1.
U NA M F E S C UAU T I T L Á N
M I C R O B I O L O G Í A FA R M A C É U T I C A
M A N UA L D E P R ÁC T I C A S
A LU M N O : _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
G R U P O _ _ _ _ _ _ _ _
2. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
REGLAMENTO GENERAL
PARA LOS LABORATORIOS
CODIGO: DOC-CB-DEX-
01-00
No
de REVISIÓN: 0
1) Este reglamento aplicará para personal académico, alumnos y laboratoristas.
2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deberá utilizarse bata blanca con manga
larga.
3) La tolerancia para el inicio de la sesión de laboratorio será hasta de 10 minutos a
partir de la hora señalada.
4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las
prácticas.
5) En todo momento deberá mostrarse una conducta adecuada en el área de trabajo.
6) Queda prohibido en los laboratorios:
a) Tirar basura fuera del cesto.
b) Ingerir alimentos y/o bebidas.
c) Fumar.
d) Recibir visitas.
e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos.
f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios.
g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesión experimental.
h) Sentarse sobre las mesas de trabajo.
i) Mover el mobiliario de su lugar.
j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura.
7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal
fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos
o mezclas de ellos que en cualquier estado físico representan un riesgo para el
ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus características corrosivas,
reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o biológico-infecciosas (Art. 3º de la Ley
General del Equilibrio y Protección del Ambiente).
8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de teléfonos celulares, reproductores de
sonido o cualquier medio electrónico de entretenimiento. El uso de las
computadoras portátiles queda restringido a temáticas relacionadas con la
asignatura.
9) El acceso al laboratorio se permitirá únicamente cuando esté presente un profesor.
3. 10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deberá programarse con el
profesor responsable en un horario que no interfiera con aquel destinado para el
desarrollo de las prácticas.
11) Para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene
debidamente el vale de material (FPE-CB-DEX-01-09) y lo entregue a la persona
responsable, dejando como depósito la credencial vigente de la UNAM.
12) El alumno deberá revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando
cualquier anomalía (faltante o material dañado) y será devuelto en las condiciones
en que se recibió, de no hacerlo, se hará acreedor a las sanciones establecidas en
cada laboratorio.
13) Es obligación de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el
laboratorio.
4. Práctica No. 1
CONTROL DE CALIDAD
Y NORMAS DE BIOSEGURIDAD
1 INTRODUCCIÓN
El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la
confiabilidad de la información que proporciona el laboratorio sobre los productos que
examina o produce.
El objetivo de cumplir con este parámetro es obtener la calidad óptima en todos los
procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo posible.
Es necesario iniciar el desarrollo de un diseño general del Laboratorio, en donde la
planificación, la remodelación o la ampliación deben estar a cargo de un Comité en el que
participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros
profesionales del mismo.
El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios específicos,
programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal
previsto. Como áreas secundarias se consideran corredores, salas de máquinas,
escaleras, etc.
La industria farmacéutica establece un conjunto de actividades necesarias para asegurar
que los productos terminados cumplan con la calidad requerida debido a que los
medicamentos tienen la finalidad de dar un beneficio al individuo que lo consuma que es
la salud. Para que un medicamento pueda llegar al consumidor tiene que pasar por varias
actividades de calidad lo que garantiza que durante el proceso de fabricación,
acondicionamiento y distribución mantiene la identidad, pureza, concentración, potencia e
inocuidad requeridos para su empleo, que no se encuentren contaminados o alterados y
no representen un riesgo para la salud
El aseguramiento de la calidad es la recopilación de la experiencia en el manejo de la
calidad, que se ha normalizado internacionalmente. Es necesario conocer dos
documentos normativos que son básicos para el correcto desempeño de este sistema:
Good Manufacturing Practices (GMP) o Buenas Prácticas de Manufactura y la Norma
ISO 9000
5. 1.1 GMP’S O BUENAS PRÁCTICAS DE MANUFACTURA
En la producción de fármacos es necesario tener extremo cuidado, siguiendo los
principios normativos de las GMP’s, independientemente si los productos van a ser
estériles o no.
Este sistema de GMP’s fue elaborado en los Estados Unidos por la agencia de Salud:
Federal Drugs Administration (FDA por sus siglas en inglés) por medio del Código
Federal de Regulaciones (CFR) y se encuentra en el Registro Federal por los
departamentos ejecutivos y agencias del gobierno federal estadounidense. La cual
está dividida en 50 títulos y cada uno está dividido en partes y subpartes. La parte
aplicada a la industria farmacéutica es la 211, subpartes B a la K.
Los laboratorios de la Industria Farmacéutica controlan la calidad microbiológica de
las materias primas, la eficacia de los procesos de tratamiento, los puntos críticos de
la producción y la calidad del producto final, por ende las BMP’s tienen como objetivo
la implantación de programas de calidad en las actividades que realizan ya que los
resultados incorrectos pueden tener una gran repercusión económica y sobre la salud
pública.
1.2 NORMAS ISO (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR
STANDARDIZATION)
Son una serie de estándares (conocidas en EE.UU. como series ANSI/ASQC Q90-Q94).
Primariamente percibido para ayudar a armonizar un gran número de estándares
nacionales e internacionales, integrado por una delegación mundial conocida como
ISO/Technical Comité 176, conformada por las siguientes agencias AFNOR (Association
Francaise de Normalisation), ANSI (American National Standard Institute), BSI (British
Standard Institute), NNI (Nederlans Normalisate Institut) y SSC (Standard Council of
Canada), entre otras.
La serie ISO 9000 consiste de 5 documentos: tres son básicos de los modelos de
aseguramiento de la calidad: 9001, 9002 y 9003; y dos soportan documentos guías:
9000 y 9004. El título claramente indica su propósito:
6. 1.2.1 ISO 9000. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y NORMAS DE
ASEGURAMIENTO DE CALIDAD. Guía para selección y uso.
1.2.2 ISO 9001. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad en
diseño, producción, instalación y servicio.
1.2.3 ISO 9002. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para el aseguramiento de calidad
aplicable a la fabricación e instalación.
1.2.4 ISO 9003. SISTEMAS DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad
en inspección final y prueba.
1.2.5 ISO 9004. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y ELEMENTOS DE LOS
SITEMAS DE CALIDAD-GUIAS.
1.2.6 CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la
confiabilidad de la información que proporciona el laboratorio sobre los productos que
examina o produce.
El objetivo de cumplir con este parámetro es obtener la calidad óptima en todos los
procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo
posible.
Es necesario iniciar el desarrollo de un diseño general del Laboratorio, en donde la
planificación, la remodelación o la ampliación deben estar a cargo de un Comité en el que
participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros
profesionales del mismo.
El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios específicos,
programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal
previsto. Como áreas secundarias se consideran corredores, salas de máquinas,
escaleras, etc.
El Laboratorio debe disponer de:
• Instalaciones con capacidad de producción de servicios conforme a las
necesidades (volumen, calidad y oportunidad).
• Elementos para la protección del personal, de las instalaciones y del equipo
• Medios para el control de la emisión de contaminantes al medio ambiente.
• Costos de operación razonables para su funcionamiento
7. 1.2.7 Requerimientos básicos de un laboratorio
1.2.8 Ubicación y construcción.
La ubicación del Laboratorio de Microbiología debe ubicarse lejos de áreas o instalaciones
que puedan interferir en el resultado de los análisis o permitir por su proximidad
contaminaciones químicas o biológicas. Las áreas de apoyo (lavado de material y
esterilización) deben estar cerca del área analítica para facilitar el flujo de operación.
El área de preparación de muestras debe estar aislada para evitar contaminaciones
cruzadas que pueden tener efecto sobre la integridad de la muestra y por consiguiente
sobre el resultado del análisis
En cuanto a las características de construcción del Laboratorio, se deben emplear
materiales de construcción no inflamables, resistentes a la corrosión y de fácil limpieza, de
superficies lisas para disminuir la posibilidad de acumulación de desechos o
microorganismos.
Los techos, paredes y suelos deben ser lisos y fáciles de lavar, impermeables a los
líquidos y resistentes a la acción de las sustancias químicas, solventes y productos
desinfectantes utilizados de ordinario en el laboratorio.
El color de los techos y paredes debe ser de tonos claros mate que permitan una
difusión homogénea de la luz, evitando reflejos perjudiciales. No debe emplearse
pintura iónica para evitar la disolución de moléculas gaseosas en el ambiente
Las puertas y ventanas pueden ser de madera o metálicas y deben abrir hacia afuera, las
metálicas son las más empleadas por su calidad y resistencia. Las más utilizadas son las
de aluminio por no requerir pintura y por mantener su apariencia permeable.
