM Des fractions aliquotes de cytosol brut ( - . e - ) (12421ag liee Spl~cifique protEines/essai) ou de preparations partiellement purifiEes de rEcepteur cytosolique - - a p r ~ s precipitation fractionnEe par apr~s 61imination de l'hormone libre par le DCC. Dans tous (NH~),SO4-- fraction AS 30% ( - o - ) (287 lag prot~ines/ les cas, l'hormone spEcifiquement li~e a 6tE d~termin~e par essai) et AS 50% (zx) (525 ttg protEines/essai) ont 6t6 incu- soustraction de i'hormone liEe non spEcifique :~ l'hormone liEe bees pendant" 3 h :~ 0°C, en presence de concentrations crois- totale (r reprEsente le coefficient de correlation ~valu6 pour santes (7,5 x lO-'°M A 5 x lO-SM) de (~H)-E2 --- un exc~s (100 chacune des droites tracEes, et n repr~sente le nombre de sites lois) de ('H)-Ez. L'hormone radioactive liEe a Et6 dEterminEe de liaison par mg de protEines). O.I ._o- 10C u ~ o ol ¢- o 60 ol °~ 10-~ 10.8 !'0-7 i0 -6 I"0-5 [ ] st~ro'fdes(M) FIG. 4. - - Competition de (IH)-Ez ( - • - ) , DES ( - o - ) , 5(z-DHT ( - [] - ) , 3~-diol ( - • - ) , progesterone (- • - ) , dexamdthasone ( - tx -) sur la liaison de (JH)-Ez dans le cytoso?: Des fractions de cytosol ont ~t~ incub~es en presence de 1.60 x'IO-9M de (3H)-E= et de concentrations croissantes des diff~rents stEro'/des comp~titeurs, pendant 3 h h O°C. L'hormone radioactive liEe a ~t~ mesur6e apr~s traitement des fractions par le DCC. La liaison non sp~cifique a fit6 ~valu~e dans les mEmes conditions, en presence d'un exc~s (800 fois) de ('H)-E2. La quantitE de (3H)-E2 spEcifiquement li~e.en prfisence des diffErents stEroides est repr~sentEe en % du contrEle sans compEtiteur.
  6. 6. 220 Jean-Louis Maitre and coll. utilis6s, seuls les mstrog6nes ((~H)-E2 et DES) le RNA poly A ÷ des animaux stimul6s contenait sont des comp6titeurs efficaces de (aH)-E2. L'af- environ 10% de m R N A vitellog6nine [19]. La finit6 relative du DES est toutefois plus faible (3 quantit6 de mRNA Vg d6celable par la technique 7 fois) que celle de E2. La 5c(-DHT est un d'hybridation sur filtre serait donc de l'ordre de comp6titeur faible, tandis que le 31~-diol, la 1 ng, ce qui correspond ~t la sensibilit6 d6termin6e progest6rone et le dexam6thasone ne sont pas pr6c6demment par Searle etaL [25] pour le comp6titeurs. m R N A vitellog6nine de X6nope. Induction du RNA messager de la vitellogdnhle Cindtique d'induction du RNA messager de la Un groupe de 15 truites males de 200 g environ vitellogdnine a 6t6 divis6 en 2 lots : le premier lot a requ par 15 truites males de 200 g environ re~:oivent une voie intrap6riton6ale une solution saline d'oestra- seule dose d'cestradiol-1713 (Protocole II) dans les diol-t7~ A raison de 0,5 mg/kg de poids, le second mfimes conditions que pr6c6demment. Les ani- recevant uniquement le solvant. Le m~me proto- maux sont ensuite sacrifi6s en fonction du temps. cole a 6t6 r6p6t6 t o u s l e s 2 jours pendant 5 jours 10 lag de RNA total de chaque 6chantiilon sont et les animaux ont 6t6 sacrifi6s le septi6me jour d6pos6s sur les fiitres et soumis ~ hybridation (protocole I). Les injections r6p6t6es permettent avec la sonde sp6cifique. d'obtenir un pourcentage important de RNA messager sp6cifique. La Figure 6 montre que l'induction du RNA messager vitellog6nine