Si el laboratorio tiene aire acondicionado; las ventanas deberán ser fijas de cierre absoluto
y tener como única misión el permitir la entrada de la luz natural
1.2.9 Instalaciones Eléctricas
En cuanto a las instalaciones eléctricas se debe contar con un suministro de energía
eléctrica suficiente, estable, libre de fluctuaciones y aislada convenientemente. La
carga eléctrica se debe determinar tomando en cuenta los aparatos eléctricos y
electrónicos de que dispone el laboratorio; las líneas de distribución de corriente
deben de estar diseñadas para alimentar los equipos en cada área sin sufrir
sobrecarga. El voltaje se estabiliza, por medio de un regulador central con líneas de
distribución de corriente estabilizada para las áreas que lo requieren, o por unidad,
con un regulador de voltaje para cada aparato.
1.2.10 Tuberías
Es conveniente señalar o pintar con colores reglamentarios las tuberías.
8. • La instalación de gas, se pueden utilizar gas natural o licuado. Se debe construir
en tubería de cobre asegurando la total ausencia de fugas en las juntas y debe de
llevar el color reglamentado que es amarillo.
• Las instalaciones de aire comprimido, ésta es una disposición como servicio
común en los laboratorios, se prefiere situarlo a través de una red que puede ser
construida en tubería de hierro o cobre, operada a presión del orden de 5 Kg/cm2
alimentado por un compresor localizado en la sala de máquinas, y la tubería debe
de ser de color azul.
• Las condiciones ambientales en el laboratorio se deben prestar atención a los
niveles de iluminación, de ventilación, de temperatura y de humedad para el
bienestar de los trabajadores, así como el control de vibraciones y ruidos que
puedan afectar considerablemente las operaciones analíticas.
1.2.11 Aire.
El aire de los recintos recargados por gases de combustión, placas calientes, así como
emanaciones de productos químicos o ácidos exigen una renovación periódica del
ambiente. La ventilación puede llevarse a cabo en forma natural o por medio de sistemas
mecánicos; se recomienda una renovación del aire de 6 a 10 veces por hora para
mantener el ambiente inocuo y cómodo. Es aconsejable prever una instalación mecánica
de ventilación que introduzca aire del exterior y expulse el aire viciado sin recirculación; el
aire del recinto debe estar libre de polvo y microorganismos, la velocidad de entrada y
salida se debe mantener baja y no debe provocar corrientes. La calidad del aire se debe
controlar periódicamente a nivel microbiológico (Ver Práctica 2)
1.2.12 Temperatura
La temperatura ambiente deberá mantenerse entre 20 y 23 °C y la humedad relativa
del aire debe ser aproximadamente de 50% con una tolerancia del 5% ya que valores
fuera de estos límites pueden deteriorar los medios de cultivo y producir errores en
algunas pruebas de laboratorio. Deben contar con aire acondicionado y no se debe
apagar al finalizar las horas de trabajo ni durante los fines de semana, ya que las
operaciones se ven seriamente afectadas por las variaciones bruscas de temperatura
ambiente.
1.2.13 Limpieza
La limpieza se debe hacer diariamente en todas las áreas, después de la jornada de
trabajo. Se ha demostrado que 90% de la posible contaminación del aire y otras fuentes
se depositan en las superficies horizontales. La contaminación microbiana proviene
directa o indirectamente de las personas, del aire de ventilación o del ambiente exterior,
de las superficies, de los equipos y materiales. El objetivo principal de la limpieza es
eliminar la contaminación microbiana y la suciedad de las superficies; para lo cual, se
debe restregar o friccionar lo suficiente.
9. Al igual que los productos, los métodos de limpieza pasan por una fase de desarrollo para
asegurar que son eficaces para usarse en la producción. Deben desarrollarse PNO
(Procedimiento Normal de Operación) de limpieza, y el personal debe seguirlos con
diligencia. El uso de un protocolo de limpieza puede ayudar a rastrear cambios en el
proceso de limpieza. Las operaciones de limpieza, las observaciones, los cambios en el
procedimiento, los resultados de pruebas y las recomendaciones pueden documentarse
en esos protocolos
1.2.14 Campanas de flujo laminar
En las campanas de flujo laminar se debe verificar a intervalos mensuales la velocidad
del flujo de aire requerido midiendo la presión a ambos lados de los filtros; estos se
deben reemplazar cada 6 meses.
1.2.15 Autoclaves
Es una cámara de presión que se usa para esterilizar utensilios, material de
laboratorio, medios de cultivo, cepas microbianas, etc. Debe ser considerado
potencialmente peligroso, cuando el aire ha sido expulsado y la cámara se ha llenado
con vapor saturado, existe una relación entre la temperatura y la presión. Se debe
verificar el correcto estado de la válvula de seguridad, cuando comienza a salir el
vapor de la espita por lo cual el equipo debe:
• Ser confiable
• Ser seguro (temperaturas de +/- 1.0 °C)
• Dar un tiempo se respuesta
• Las pruebas de distribución del calor deben ser conducidas con el número
adecuado de termopares.
• Las pruebas se deben hacer con esporas biológicas.
1.3 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
FARMACEUTICA
Los fundamentos de seguridad son constantes y una vez que han sido aprendidos
gobiernan, en cierta forma, automáticamente los actos del trabajador cuidadoso.
Todos los establecimientos de enseñanza deben incluir en sus programas de
formación un programa específico de entrenamiento en métodos de seguridad. Un
defecto y que conduce con más frecuencia a los accidentes de laboratorio es el
intento de obtener resultados con demasiadas prisas. Ningún Laboratorio debería de
carecer de un código de reglas y medidas de seguridad.
10. 1.3.1 Bioseguridad
La seguridad en el manejo de los objetos del laboratorio así como de la protección del
personal es un componente esencial en la práctica moderna del Laboratorio. La
Bioseguridad del Laboratorio incumbe a todo el personal; por tanto, cada empleado
debe comunicar a sus superiores cualquier acto o condición que atente contra ella. Se
deben realizar algunas actividades como:
• Redactar un manual de Bioseguridad y de operaciones en el que se
identifiquen los riesgos reales o potenciales y se indiquen las prácticas o
procedimientos adecuados para reducir al mínimo o eliminar tales riesgos
especiales.
• Cerciorarse de que todos los miembros del personal han recibido la instrucción
necesaria acerca de los riesgos de infección.
• Estar seguro de que se apliquen métodos de descontaminación en caso de
derrame, o ruptura de recipientes de material contaminado.
1.3.2 Criterios del Nivel de Bioseguridad de los laboratorios
Conjunto de normas que han de cumplir los laboratorios en los que se manipulan
microorganismos infecciosos, muestras de tejidos humanos o animales de laboratorio.
Definen las combinaciones de: equipos de protección (barreras primarias), instalaciones
del laboratorio (barreras secundarias) y de contención del edificio (barreras terciarias),
más adecuadas para la manipulación de los agentes biológicos de riesgo.
Se definen 4 niveles de bioseguridad:
Nivel 1- Manipulación de agentes que no producen enfermedad en adultos sanos.
Agentes biológicos bien caracterizados no causantes de enfermedades en adultos
y con un riesgo mínimo para el personal del laboratorio y el medio ambiente
Nivel 2- Agentes patógenos en el hombre (riesgo = daño percutáneo, ingestión,
mucosas).
Agentes biológicos del grupo 2 : aquel que puede causar una enfermedad en el
ser humano y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco
probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una
profilaxis o tratamiento eficaz.
Nivel 3- Agentes patógenos con potencial de transmisión por aerosol.
Agentes biológicos del grupo 3. aquel que puede causar una enfermedad grave
en el ser humano y presenta un serio peligro para los trabajadores con riesgo de
que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o
tratamiento eficaz
11. Nivel 4- Agentes peligrosos o patógenos con un alto riesgo de enfermedad, con
transmisión por aerosol o por medios desconocidos.
Agentes biológicos del grupo 4. Aquel que causando una enfermedad grave en
el ser humano supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas
probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista una profilaxis
o tratamiento eficaz.
Existe toda una gama de equipos de protección indicados según sea el nivel de
bioseguridad del laboratorio.
1.3.3 Saneamiento del medio
Existen reglas importantes que debe seguirse:
• Mantener ordenado y en buen estado de higiene el conjunto de los locales.
• Tener suficientes cubos para basura de un modelo aprobado (con tapa).
• Mantener todos los lugares cerrados, de manera que puedan entrar en ellos
roedores, insectos y otras plagas.
• Disponer de agua potable.
• Disponer de lavados apropiados, mantenidos en buenas condiciones de
higiene.
• Destinar el espacio suficiente para que el personal pueda comer.
• Deben existir vestidores separados para hombres y mujeres, con armarios
separados para ropa de calle y para ropa de protección.
1.3.4 REGLAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
FARMACEUTICA
• Los miembros del personal se deben lavar las manos después de haber
manipulado
• No permitir pipetear con la boca.
• Prohibir al personal comer, beber o fumar en la zona de trabajo del
Laboratorio.
• No aplicarse cosméticos.
• No guardar comida, ni bebidas en los refrigeradores del Laboratorio.
• Se debe mantener el Laboratorio limpio y aseado. Las superficies de trabajo de
descontaminarán al menos una vez al día, e inmediatamente en caso de
derrame de sustancias potencialmente peligrosas.
• Es necesario que todos los procedimientos técnicos se practiquen de manera
que se evite la posible formación de aerosoles.
• En el Laboratorio es necesario utilizar batas, uniformes u otras prendas
apropiadas; no se debe llevar ropa de laboratorio fuera de éste y se requiere
desinfectar las prendas contaminadas, mediante procedimientos apropiados.
• Autorizar el paso a la persona de trabajo del Laboratorio, sólo a las personas
que hayan sido informadas sobre los posibles riesgos y que satisfagan
12. cualquier requisito que se exija para entrar; durante el trabajo se deben
mantener cerradas las puertas del Laboratorio. Sólo tendrán acceso las
personas autorizadas.
• No permitir la entrada a niños en las zonas de trabajo del Laboratorio,
• No permitir la entrada de animales que no tengan relación con los trabajos que
se estén realizando.
• Utilizar guantes en todos los trabajos que entrañen un posible contacto
accidental con material infeccioso. Los guantes se deben quitar asépticamente
y esterilizar en autoclave con otros desechos de laboratorio antes de proceder
a su eliminación.
1.3.5 Colores de Seguridad
En un laboratorio las indicaciones de seguridad deben ser tomadas de forma seria, y el
personal debe estar capacitado para saber qué es lo que se está indicando en cada
momento. Para hacer más fácil el entendimiento y lograr que todas las medidas de
seguridad sean llevadas a cabo se han establecido colores de tono llamativo para usarse
en diferentes tipos de señalización. La tabla siguiente hacer referencia a cada uno de los
casos.
Rojo
Amarillo
Verde
Azul
1.3.6 Colores de seguridad para tuberías
Rojo
Amarillo
Verde
13. 1.3.7 Modelo de Rombo para sustancias usadas en un laboratorio
El esquema del sistema debe ser un rombo, cuya diagonal mayor debe ser perpendicular
al plano horizontal.
El rombo se debe dividir en cuatro secciones, como lo muestra la figura 1; con el siguiente
orden y color de fondo:
I. Riesgo a la salud, en color azul
II. Riesgo de inflamabilidad, en color rojo
III. Riesgo de reactividad, en color amarillo
IV. Riesgos especiales, en color blanco
Figura 1 Modelo de rombo de seguridad
Para identificar los riesgos especiales se debe:
• Usar las letras OXI para indicar la presencia de una sustancia oxidante;
• Usar el símbolo W para indicar que una sustancia puede tener una reacción
peligrosa al entrar en contacto con el agua;
• Opcionalmente usar las letras o símbolos del equipo de protección personal.
14. 1.3.8 CRITERIOS DE CLASIFICACION DE GRADOS DE RIESGO A LA SALUD
(MODELO ROMBO)
15. 1.4 OBJETIVO GENERAL
• Conocer las Normas Oficiales Mexicanas (NOM’s) que se aplican en el
Laboratorio de Microbiología Farmacéutica mediante el control de calidad para
evitar riesgos y garantizar la integridad del personal y de las instalaciones.
1.5 OBJETIVOS PARTICULARES
• Identificar los puntos críticos que puedan ser fuente de contaminación en el
Laboratorio de Microbiología Farmacéutica de la FESC, que puedan interferir
en los resultados mediante la elaboración de productos farmacéuticos.
• Designar la clasificación de los reactivos y materias primas de acuerdo a lo
establecido en la Norma Oficial Mexicana 018 del Código SIMAR
• Proponer la construcción de un Laboratorio de Microbiología Farmacéutica, de
acuerdo al diseño estipulado en las NOM’s.
16. 1.6 ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE
1.6.1 Realizar la clasificación de los siguientes reactivos con el modelo del rombo.
a) Hidróxido de Potasio
b) Peróxido de Hidrógeno
c) Cloruro de sodio
d) Cristal Violeta
e) Lugol
f) Safranina
g) Alcohol 90%
h) Acetona
1.6.2 Ubicar la tubería del Laboratorio de Microbiología y de acuerdo a los fluidos
que conducen dichas tuberías realizar un reporte de acuerdo a lo establecido
en la NOM-026-STPS1-19941
.
1.6.3 Realizar una inspección en el Laboratorio de Microbiología y establecer si
cumple con las normas de seguridad en cuanto a los señalamientos de
prohibición, obligación, precaución, de equipo contra incendio, salidas de
emergencia y primeros auxilios de acuerdo a la NOM-026-STPS1-19941
.
1.6.4 Determinar el equipo de protección personal que se necesita en el
Laboratorio de Microbiología de la FES Cuautitlán.
1.6.5 Realizar una inspección y evaluar si el Laboratorio de Microbiología cumple
con los requerimientos de construcción establecido por las NOM’s.
1
El alumno debe investigar NOM-026-STPS1-1994
19. 1.7.4 Equipo de protección personal
1.7.5 Actividad Extra:
Indica en la tabla el nivel de Bioseguridad del Microorganismo descrito.
Microorganismo
Nivel de
Bioseguridad
B. subtilis
Clostridium botulinum
Candida albicans
E. Coli
S. Typhi
Virus del Ébola
Virus de la Fiebre de Lassa
B. antracis
Virus Hepatitis C
Virus de HIV
21. 1.10 BIBLIOGRAFÍA
• ÁLVAREZ, Ma. del Rocío. Tesis “Manual de Introducción al Control de Calidad en el
Laboratorio de Microbiología”. Universidad Femenina de México. Escuela de Q.F.B.
2001
• CFR, Parte 211. “Current Good Manufacturing Practice For Finished
Pharmaceuticals”. FDA, EE.UU, 1992
• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-017-STPS-2000. Equipo de Protección
Personal.
• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-018-STPS-2000. Sistema para la identificación y
Comunicación de Peligros y Riesgos por Sustancias Químicas Peligrosas en los
Centros de Trabajo.
• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-026-STPS1-1998. Colores de Seguridad e
Higiene.
• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prácticas de
Fabricación para establecimientos de la Industria Químico-Farmacéutica
dedicados a la Fabricación de Medicamentos
1.11 Referencias Electrónicas
• www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/biosfty.htm
22. Práctica No. 2
MONITOREO AMBIENTAL
2.1 INTRODUCCION
Las condiciones del medio ambiente, en las diferentes áreas de producción y
del Laboratorio de Microbiología, tienen un impacto en la calidad de los
productos y de las pruebas que se realizan. Debido a que el aire, la
infraestructura, los equipos y el mismo personal pueden volverse fuentes de
contaminación, es necesario crear un Programa de Monitoreo Ambiental que
permita mantener los diferentes contaminantes ambientales dentro de los
límites máximos permitidos, que marca la NOM-059, con el fin de que dichos
laboratorios operen adecuadamente.
Podemos definir el monitoreo ambiental como la medición u observación
programada que debe realizarse en los diversos puntos de un área ya que son
elementos esenciales de un programa de control que proporciona datos para
identificar los factores que contribuyen en los procesos de contaminación y una
vez identificado el problema instituir medidas apropiadas y evaluar su eficacia.
En el laboratorio de Microbiología, la vigilancia ambiental microbiológica del
área tendrá en cuenta la efectividad de la limpieza y sanitización de las
superficies, así como la eficacia de la filtración en los sistemas de aire, y la
asepsia del personal.
Se efectúa la medición de contaminantes biológicos en tres fases:
• Captación
• Cultivo
• Análisis
2.1.1 MUESTREO AMBIENTAL
La física de captación de partículas suspendidas en el aire y los principios
generales para una buena recogida de muestras son aplicables a todo tipo de
materia con independencia de si es de origen bilógico o no.
Los diferentes métodos de recogida de muestras de contaminantes biológicos,
se basan en pasar un determinado volumen de aire sobre un soporte de
retención del contaminante por medio de un sistema de aspiración.
23. El soporte debe impedir la destrucción de los microorganismos manteniéndolos
vivos dado que en el cultivo de la misma se propiciará su crecimiento para
poder después proceder al conteo.
Los diferentes métodos de captación de contaminantes biológicos son:
• Sedimentación: Consiste en ubicar cajas petri, que contengan medios
de cultivo adecuado, en aquellas zonas escogidas para el muestreo.
Tras el periodo de muestreo se recogerán las placas y se procesarán
según las técnicas analíticas microbiológicas más apropiadas
• Recogida en medio acuso: Consiste en hacer borbotear un volumen de
aire a través de una solución isotónica contenida en un frasco lavador y
la posterior determinación cuantitativa por los métodos microbiológicos
habituales.
• Filtración: Consiste en filtrar un volumen de aire a través de filtros de
gelatina, incubándolos posteriormente sobre medios de cultivo
apropiados.