se produit apr6s un temps La Figure 5 repr6sente les r6sultats de l'hybri- de latence de 5 h et que le taux de RNA est dation des RNA poly A + extraits des foies de maximum 48 h apr6s la stimulation. Cette quan- 2 lots d'animaux et montre que uniquement les tit6 reste alors constante pendant 5 ~ 6jours. RNA poly A + purifi6s ~ partir du groupe d'ani- 15 jours apr~s rinjection, le taux de messager a maux stimul6s sont capables de s'hybrider pro- d6jh tr~s nettement diminu6 : il ne reste plus que portionneilement ~t la quantit6 de RNA d6pos6e 10 % de la quantit6 maximum induite. sur les filtres. Des estimations semi-quantitatives apr6s 61ectrophor~se sur agarose 1,2 % ou hybri- dation en phase liquide nous avaient montr6 que Ddtermination quantitative de la vitellogdnine La Figure 7 repr6sente une courbe standard de quantification de la vitellog6nine par immuno6- (3_ 2000/ /i ./potg A" E, 2000, or. 1000 / x/.o o ~ o_ pol,j A IZ + 10 20 30 t,O 50 S 10 ng poIy A+ 10 50 100 1~0/I 1~ '16 J FiG. 5. - - Hybridation des RNA poly A ÷ de truites males heures JOUrS stitnuldes gl l'aestradiol et contr6le (Proto¢ole l). Des quantitfs croissantes de RNA poly A* 6nt 6t6 d~pos6es FIG. 6. - - Cin6tique d'apparition du RNA messager de la (10 ~t 50 rig) sur des carr6s de papier Whatman 5~,0 ac,tiv~s vitellog~nhze aprEs stimulation ~ I'a'stradiol-17fl. l'amino-thio-ph6nol et diazot6s. AprEs hybridation avec une Un lot de 15 truites males de 200 g environ a ~t6 stimul6 sonde marqu6e au tritium, les disqtw~s sont brfalEs dans up par injection intrap6riton6ale d'une solution d'oestradiol-171~ ~ auto-oxidizer, (Packard Tricarb module 306) et la radioacti- raison de 0,5 mg/kg de poids (Protocole II). Les animaux ont vit6 d&ermin6e par scintillation liquide dans un compteur (5t6 sacrifi6s fi des temps variables. 10 p.g de RNA total ont 6t6 Isocap 300 (Nuclear Chicago). d6pos('s sur les fihres et la radioactivit(~ correspondant ( - • - ) KNA poly A+ d'animaux stimul,~s. l'hybridation d&ermin6e comme pr6c6demment. L'encadr6 ( - t ~ - ) RNA polkA* d'animaux t6moins. correspond aux temps brefs de stimulation.
  7. 7. Expression du gdne de la vitellogdnine de la truite 221 i~o 3~ ng Vg FIG. 7. -- Gamme d~talomlage de la vitellog~nine. Des quantit~s croissantes de vitellog6nine de 34 ~ 408 ng ont ~t6 d6pos6es darts les puits du gel d'agarose ~t 0,1% contenant i'anticorps antivitellog6nine dilu6 au 1/400'. La migration s'effectue sous 2,3 mvolts/cm pendant 18 h. Apr~s s6chage et coloration des plaques, les pics d'immuno-pr6cipitation sont mesur~s et la hauteur en mm est report6e en fonction de la quantit6 de Vg exprim6e en ng. lectrophor6se. Des quantit6s croissantes de vitel- diminution r6guli~re du taux d'eestradiol pendant log6nine purifi6e (30 h 400 ng) sont d6pos6es dans une p6riode de 25 jours. Chez la truite B (Fig. 8B) les puits et soumises :~ r61ectrophor6se en pr6- la concentration en cestradiol retrouv6e dans le sence d'anticorps. La photographie prise apr~s s6rum est tr6s faible. La seule mesure positive a coloration des pics d'immunopr6cipitation mon- 6t6 r6alis6e au lendemain de l'injection. La tre que la hauteur des pics (exprim6e en mm) est concentration en E2 6tait alors de I ng/ml. Cette directement proportionnelle ~ la quantit6 de concentration est inf6rieure h celle de truite vitellog6nine d6pos6e. La limite inf6rieure du femelle en pr6vitellog6n~se [24]. Les cin6tiques dosage dans le s6rum de truite est de 10 pg/ml. d'apparition de la vitellog6nine chez les 2 ani- maux sont quantitativement tr6s diff6rentes. Chez Cindtique d'induction de la vitellogdnine la truite A (Fig. 8A) la vitellog6nine est d6tectable dans le s6rum apr6s 24 h de stimulation et la La stimulation a 6t6 effectu6e sur des animaux concentration augmehte r6guli~rement pour at- d'un poids voisin de 1 kg dans le but de faire des teindre un plateau au 15ejour. La vitellog6nine pr61+vements de sang assez fr6quemment (truite A repr6sente alors plus de la moiti6 des prot6ines 1,2 kg - - truite B 0,8 kg). Le 1713-¢estradiol a 6t6 totales. On peut 6galement observer que ce dissous dans le beurre de cacao ~ 40°C et inject6 plateau est stable au moins jusqu'au 25e jour, bien par voie intrap6riton6ale de faqon h produire un que la concentration en eestradiol dans le s6rum implant apr6s solidification du beurre de cacao soit consid6rablement r6duite. Chez la truite B (truite A : 3 mg d'eestradiol pour I ml de beurre (Fig. 8B) la concentration en vitellog6nine du de cacao - - truite B • 0,05 mg'pour 1 mr de beurre s6rum est tr6s basse, le maximum 6tant environ de cacao). La concentration du s6rum en eestra- 500fois plus faible que chez la truiteA. La diol a 6t6 mesur6e par Radio Imrriuno Assay- technique d'immuno-6lectrophor6se utilis6e nous (R.I.A.) [24]. La Figure 8A montre que l'appari- permet n6anmoins de suivre la cin6tique d'appari- tion d'E2 dans le s6rum est rapide chez4a truite A tion de la vitellog6nine avec precision et montre et que sa concentration est du m6me ordre de que des concentrations d'cestradiol de l'ordre du grandeur que celle retrouv6e chez les femelles en ng/ml de s6rum sont suffisantes pour induire la vitellog6n~se ( > h 10 ng/ml) [24]. On observe une synth6se de la prot6ine.
  8. 8. 222 Jean-Louis Maitre and coiL × ILl O 50. /p, I b jours Aiiii,, + + +~. +i;"~~ o~°" o ,50 ~% 0 / • 30 30 '-:--z...o ~ 0~,~, 0 10 10 A s 10 1'5 2'o jours 'S I=: X ' l.IJ = o A A "L jours =, 1~ 10 @ ,@ 4 . 2 0 200 2 i 14 /'i i o ./.f 00 B Lx - . 1'0 1'5 2"0 jours FIG. 8. - - Cin~tiques d'apparition de la ritellog~nine dans le ~drztnl de tndte mdzle aprds administration de 17fl-~rstradioL Le taux de v i t e l l o g 6 n i n e d a n s le s6,tum a 6t6 d 6 t e r m i n 6 p a r i m m u n o - ~ l e c t r o p h o r ~ s e en u t i l i s a n t de la v i t e l l o g 6 n i n e p u r i f i 6 e c o m m e 6talon (voir Fig. 6). Diff6rentes d i l u t i o n s de s 6 r u m o n t 6t6 utilis6es. - - o - - eestradiol. - o - vitellog6nine. 7 A : S t i m u l a t i o n avec u n i m p l a n t d'eestradiol de 3 ~ n g / m t . fi, ux j o u r s de s t i m u l a t i o n indiqu6s, les d i l u t i o n s s u i v a n t e s d u s 6 r u m o n t 6t6 effectu6es p o u r le d o s a g e : 0, !, 2 ( 1 / 4 ) - - 3 (1/10) - - 4 (1/20) - - 6 ( i / 5 0 ) - - 8, 10 ( 1 / 1 0 0 ) - - 13 .h 24 ( ! / 2 0 0 ) . 7B • S t i m u l a t i o n a v e c u n i m p l a n t d'cestradiol de 0,05 m g / m l . T o u s l e s s 6 r u m s o n t ~t6 d i l u 6 s a u 1/2 a v a n t dosage.