• Impactación: Se basa en la retención de microorganismos libres o de
microorganismos aerotransportados, adheridos a partículas de polvo, en
placas que contengan medios de cultivo, ejemplos: recolector Andersen,
Recolector RCS (Reuter Centrifugal System), SAS (Surface Air System).
2.1.2 MUESTREO DE SUPERFICIE
Esta fase tienen un interés especial puesto que permite determinar la posible
contaminación por agentes bilógicos de las materias primas, de los
instrumentos de trabajo, las ropas, el mobiliario o los elementos de
construcción que por sus características pueden convertirse en reservorios de
agentes biológicos.
El análisis de superficies, de líquidos o del polvo es necesario, puesto que la
simple medición ambiental puede, en ocasiones, dar como resultado la
inexistencia de contaminación microbiológica, es decir, proporcionar falsos
negativos. Este tipo de mediciones son importantes ya que permiten identificar
los focos de contaminación que es uno de los objetivos fundamentales en la
evaluación de la exposición a agentes biológicos.
• Placa de contacto: Esta placa que contiene un medio de cultivo
adecuado, e ligero exceso, se coloca sobre la superficie a muestrear,
presionando sobre la misma y manteniéndola inmóvil durante el
contacto.
• Frotis(Swab-rinse): Este método se basa en la utilización de hisopos
estériles, que nos permiten muestrear zonas de difícil acceso para las
placas de contacto. Dichos hisopos se colocan posteriormente sobre un
medio de cultivo adecuado.
24. 2.1.3. MUESTREO DEL PERSONAL
Se busca disminuir otra de las formas de contaminación como es el contagio a
través de manos y cabello. También debe realizarse cada 2-4 meses estudios
médicos como son: coproparasitoscópico, reacciones febriles y exudado
faríngeo (ya que una forma importante de transmisión de patógenos son las
gotitas de saliva al hablar, toser o estornudar); por lo cual es importante el uso
de cofia y guantes.
En la mayoría de los métodos de muestreo comentados el soporte en que se
recogen los contaminantes es una placa que contiene un medio de cultivo que
permitirá el crecimiento de los contaminantes biológicos captados.
El medio de cultivo es el material donde se multiplicarán los microorganismos
formando colonias, por lo tanto, deberá reunir las condiciones que permitan y
favorezcan su desarrollo. En una muestra, ya sea ambiental, de agua o de un
material, van a coexistir muchos microorganismos diferentes con requisitos
vitales distintos. El cultivo de esa muestra en una placa con un medio de
características determinadas harán que otros muchos pasen inadvertidos.
Existen diferentes variedades de medios de cultivo en función del objetivo del
análisis.
Por último es indispensable el analizar el tipo de microorganismos para su
aislamiento, e identificación para poder proponer la descontaminación del área
y posteriormente volver a sondear para verificar que la zona este libre.
Lo importante del monitoreo ambiental en cuanto a la industria, es que la
vigilancia proporcione información a tiempo para que se adopten medidas
correctivas con el objeto de recuperar el control del proceso antes de que sea
rechazado el producto.
2.2. OBJETIVOS
Identificar posibles fuentes de contaminación en diversas zonas del
laboratorio, por medio de un monitoreo ambiental para poder constatar la
limpieza de éste ó para proponer medidas de corrección en las áreas que lo
ameriten.
Monitorear al personal, tomando muestra de manos, cabello y boca, para
determinar si están libres de microorganismos (bacterias u hongos).
25. 2.3 MATERIAL
EQUIPO
• Estufa de incubación
• Microscopio óptico
VIDRERIA Y OTROS
• Portaobjetos
• Ansa bacteriológica
MEDIOS DE CULTIVO
• Agar SDA
• Agar AST
• Agar sangre
• Caldo nutritivo
REACTIVOS
• Cristal violeta
• Lugol
• Alcohol-acetona
• Safranina
• Agua estéril
• Aceite mineral
• Aceite de inmersión
26. 2.4 DIAGRAMA DE TRABAJO
Analizar posibles focos de
infección en el laboratorio
Proponer
una solución
para
desinfectar
la zona
Mesas Estufa
incubadora
Refrigerador
Delimitar
20 cm2
de
la mesa
Colocar una
caja de agar
SDA y una caja
de agar AST
destapadas, en
el nivel medio
de cada uno de
los equipos.
Colocar una
caja de
agar SDA y
una caja de
agar AST,
destapados en
los pasillos
durante 30
minutos.
Incubar a 37º C
Durante 24hr.
Realizar conteo
de colonias y
tinción de gram
Frotar el área
delimitada con
un hisopo
estéril
humedecido en
caldo nutritivo.
Una vez tomada
la muestra
sembrar en una
caja de agar SDA
y en en una caja
de agar AST,
utilizando la
técnica de
masivo.
Desinfectar el
área y repetir
la operación,
utilizando
hisopo y cajas
nuevas.
Aire
Frotar el área
de las
paredes,
rejillas ó zonas
sospechosas
utilizando un
hisopo estéril
humedecido
en caldo
nutritivo.
Determinar si
cumple con los
límites
establecidos
Personal
Una vez tomada
la muestra
sembrar en una
caja de agar SDA
y en en una caja
de agar AST,
utilizando la
técnica de
masivo.
27. 2.4.1 DIAGRAMA DE TRABAJO
PERSONAL
Manos
Boca
Cabello
Colocar
directamente
las manos
sobre una
caja de agar
AST y sobre
una caja de
agar SDA.
Obtener un
cabello
desde la
raíza y
colocarlo
sobre un
medio de
agar AST y
en un medio
de agar SDA
Hablar de
frente a una
caja de Agar
sangre
. Hablar de
frente a una
caja de Agar
sangre
utilizando un
cubrebocas
Incubar a 37ºC
durante 24 hr.
Realizar gram
Determinar si el
personal está
libre de
microorganismos
28. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA.
NOMBRE DE LA PRÁCTICA MONITOREO AMBIENTAL
Fecha de la Práctica No. de Práctica
NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS
MONITOREO UFC/cm2
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
Mesa sin desinfectar
Mesa desinfectada
Refrigerador
(cajas abiertas)
Refrigerador (hisopado)
Estufa incubadora
(cajas abiertas)
Estufa incubadora
(hisopado)
Aire
Cabello
Boca sin cubrebocas
Boca con cubrebocas
FIRMA DE REVISIÓN
30. Práctica No. 3
Evaluación de Medios de Cultivo
3.1 INTRODUCCION
Un medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar a
los microorganismos in vitro, así como efectuar pruebas de susceptibilidad.
El desarrollo de las técnicas de crecimiento de microorganismos en medios sólidos y de
obtención eficaz de cultivos puros se debió a Koch y Loeffler en 1882, el cual sigue siendo
esencial en todas las áreas de la microbiología.
Gran parte de la Microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener
microorganismos en un laboratorio a través de medios especiales de cultivo para aislar e
identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar agua y
alimentos, en microbiología industrial y otras actividades.
Los microorganismos necesitan fuentes de energía y la composición precisa de un medio
adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar, debido a que las necesidades
nutricionales varían considerablemente y pueden ser elementales (para su composición
celular) energéticas (satisfacen las reacciones oxido-reducción) o específicas (compuestos
que deben ser proporcionados porque no se encuentran en sus vías sintéticas).
Además de los nutrientes los medios de cultivo deben reunir condiciones físico-químicas
específicas de actividad de agua, pH, potencial de oxido-reducción (E0), condiciones de
isotonía. Todos los microorganismos en general, bacterias y hongos en particular se cultivan
sobre sustratos nutritivos para poder estudiar sus propiedades o la utilización de ellas en
condiciones controladas.
3.1.1 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Principalmente se clasifican en base a los requerimientos nutricionales de los diferentes
microorganismos en:
• Básicos o Generales: Contienen los nutrientes esenciales para promover el desarrollo
de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Tales medios pueden ser: caldo
o agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar Tripticaseína soya.
• Enriquecidos: Suplementados con otros nutrientes para promover el desarrollo de
microorganismos exigentes: Ejemplo son agar sangre, agar chocolate, agar suero,
entre otros.
• De enriquecimiento: Para aumentar la propagación de ciertos microorganismos sin
favorecer el desarrollo de otros, utilizados para el aislamiento de enterobacterias:
Ejemplo son caldo selenito de sodio y cisteína, caldo tetrationato, agar yema de huevo
mas leche, etc.
• Selectivos: Se incorporan sustancias inhibidoras de la propagación de un grupo de
bacterias, pero permiten el crecimiento de otros grupos. Ejemplo son agar endo,
eosina-azul de metileno y MacConkey.
31. • Diferenciales: Permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies
bacterianas por el aspecto característico que toman sus colonias. Ejemplo de estos
medios son el agar sangre, MacConkey.