  9. 9. Expression du gdne de la vitellogdnine de la truite 223 Discussion canicula [36], chez raiguillat commun, Squalus acanthius [37]. Ces auteurs la d6crivent comme Nos r6sultats apportent la preuve de la pr6- une prot6ine liant les st6ro'fdes h I8 (androg~nes), sence de r6cepteurs de l'cestradiol dans le foie de 19 (cestrog6nes), 21 (corticost6roYdes et progest6- truite mille dans des conditions (incubation du rone) atomes de carbone avec une haute affinit6. cytosol fi 0°C) off rhormone n'est pas m6taboli- Chez la truite, Salmo gairdnerii, Fostier et Breton s6e. [38] ont aussi d6cdt la pr6sence de prot6ines plasmatiques liant les st6roides sexuels et les Des sites de liaison de haute affinit6 corticost6ro'ides. (KD ~ 1,5 × 10-9M) ont 6t6 mis en 6vidence dans La sp6cificit6 6troite des sites de liaison pour le cytosol brut et dans des pr6parations de r6- les seuls cestrog6nes (comp6tition tr6s faible avec cepteurs partiellement purifi6s par pr6cipitation la 5ct-DHT, aucune comp6tition avee le 31]-diol, par (NH4)2SO4 ~ 30 % de saturation. Une h6t6ro- la progest6rone et la dexam6thasone) semble g6n6it6 des sites de liaison a parfois 6t6 not6e devoir 6carter l'id6e que ces sites seraient dus fi dans le cytosol brut. Les repr6sentations de une contamination par des prot6ines plasmati- Scatchard se r6solvent alors en 2 droites, indi- ques dont la sp6cificit6 est au contraire tr6s large. quant la pr6sence d'au moins 2 types de sites de liaison. La signification de ce deuxi6me type de En utilisant des pr6parations d'h6patoeytes site n'est pas facile b. d6finir. I1 pourrait s'agir fraichement isol6s par perfusion du foie b. la d'une prot6ine <<unusuelle >~ liant les st6ro~'des collag6nase, nous avons pu montrer que les sexuels, comme celle d6crite par Dickson etal. caract6ristiques des r6cepteurs de E2 6taient [26] dans le foie de rat mille, voire de prot6ine identiques h celles du foie ( K v - 1,5x 10-9M) plasmatique. I1 ne faut pas perdre de vue que le (r6sultats non publi6s). Nous tentons maintenant foie est le site de synth6se de prot6ines plasma- de d6montrer que les caract6ristiques des r6cep- tiques et que le taux de synth6se est susceptible teurs sont aussi conserv6es dans des h6patocytes de varier en fonction de l'&at physiologique de isol6s maintenus en culture primaire et que dans ranimal. Les pr6parations de cytosol utilis6es ne ces conditions o6 le taux d'E2 est bien contr616, provenant pas d'animaux dans le m6me 6tat il existe une corr61ation 6troite entre le nombre de physiologique (fige diff6rent, animaux spermiant sites de liaison occup6s, le taux du RNA messager ou non), on peut penser qu'il y a lh une expli- de la vitellog6nine et le taux de vitellog6nine cation h la variation du taux de ce second synth6tis6e. composant. Quand le cytosol ne contient qu'un La pr6sence de RNA messager sp6cifique de seul composant de haute affinit6, la constante de la vitellog6nine n'a pu ~tre mise en 6vidence chez dissociation mesur6e est identique ~ celle mesur6e la truite mille qu'apr6s stimulation ~ l'cestradiol. dans la fraction AS 30 % (KD ~ 1,5 x 10-9M). Chez les animaux t6moins, m~me en augmentant La sp6cificit6 de la liaison hormonale est tr6s les quantit6s du RNA poly A ÷ de 5 ~ 50 ng, nous 6troite puisque seuls les cestrog6nes E2, DES, E~ n'avons jamais pu obtenir d'hybridation mol6cu- et E3 (r6sultats non repr6sent6s) sont comp6titifs. laire avec la sonde sp6cifique. Ce r6sultat conso- Contrairement fi ce qui a 6t6 observ6 dans d'au- lide les observations pr6c6dentes [19, 14]. La truite tres syst~mes : foie de mammif6re [27, 28], hypo- arc-en-ciel peut done 6galement constituer un physe ant6fieure de mammif~re [29,30], foie de excellent mod61e pour l'6tude de la r6gulation de poisson [31, 32], l'affinit6 relative du DES est ici l'expression des g6nes sous contr61e hormonal. en moyenne 3 ~ 7 fois plus faible que celle de E2. En effet, l'oestradiol active un g6ne normalement Le DES est un compos6 de synth6se qui ne se lie silencieux chez le mille, ce qui est assez inhabituel pas ou avee une faible affinit6 h la t< sex hormone dans la plupart des mod61es 6tudi6s actuellement. binding globulin >>(SHBG) [33]. On pourrait done Nous montrons 6galement que la cin6tique d'in- s'interroger sur la signification de raffinit6 plus duction, comme chez d'autres esp~ces : X6nope, faible du DES pour les sites de liaison de E2 dans poulet [39, 40], ne d6marre qu'apr/~s un temps de le cytosol de foie de truite. Ces sites de liaison de latence de 4 ~ 5 h (encadr6 Fig. 6). Ce temps de haute affinit6 sont-ils caract6ristiques des r6cep- latence, plus ou moins long suivant les esp6ces, teurs sp6cifiques ou seraient-ils dus fi une conta- pourrait 6tre dO h la synthi~se de r6cepteurs mination par la SHBG ? Cette derni~re nypoth6se sp6cifiques qui persisteraient h un niveau 61ev6, parait cependant peu vraisemblable. En effet, la m~me apr6s disparition de l'cestradiol inject6 SHBG a 6galement 6t6 d6crite chez la raie, Raja [41, 42]. radiata [34,35], chez la roussette Scyliorhinus En ce qui concerne les cin6tiques d'apparition
  10. 10. 224 Jean-Louis Maitre and coll. de la vitellog6nine, les implants d'cestradiol utili- 2. Gruber, M., Bos, E.S. & Ab, G. (1976) Mol. Cell. s6s d61ivrent dans le s6rum des taux d'hormone Endocrinol,, 5, 41-50. comparables/l ceux retrouv~s chez la femelle au 3. Tata, J.R. & Smith, D.F. (1979) Recent Progress in cours du cycle normal. On peut ainsi montrer que Hormone Research, 35, 47-90. 4. Wahli, W., Dawid, I.B., Ryffel, G.U. & Weber, R. des concentrations d'cestradiol aussi faibles que (1981) Science, 212, 298-304. 1 ng/ml de s6rum sont capables d'induire la 5. Campbell, C.M. & Idler, D.R. (1976) Gen. Comp. synth~se de vitellog6nine chez le mille, et on peut Endocrinol,, 28, 143-150. se demander si, chez la femelle, la synth6se de 6. Elliot, J.A.K., Bromage, N.R. & Whitehead, C. vitellog6nine ne commence pas plus t6t qu'on ne (1979) .L Endocrinol., 83, 54-55. le pense au cours du cycle annuel. 7. Emmersen, B.K. & Petersen, I.M. (1976) Comp. Ces exp6riences pr61iminaires avaient surtout Biochem. Physiol., 54B, 443-446. 8. Le Menn, F. (1979) Comp. Gen. Biochem. Physiol., pour but de preparer l'arsenal technologique 62A, 495-500. n~cessaire ~ l'6tude de rexpression g~n~tique de 9. Yu, J.Y.L., Dickhoff, W.W., Swanson, P. & Gorb- Ia vitellog6nine chez la truite arc-en-ciel. Nous man, A. (1981) Gen. and Comp. Endocrinol,, 43, envisageons maintenant d'aborder des probl~mes 492-502. plus physiologiques. In vivo l'6tude compar6e des I0. Hara, A. & Hirai, H. (1978) Comp. Biochem. cin6tiques de vitellog6n6se (r6cepteurs, RNA Physiol., 59B, 339-343. messager, vitellog6nine), chez les 3 souches de 11. Van Bohemen, Ch.G., Lambert, J.G.D., Goos, Salmo gairdnerii qui p o n d e n t / l des dates diff6ren- H.J.T. & Van Oordt, P.G.W.J. (1982a) Gen. and tes, devrait nous permettre de savoir si le d~- Comp. Endocrinol., 46, 81-92. clenchement du ph6nom6ne est synchrone avec 12. Van Bohemen, Ch.G., Lambert, J.G.D. & Van Oordt, P.G.W.J. (1982b) Gen. and Comp. Endocri- modulation ult6rieure de la vitesse de synth6se de nol,, 46, 136-139. vitellog6nine ou s i c e s d6clenchements sont d6- 13. Roach, A.H. & Davies, P.L. (1980) Biochimica cal6s dans le temps et les vitesses de synth6se Biophysica Acta, 610, 400-412. identiques. 