• De transporte: se utilizan en el envío de muestras al laboratorio, más comunes son:
Stuart, caldo tioglicolato, caldo nutritivo y medio Carry-Blair.
• Para el mantenimiento: son medios simples y no deben estimular un crecimiento
abundante. Se pueden emplear: agar nutritivo, medio de Dorset.
• Para el estudio de carbohidratos: medio basal OF, de Hugh Leiffson, medio para
MR-VP y los que prueben algún azúcar.
3.1.2 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
El control de calidad de los medios de cultivo consiste en una evaluación sistémica del trabajo
para asegurar que el producto final se ajuste a un grado aceptable a límites de tolerancia
previamente establecidos, donde finalmente se proporcionen resultados verídicos y permite
que se acepten los registros documentados de los fabricantes y abastecedores de productos
comerciales.
La viabilidad de los medios debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC
(Colección Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas.
Para realizar el control de calidad de los medios de cultivo es necesario considerar los
siguientes puntos básicos:
a) Personal: debe ser capacitado en el área específica y con un entrenamiento práctico.
b) Material de vidrio: debe estar limpio, seco y libre de cualquier tipo de contaminantes,
ya que la presencia de éstos puede afectar los resultados.
c) Materia prima: debe presentar características homogéneas en el tamaño de partícula,
color y no presentar apelmazamiento. El envase debe ser de tapa de aluminio, frasco
de vidrio ámbar, composición completa en la etiqueta, debe precisar fecha de
caducidad, indicación clara de la preparación, así como el número y lote.
El control de calidad para los medios de cultivo debe, en el análisis final, asegurar que un
medio respalde el desarrollo de los microorganismos, inhibir el desarrollo de microorganismos
comensales, exhibir una respuesta bioquímica típica, ser estable y tener un tiempo de
conservación razonable.
3.1.3 PRUEBAS QUE SE REALIZAN A LOS MEDIOS DE CULTIVO
Esterilidad.
La frecuencia con que se realizan las pruebas de control de calidad de medios es determinada
por cada laboratorio y a las instrucciones de los fabricantes para todos los productos
comerciales usados y debe efectuarse con varios tubos o frascos de cada lote.
Se realiza particularmente para aquellos medios a los que se les adicionan componentes luego
de la esterilización, visualmente y por subcultivo. Ciertos medios selectivos que pueden
suprimir suficientemente el crecimiento visible de bacterias; sin embargo, pueden aparecer
microorganismos viables al subcultivar.
Los parámetros a evaluar son aspecto físico como signos de deterioro, decoloración, turbidez,
cambios de color o estado de hidratación.
32. Pruebas de promoción e inhibición de crecimiento
Para determinar la capacidad del medio para respaldar el desarrollo del microorganismo
inoculado con una concentración baja que nos permita ver la funcionalidad del medio,
considerando que un error frecuente del control de calidad es el uso de un inóculo concentrado
que puede producir un desarrollo desorientador, para lo cual es necesario estandarizar esta
prueba, mediante el empleo de una técnica que nos ayude a dicho propósito como la técnica
de Miles & Misra.
Esta técnica es una de las más empleados para medios sólidos, la cual consiste en sembrar
una suspensión de un cultivo joven de las cepas sobre la superficie de una placa, divida en
cuadrantes; la suspensión debe ser de 0.02 ml, y adicionada en cada cuadrante, de cada una
de las diluciones del cultivo. Después de la incubación de la caja, se cuenta con el número de
UFC que crecen en cada dilución.
3.1.4 USOS Y LAS APLICACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Medicina Humana y veterinaria, se efectúan investigaciones microbiológicas en el diagnóstico
de infecciones y para el control de las medidas terapéuticas que le siguen.
Industria Farmacéutica, la mayor parte de los productos de esta industria deben cumplir con
una especificación microbiológica establecida de acuerdo a la Farmacopea respectiva. En
consecuencia, el control de calidad microbiológico es una fase importante en el proceso de
producción.
Industria Cosmética, debido que casi todos estos productos contienen sustancias biológicas
activas y por ello pueden contener microorganismos patógenos.
Industria Láctea, la leche cruda es un medio de cultivo ideal para numerosos
microorganismos.
Industria Cárnica, en los mataderos es donde se procede a investigaciones microbiológicas y
para la detección de residuos de antibióticos, si un animal ha estado tratado con antibióticos
antes del sacrificio.
Industria Alimentaria y de Bebidas, productos naturales pueden deteriorarse debido a la
presencia de microorganismos. Su tratamiento está sometido a reglamentaciones
particularmente estrictas.
33. 3.2 OBJETIVO GENERAL
Al finalizar la práctica el alumno deberá:
Evaluar medios de cultivo, por medio de la promoción e inhibición de crecimiento
microbiano para determinar si los medios de cultivo son viables.
3.2.1 OBJETIVOS PARTICULARES
Aplicar la técnica de Miles & Misra, por medio de la inoculación de cepas ATCC
(Colección Americana de Cultivos Tipo) en los medios de cultivo a utilizar y determinar
si los medios de cultivo son viables.
Comprobar si la morfología colonial obtenida en cada uno de los medios de cultivo es
específica de los microorganismos tipo empleados.
34. 3.3 METODO EXPERIMENTAL
3.3.1 MATERIAL
4.3.1.1 EQUIPO
Microscopio óptico
Estufa de Incubación
Vortex
Asa bacteriológicas calibradas de 0.01 y 0.001 ml
Mecheros Bunsen
3.3.1.2 MATERIAL DE VIDRIO
Tubos de ensaye de fondo plano
Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml
Porta objetos planos
Cubre objetos
Tubo 0.5 del Nefelómetro de Mac Farland
3.3.1.3 MEDIOS DE CULTIVO (por equipo)
Agar Sangre (AS)
Agar Chocolate (ACh)
Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB)
Agar Cetrimida (AC)
Agar sales Manitol (ASM)
Agar McConkey (AMc)
Agar Dextrosa Saboraund (ADS)
Agar Salmonella-Shigella (SS)
3.3.1.4 CEPAS ATCC # COLECCION
Salmonella enteritidis
Enterobacter aerogenes
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aureginosa
Cándida albicans
Streptococcus β-hemolítico grupo A
Escherichia coli
Shigella
3.3.1.5 PRUEBAS BIOQUIMICAS
OF
Nitratos
MR
VP
KIA
SIM
Urea
Citratos
MIO
Arginina
Malonatos
LIA
3.3.1.6 REACTIVOS
Glicerol
Cristal Violeta
Alcohol etílico al 70 y 90%
Acetona
Lugol
35. Safranina
Aceite de inmersión
Solución Salina Fisiológica (estéril)
3.3.2 METODO EXPERIMENTAL
3.3.2.1 DETERMINACION DE LA DILUCION PARA LA TECNICA
a) Sembrar las cepas de los diferentes microorganismos con un asa bacteriológica 24 horas
antes de la experimentación.
b) Dividir en cuatro partes las cajas petri, y posteriormente colocarlas durante menos de una
hora en la estufa de incubación a 37 °C.
c) Rotular la serie de tubos de ensaye para cada microorganismo del 1 al 5 respectivamente, y
agregar 4.5 ml de SSF (estéril).
d) Preparar una suspensión de la cepa del microorganismo igualando la turbidez con el tubo
número 0.5 del Nefelómetro de McFarland el cual equivale a 1.5 x 108 UFC / ml
e) Tomar de la solución anterior un volumen de 500 μl con una micro pipeta y adicionarlo a un
tubo que contenga SSF (Tubo 1 de dilución 10-1)
f) Homogenizar la solución en el vortex
g) Tomar del tubo 1 un volumen de 500 μl con una micro pipeta y adicionarlos a otro tubo con
SSF (Tubo 2 de dilución 10-2)
h) Homogenizar la solución obtenida en el Vortex.
i) Realizar los pasos hasta el tubo 5.
3.3.2.2 PROMOCION E INHIBICION DE CRECIMIENTO
a) Agregar 10 μl de la dilución para la técnica de Control de Calidad en los diferentes medios
de cultivo a evaluar y distribuir uniformemente. Para realizar esta técnica se debe emplear
según sea el medio de cultivo: un microorganismo que debe crecer (Cuadrante I), uno que
debe diferenciarse del anterior (Cuadrante II) y por último otro que no debe crecer (Cuadrante
III) y el último cuadrante se emplea como área de esterilidad.
b) Esperar a que la solución anterior se difunda en el medio de cultivo, posteriormente realizar
un barrido y/o estriado con una asa bacteriológica y se incuba las cajas petri con los medios de
cultivo en la estufa de incubación a 37 °C / 24 hrs.
c) Realizar la lectura de las cajas petri (conteo manual), en donde el número de colonias debe
oscilar entre 20-30 por cuadrante.
d) Realizar el ensayo al mismo tiempo en un medio de referencia para asegurar el crecimiento
del microorganismo, empleando la misma dilución para cada una de las cepas de
microorganismos empleados para comparación de la recuperación bacteriana en los medios de
cultivo evaluados y de referencia.
NOTA: A continuación se presenta un diagrama de flujo con base al diseño experimental.
38.
NOMBRE DEL AGAR
MODO DE ACCIÓN
CONTROL DE CALIDAD.
Parámetros
a evaluar
Bacteria/Levadura Morfología Colonial UFC/mL
Promoción
(--)
Promoción
(+)
Inhibición
Esterilidad
PRUEBAS BIOQUÍMICAS.
PRUEBA Microorganismo usado Cumple
40. 4.7 BIBLIOGRAFIA
BOLAÑOS, Carlos Alberto y ANACORETA, Inocencia Vargas. Tesis. “Evaluación de la
Estabilidad de diferentes Medios de Cultivo preparados en condiciones estándar”. FESC, 1999.
COLLARD, Patrick. “El desarrollo de la Microbiología”. Editorial Reverte. Barcelona, España.
1990.
COLLINS, C.H. “Métodos Microbiológicos”. 5ª ed. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 1990.
HERNÁNDEZ, Guadalupe. Tesis. “Manual de Prácticas del Laboratorio de Bacteriología”.
FESC, 2000.
KONEMAN, MD. “Diagnóstico Microbiológico”. 5ª ed. Editorial Médica Panamericana.
Buenos Aires, Argentina. 1999
MANUAL DE RECOMENDACIONES GENERALES PARA LA PREPARACION DE MEDIOS
DE CULTIVO. Secretaría de Salud. Dirección General de Epidemiología. Instituto Nacional de
Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos “Dr. Manuel Martínez Báez”. México DF, 1989.
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-065-SSA1-1993. “Especificaciones Sanitarias de los
Medios de Cultivo”.
PRESCOTT, Lasing. “Microbiología”. 4ª ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana. España,
1999.
41. PRÁCTICA No. 4
CONSERVACIÓN DE CEPAS
INTRODUCCIÓN
Los sistemas de Validación son los procesos que se requieren para asegurar que los
parámetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domésticos,
son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como métodos de diagnóstico en el
laboratorio. La mayoría de los procedimientos en Microbiología, dependen de que los
microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus características
morfológicas, fisiológicas y que sean típicas y reproducibles. Para ayudar en este control,
las Cepas Estándar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de
validación.
Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos
ejemplos son:
ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA
NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra
JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japón
CCTM : Colección Nacional – Lille, Francia
RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Moscú, Rusia.
NCIB : Colección Nacional industrial – Aberdeen, Escocia
DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen – Gottinger, Alemania.
Así, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210.
Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de
identificación, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el
usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas
domésticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, área de
aislamiento, reacciones bioquímicas y patrón de sensibilidad a los antibióticos, forma de
almacenaje, fecha de último pase.
En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos específicos:
• Características típicas.
• Características estables.
• Reproducibilidad.
42. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS.
Los métodos de conservación de las cepas estándar de control de calidad, deben
asegurar que las mismas mantengan sus características típicas y que puedan ser
reproducidas después. El medio utilizado para su conservación debe mantener un mínimo
de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo también el mínimo
crecimiento del microorganismo y aportando óptimas condiciones ambientales para su
sobrevivencia, con el menor número de subcultivos.
Para una mejor clasificación de los métodos de conservación de cepas, los dividiremos en
tres categorías: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.
CULTIVOS STOCK:
Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos". Estos son mantenidos en un
sistema cerrado de conservación, minimizando su actividad genética y fisiológica, para
evitar su potencial mutación.
Los dos métodos más importantes para conservación en Stock, son la Liofilización y el
ultracongelamiento.
LIOFILIZACIÓN: Se hace una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven en leche
estéril o similar, y se coloca en tubos con tapón de rosca y se siguen las instrucciones del
aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vacío, hasta un
sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el
aparato liofilizador y la formación de aerosoles.
Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo
de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.
ULTRACONGELAMIENTO: Hacer una suspensión fuerte de la colonia pura en caldo
Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en porciones de 0.5 ml en
pequeños tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45°C.
También se puede utilizar la modificación de Ultracongelamiento en Nitrógeno líquido,
que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato específicamente
designado para el mantenimiento de cepas en nitrógeno líquido.
Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.
CULTIVOS SEMISTOCK:
Este término se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el
relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo
diario. De las 5 técnicas listadas a continuación, solo la de congelamiento es utilizable
para el mantenimiento de cepas de anaerobios.
Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a -25°C.
Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelación y
43. son colocados en el congelador. El método permite la sobrevivencia de bacterias y
levaduras en algunos casos por años y en la mayoría de las veces por al menos de 6 a 12
meses.
CONGELAMIENTO EN CONGELADOR CONVENCIONAL:
Se preparan tubos con tapón de rosca conteniendo agar soya tripticasa-cisteína.
Inocular el cultivo puro y jóven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento
moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en
refrigeración, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven
bien por un año y los fastidiosos por 6 meses.
CULTIVO EN CTA:
Este método es conocido también como método Stamp en honor de su creador. Corte
pequeños círculos de papel encerado y colóquelo en una caja Petri de vidrio. Esterilice en
autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión.
Prepare una suspensión de caldo nutritivo con 10% de gelatina en polvo ( Peso por
Volumen ) y 0.25% de ácido ascórbico ( P x V ) y dispense en tubos con rosca y esterilice
en autoclave.
Haga una suspensión fuerte de un cultivo puro y jóven y coloque una gota del mismo con
una pipeta estéril sobre uno de los discos de papel acerado estéril en una caja Petri. Con
una pinza estéril, transfiera el disco a un desecador de vacío conteniendo Pentaóxido de
fósforo. Evacue el desecador con la bomba de vacío. Cuando el disco está seco,
asépticamente introducir en un tubo estéril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador.
Para hacer un subcultivo del disco, asépticamente retire un círculo de papel con las
colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas a
35ºC y luego inocular en agar sangre e incubar nuevamente.
SECADO EN DISCOS CON GELATINA:
Es un método especialmente utilizado para hongos, pero es útil también para algunas
bacterias.
En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo jóven y bien desarrollado en un medio de
cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite
mineral estéril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presión por 45 minutos, para
asegurar su esterilidad absoluta.
Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o
incinerador y remueva una porción visible de crecimiento con una asa estéril larga o una
aguja.
Este método permite la sobrevivencia por muchos años.
44. Si el método se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazón
o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los
medios se sirven en tubos con tapón de rosca. Se esterilizan y luego se les hace
solidificar en forma inclinada.
Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35°C por 24 horas, tomando en
cuenta sus requerimientos de oxígeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral
estéril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 años a
temperatura ambiente.
CONSERVACIÓN EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE
MINERAL:
MANTENIMIENTO EN TIERRA ESTÉRIL:
Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas.
Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presión por 1 hora.
Haga una suspensión fuerte del microorganismo jóven y esporulado y colóquelo en el
tubo con tierra estéril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.
CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO:
Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el
control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al
momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras.
Para éste propósito se utilizan cultivos de 24 horas y son pasados diariamente.
BACTERIAS RESISTENTES:
Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacterias. Se transfiere una colonia jóven de un
cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar
por un mínimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos
para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un
intervalo de 6 meses. Después de éste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del
cultivo stock.
BACTERIAS DELICADAS :
Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N.
Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son
preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar
chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeración. Después de
una serie de 6 pases consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir
de la cepa en stock.
45. BACTERIAS ANAERÓBICAS:
Los cultivos para trabajo diario de la mayoría de las bacterias anaeróbicas, pueden ser
mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio
adicionado después de esterilizar por autoclave.
Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.
HONGOS:
Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o
sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y
ocurra la esporulación, para luego ser colocados en refrigeración. Los cultivos de trabajo
deben ser transferidos cada 2 meses. Pasado éste tiempo se debe preparar otro cultivo
de trabajo a partir de la cepa en stock.
CULTIVOS DE TRABAJO COMERCIALES:
Son preparados por casas comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC. Estas
son estables en refrigeración por un año. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche
Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras.
Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo soya tripticasa e
incubados por 24 horas a 35°C. Luego se hace un pase a un medio de enriquecimiento o
agar sangre.
Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo
constituye una ayuda importante en la validación de equipos, materiales, reactivos y
habilidad del personal. Debe existir un programa metódico de pase de cepas , archivo de
cada uno de los cultivos con sus características bioquímicas, sensibilidad a los
antibióticos, origen de la cepa, método de identificación, fecha de siembra y próximo pase.
46. OBJETIVO
Conocer y aplicar las técnicas de mantenimiento de un cepario bacteriano y de hongos,
por medio de metodología establecida en la literatura, para ser utilizados en el control de
equipos o sistemas de identificación.