14. Chen, T.T. (1983) Canad. Z of Biochem. and Cell Au cours du cycle normal, le d~clenchement de Biol,, 61, 802-810. la vitellog6n~se est li~ ~ I'616vation du taux 15. Petit, J. & Ferron, J.L. (1975) La Pisciculturefran- caise, 42, 18-23. d'cestradiol du s6rum [11, 12, 24]. Parall~lement, il 16. Auffray, Ch. & Rougeon, F. (1980) Fur. J. Biochem., apparait des taux d'eestrone importants. Le r61e 107, 303-314. de cette hormone dans la vitellog6n6se a 6t6 mis 17. Tenniswood, M. & Simpson, A.J.G. (1982) Parasito- en 6vidence par Van Bohemen [11, 12]. Nous logy, 27, 84-89. esp6rons obtenir des renseignements plus pr6cis 18. Aviv, M. & Leder, P. (1972) Proc. Natl. Acad. ScL sur son mode d'action en d6terminant son impact USA, 69, 1408-1412. dans les diff6rentes 6tapes de la r6gulation. 19. Valotaire, Y., Tenniswood, M., Le Guellec, C. & Enfin, ~ l'aide d'un syst6me d'h6patocytes Tata, J.R. (1984) Biochem. J'. 217, 73-77. 20. Mac Master, G.K. & Carmichael, G.C. (1977) Proc. isol6s que nous avons mis au point (r6sultats non Natl. Acad. ScL USA, 74, 4835-4838. publi6s), nous esp6rons pouvoir tester in vitro un 21. Seed, B. (1982) Nucleic Acids Res., 10, 1799. certain nombre de facteurs endog~nes (hormones) 22. Wahl, G.M., Stei'n, M. & Stark, G.R. (1979) Proc. et exog~nes (antibiotiques, herbicides, pesticides), Natl. Acad. ScL USA, 76, 3683-3687. pouvant avoir une influence sur la production de 23. Tenniswood, M., Bailey, D., Valotaire, ¥. & Tara, vitellog6nine. J.R. (juin 1983) Communication ~ Canadian Federation of Biological Society. 24. Breton, B., Fostier, A., Zohar, Y., Le Bail, P.Y. & Billard, R. (1983) Gen. Comp. Endocrinol., 49, Remerciement 220-231. 25. Searle, P.F. & Tata, J.R. (1981) Cell, 23, 741-746. Ndus remercions le Dt. Fostier (Laboratoire de Physio- 26. Dickson, R.B., Aten, R.F. & Eisenfeld, A.J. (1978) logie des Poissons, LN.R.A. Rennes)-pour les dosages Endocrinology, 103, 1636-1646. d'cestradiol, 27. Chamness, G.C., Costlow, M.E. & Me Guire, W.L. (1975) Steroids, 26, 363.371. 28. Duffy, M.G. & Duffy, G.J. (1978) J. Steroid Bio- chem., 9, 233-235. BIBLIOGRAPHIE 29. Thieulant, M.-L. & Pelletier, J. (1980) J. Steroid Biochem., 10, 677-687. I. Clemens, M.J. (1974) Prog. Biophys. Mol, Biol., 28, 30. Thieulant, M.-U, Samperez, S. & Jouan, P. (1981) 69-107. Endocrinology, 108, 1552-1560.
  11. 11. Expression du gone de la vitellogdnine de la truite 225 31. Le Menn, F., Rochefort, H. & Garcia, M. (1980) 37. Ho, S.M., Tsang, P. & Callard, I.P. (1980) Biol. Steroids, 35, 315-328. Reprod., 23, 281-289. 32. Turner, R.T., Dickhoff, W.W. & Gorbman, A. 38. Fostier, A. & Breton, B. (1975) J. Steroid Biochem., (1981) Gen. Comp. Endocrinol., 45, 26-29. 6, 345-351. 33. Raynaud, J.P., Mercier-Bodard, C. & Baulieu, E.E. 39. Ryffel, G.U. (1978) Mol. and Cell. Endocrinol., 12, (1972) Steroids, 18, 767-788. 237-246. 34. Freeman, H.C. & Idler, D.R. (1969) Gen. Comp. 40. Westley, B. (1979) Differentiation, 15, 67-72. Endocrinol., 13, 83-91. 41. Westley, B. & Knowland, J. (1979) Biochem. Bio- 35. Idler, D.R. & Freeman, H.C. (1969) Gen. Comp. phys. Res. Commun., 88, 1167-I 172. Endocrinol., 13, 75-82. 42. Wright, Ch.V.E., Wright, S.C. & Knowland, J. 36. Martin, B. (1975) Gen. Comp. Endocrinol., 25, 42-51. (1983) E.M.B.O.J., 2, 973-977.

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