MATERIAL
Medios de cultivo y reactivos
• Cajas de agar soya tripticasa
• Cajas de agar sal y manitol
• Cajas de agar MacConkey
• Cajas de agar cetrimida
• Cajas de agar dextrosa Sabourou
• Tubos de OF
• Tubos de citratos
• Tubos de MR-VP
• Tubos de KIA
• Tubos de LIA
• Tubos de MIO
• Tubos de arginina
• Tubos de malonato
• Tubos de nitratos
• Tubos de urea
• Tubos con caldo nutritivo
• Tubos de carbohidratos
• Tubos con agua estéril
• Tubos de dilución con 5 ml de SSF estéril
• Tubos de dilución con agar base sangre inclinados
• Tubos de dilución con 5 ml de caldo BHI+1% de sacarosa+1% de leche
descremada
• Plasma de conejo
• Suero humano
• Peróxido de hidrógeno
• Reactivo para oxidasa
• Reactivo de Erlich
• α-naftol
• α-naftilamina
• KOH 40%
• Ácido sulfanílico
• Aceite de inmersión
47. • Aceite mineral estéril
• Cristal violeta
• Lugol
• Alcohol/acetona
• Safranina
Vidriería y diversos
• Pipetas graduadas estériles de 1 ml
• Pipetas graduadas estériles de 10 ml
• Tubo 0.5 del Nefelometro de MacFarland
• Microscopio compuesto
• Mechero/tablita
• Palillos estériles
• Asas bacteriológicas
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Plastilina
• Estufa bacteriológica
• Refrigerador
• Congelador
Material Biológico
• Escherichia coli
• Staphylococcus aureus
• Staphylococcus epidermidis
• Staphylococcus saprophyticus
• Streptococcus faecalis
• Salmonella Typhi
• Pseudomonas aeuroginosa
• Enterobacter cloacae
• Enterobacter aerogenes
• Citrobacter freundii
• Klebsiella pneumoneae
• Candida albicans
48. DIAGRAMA DE TRABAJO No.1. Identificación y conservación de cepas.
Cepa desconocida
Realizar pruebas bioquímicas
primarias
Sembrar por dilución
Agar Soya
Tripticaseína
Medios selectivos
y diferenciales
OFGram
MotilidadCatalasa
Incubar 24 hrs/37ºC Incubar Oxidasa
24hrs/37
Realizar pruebas
bioquímicas secundarias
ºC
Preparar suspensión
bacteriana igualada al
tubo 0.5 del NMF.
Registrar e interpretar
resultados Registrar e interpretar
resultados.
Registrar e interpretar
resultados
Colocar 1 ml. en caldo BHI
con 1% de sacarosa y 1%
de leche descremada.
Inocular con una asada 2 tubos
con agar base sangre inclinados
Incubar 8‐12 hrs/37ºC y conservar
A un tubo inclinado
agregar hasta cubrir
aceite mineral estéril y
mantener a 20‐25ºC
A un tubo inclinado
agregar hasta cubrir
aceite mineral estéril
y refrigerar a 8ºC
El caldo BHI se congela
a ‐10ºC
49. DIAGRAMA DE TRABAJO No.2. Recuperación e identificación de cepas.
Cepa conservada
Realizar pruebas
bioquímicas primarias
Gram
Catalasa
Oxidasa
Motilidad
OF
Dividir en tres los medios selectivos y
diferenciales e inocular en cada tercio
las cepas recuperadas
Dividir en tres una caja de agar
soya tripticaseína e inocular en
cada tercio las cepas recuperadas
Realizar pruebas
bioquímicas secundarias
Incubar 24 hrs/37ºC
Crecimiento en medios
diferenciales y selectivos
Registrar e interpretar
resultados.
Registrar e interpretar
resultados
Registrar e interpretar
resultados
Eliminar el aceite mineral
estéril al tubo inclinado
incubado a temperatura
ambiente
Ambientar y eliminar el
aceite mineral estéril al
tubo inclinado refrigerado
Descongelar el caldo
BHI colocándolo a
temperatura ambiente
Crecimiento en agar
soya tripticasa
50.
51. 7 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA
7.1 INTRODUCCION
El agua empleada en la Industria Farmacéutica, ya sea como aditivo en las
diferentes formas farmacéuticas o en las operaciones de limpieza de los equipos y
áreas, que participan en los procesos de producción farmacéuticos, debe cumplir
ciertas especificaciones dependiendo el tipo de agua que se emplea y en los
procesos de producción que se utiliza. Se debe contar con un sistema de control que
asegure y mantenga la calidad del agua desde que se recibe para su proceso de
purificación hasta su uso. La FEUM (Farmacopea de los Estados Unidos
Mexicanos) describe las especificaciones y los usos del agua. La siguiente tabla
muestra el agua usada en la industria farmacéutica: 1
tipo de agua uso especificaciones
Agua Purificada El agua purificada es usada
como un excipiente en la
producción de preparaciones
oficiales, para limpieza de
equipo y preparaciones de
algunas soluciones
farmacéuticas. El agua
purificada tiene requerimiento
físico, químico y
microbiológico. Para obtener
agua purificada se utiliza agua
comúnmente de la red
municipal que es sometida a
varias operaciones unitarias,
como desionización,
destilación, intercambio iónico,
osmosis inversa, filtración u
otro proceso de purificación.
pH: entre 5 y 7
Determinar los siguientes
compuestos:
Cloruros: 0.5 mg/l
Sulfatos*
Amonio: <0.03 ppm
Calcio*
Dióxido de Carbono*
Metales pesados*
Sustancias oxidables*
Nitratos: <0.2 ppm
Sólidos totales: <0.001%
Carbono orgánico total: 500 ppb
Conductividad*
Límites Microbianos
No más de 100 UFC/ml de
mesófilos aerobios y ausencia de
patógenos.
Agua Purificada Estéril
Se usa en las preparaciones
farmacéuticas no parenterales.
Esta agua no debe contener
agentes antimicrobianos y debe
estar envasada
apropiadamente.
Cumplir con todos los requisitos
de agua purificada y pruebas de
esterilidad.
Agua para la Fabricación de
Inyectables
Se usa como aditivo para
la fabricación de
inyectables y para la
limpieza de los equipos.
Es producida a partir de
agua potable y se purifica
por destilación u osmosis
. Cumple con los requisitos de todas
las pruebas indicadas en Agua
Purificada y:
Endotoxinas. Libre de
endotoxinas.
Límites microbianos. Ausencia de
patógenos
52. inversa.
El agua es un excelente vehículo para la transportación de los organismos
patógenos, especialmente los que existen en las aguas negras cuando estás no han
sido bien tratadas. Los estragos causados por la proliferación de estos gérmenes
hicieron que se tomaran medidas como la cloración de los suministros de agua. Es
preciso analizar el agua para determinar si es potable; el análisis microbiológico del
agua es un procedimiento diseñado para comprobar si una muestra de agua ha
sufrido contaminación de aguas negras, materia fecal; y por lo tanto, si contiene
microorganismos patógenos al humano y/o animales.
Los organismos en el agua están generalmente diluidos a tal grado que la pequeña
muestra de agua a analizar estará muchas veces libre de todo patógeno. En este tipo
de análisis se trata de detectar aquellos microorganismos que son provenientes de
aguas negras, materia fecal; los llamados coliformes.3
Las bacterias patógenas que causan ciertas enfermedades pueden sobrevivir al caer
en el agua y ser transportadas, usando el agua como vehículo, de una persona a otra.
La presencia de estos microorganismos en el agua origina una contaminación de la
misma y la hace impropia e insegura para su consumo.
El grupo de los microorganismos Coliformes es el más ampliamente utilizado en la
microbiología de los alimentos y en la industria farmacéutica como indicador de
prácticas higiénicas inadecuadas.
El uso de los Coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
• La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la
fabricación de los alimentos.
• La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su
presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.
• Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo.
La demostración y la cuenta de microorganismos Coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características
selectivas o diferenciales.5
7.1 METODOS DE ANALISIS
7.1.1 METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
Método del Número Más Probable (NMP) se emplea para la determinación de
número de microorganismos viables, un procedimiento estadístico en el cual se
elaboran diluciones específicas para alcanzar un punto de extinción. Generalmente
se emplean réplicas, usualmente 3 a 10 de cada dilución y se registra el patrón
positivo o negativo. Para determinar en NMP de microorganismos presentes en la
muestra original se emplea una tabla estadística basada en la distribución de
Poisson.
53. En los diferentes procedimientos del NMP se emplean criterios variados para
establecer las marcas positivas o negativas. En muchos procedimientos, un tubo se
marca positivo cuando hay crecimiento visible (como aumento en la turbidez). Otros
procedimientos emplean criterios más cuantitativos, tales como un incremento en la
concentración de proteínas o criterios diferenciales, como la producción de ácidos a
partir carbohidratos o producción de dióxido de carbono, y de clorofila son también
utilizadas para establecer una marca positiva en procedimientos para bacterias y
algas respectivamente utilizando este método. 7
7.1.2 CUENTA EN PLACA
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa.
En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos
presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades
nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc.,
hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra
realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el
adecuado.
Por otra parte, el recuento de termofílicos, psicrofílicos y psicotróficos es
importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de
almacenamiento.
Esta técnica puede aplicarse para la estimación de microorganismos viables en una
amplia variedad de alimentos y productos farmacéuticos.8
7.2 MUESTREO DEL AGUA
En el análisis microbiológico, la adecuada selección de la muestra, la toma correcta,
los medios de conservación y su transporte al laboratorio, son de primordial
importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto implica
precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el
tamaño o el volumen, en lo posible, sean representativos del producto y del lote o
partida de donde provienen.
La recolección de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminación externa,
tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma.
Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos
pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que
el laboratorio lo tome en consideración.
Las condiciones de conservación y transporte, tiempo comprendido entre la
recolección de la muestra, su entrega al laboratorio, así como la realización del
análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la población
microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos.
7.3 TECNICA ENZIMATICA
54. 7.3.1 Ready cult:
La identificación bacteriana se realiza determinando la actividad enzimática
específica, se evidencia por un cambio de color o emisión de fluorescencia en un
medio de cultivo especifico.
SUSTRATOS CROMOGENICOS ENZIMAS
X - GAL β - D - Galactosidasa
MUG β - D - Glucoronidasa
Para la determinación de los Coliformes totales la enzima β - D – Galactosidasa
degrada al sustrato X-GAL produciendo una coloración azul-verde, para
determinación de Coliformes fecales la enzima β - D – Glucoronidasa degrada al
sustrato MUG produciendo fluorescencia.
55. 7.4 OBJETIVOS
• EL ALUMNO IDENTIFICARA LOS PRINCIPALES MICROORGANISMOS
OBJETABLES PRESENTES EN UNA MUESTRA DE AGUA PARA EL
CONTROL MICROBIOLOGICO, POR LA TECNICA DEL NMP Y LA
TECNICA ENZIMATICA DE READY CULT.
• EFECTUAR LA TOMA DE MUESTRA, SU PREPARACION Y ANALISIS
MICROBIOLOGICO PARA LA IDENTIFICACION Y RECUENTO DE
MICROORGANISMOS EN UNA MUESTRA DE AGUA.
7.5 MATERIAL
7.5.1 EQUIPO
Baño María
Autoclave
Estufa de Incubación
Refrigerador
Microscopio óptico
7.5.2 MATERIAL DE VIDRIO
Pipetas graduadas de 1 ml (estériles)
Pipetas graduadas de 10 ml (estériles)
Cajas de petri (estériles)
7.5.3 MEDIOS DE CULTIVO
1
Agar Mc Conkey (AMc)
Agar Cuenta Estándar
1 Agar Cetrimida (AC)
6 tubos con Caldo rojo de fenol
Lactosado concentración simple
(CRFL)
3 tubos con Caldo rojo de fenol
Lactosado concentración doble
4 tubos con Caldo Lactosado bilis
verde brillante (CBVB)
1 tubo con Caldo Soya Tripticaseína
1 Citratos
1 SIM
1 Rojo de metilo
1 Vogues Proskauer
2 Medio O/F
7.5.4 REACTIVOS
Kit paraTinción de Gram
Rojo de metilo
Reactivo de Kovac
α-Naftol 5%
Peróxido de Hidrógeno
Agua destilada
KOH
57. MESOFILOS
AEROBICOS
DETERMINACION
DE Pseudomonas
Se colocan 4 cajas
petri estériles
Agregar 1 mL de la
muestra en cada caja.
Agregar 25 mL de
Agar Cuenta Estándar
Homogeneizar. 6
vueltas a la derecha y 6
a la izquierda
2 cajas se
incuban
37ºC /24-48
hrs
Determinar el NMP
En un tubo con 5 mL
de Caldo Nutritivo se
agregan 5 mL de la
muestra de agua
Incubar de 24-48 hrs a
37ºC
Si el tubo esta turbio
se siembra en Agar
Cetrimida
Se realizan pruebas
bioquímicas para
Identificar
Pseudomonas
MUESTRA DE AGUA
2 cajas se
incuban
25ºC /24-48
hrs
58. 7.7 RESULTADOS
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA.
NOMBRE DE LA PRÁCTICA ANALISIS BACTERIOLÓGICO DELAGUA
Fecha de la Práctica No. de Práctica
NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
MUESTRA TOMADA EN:
Fecha/Lugar de la toma.
APARIENCIA
MESÓFILOS AEROBIOS UFC/mL UFC/mL Promedio.
Caja 01
Caja 02
NUMERO MÁS PROBABLE
NMP
Cambios después de la Incubación
No. de Serie 24 hrs 48 hrs 72 hrs
01
02
03
59. Pseudomonas spp.
Medio de Cultivo Morfología colonial
Ready Cult
Turbidez y cambio de color Fluourescencia Prueba del Indol
CONCLUSIONES.
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
FIRMA DE REVISIÓN
61. BIBILOGRAFIA:
1
FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS. 7ª ed. Secretaría de Salud.
México, 2000
3
BRADSHAW, Jack. “Microbiología de Laboratorio”. Editorial El Manual Moderno. México, DF.
1990
4
MANUAL DE TRATAMIENTO DE AGUAS. Departamento de Sanidad del Estado de Nueva
York, Albany. 8ª ed. Editorial Limusa. México, DF. 1990
5
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-113-SSA1-1994. “Método para la cuenta de
microorganismos Coliformes totales en placa”.
6
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-112-SSA1-1994. “Determinación de bacterias Coliformes.
Técnica del número más probable”.
7
RHEINHEIMER, Gerhard. “Microbiología de las Aguas”. Editorial Acribia. Zaragoza, España.
1990.
8
NORMA 7
OFICIAL MEXICANA. NOM-092-SSA1-1994. “Método para la cuenta de bacterias
aerobias en placa”.
62. Productos Farmacéuticos No Estériles.
Objetivo.
Conocer y manejar los procedimientos establecidos en la Farmacopea de los Estados
Unidos Mexicanos a través de su ensayo en productos farmacéuticos no estériles para
asegurar la calidad de estos.
Introducción.
Los productos farmacéuticos considerados como no estériles que se fabrican son:
tabletas, grageas, cápsulas, comprimidos, supositorios, óvulos, jarabes, elixires,
emulsiones, suspensiones, cremas, geles, pomadas, ungüentos, soluciones, y deben de
cumplir con las buenas prácticas de fabricación.
La presencia de una gran variedad de levaduras, hongos y bacterias en productos
farmacéuticos pueden ocasionar una serie de problemas como: la descomposición del
principio activo, ruptura de la emulsión, cambios en el color, olor y consistencia,
y daños al paciente.
Cada materia prima presenta características independientes y dependiendo de su
origen (animal, vegetal y/o sintético) son aprovechadas por los microorganismos
como sustratos. En estas materias primas las bacterias, hongos y levaduras pueden:
Mantenerse viables.
Desarrollarse.
Ha de saberse que cada una de las materias primas presenta diferentes límites
microbianos, tal y como se demuestra en la farmacopea indicada.
Por otra parte los análisis microbiológicos deberán de ser minuciosos y brindar una
cuantificación del estatus microbiano de la muestra obtenida.
La importancia de la presencia de microorganismos en los productos no estériles
debe ser evaluada en términos de uso y de la naturaleza del medicamento. La USP
sugiere que cierta categoría de productos sean analizados de rutina para determinar
cuenta total microbiana y contaminantes microbiológicos específicos.
Las formas farmacéuticas no estériles deben de cumplir con normas oficiales NOM-059
-SSA1-1994, NOM-073-SSA1-1993; respecto a la cantidad y tipo de microorganismos que
puedan contener. Los requisitos generales de calidad microbiológica son los
siguientes:
63. Cuenta Total de Bacterias mesófilas aerobias
Cuenta Total de Bacterias anaerobias
Cuenta Total de Hongos y Levaduras
Identificación de Microorganismos Patógenos Objetables
Materiales.
Equipo:
Baño Maria
Estufa bacteriológica
Refrigerador
Autoclave
Microscopio óptico
Instrumentos de vidrio
Pipeta graduadas de 1 y 10 ml estériles.
Probeta graduada de 100 ml estéril
Porta objetos y cubre objetos
Medios de cultivo
Botella de dilución con 90 ml de caldo soya tripticaseína
Botella de dilución con 90 ml de caldo tioglicolato
Agar soya tripticaseína
Agar dextrosa Saboraud
Agar Sales Manitol
Agar MacConkey
Agar Cetrimida
Agar Letheen
Reactivos
Safranina
Lugol
Cristal violeta
Aceite de inmersión
Azul de algodón
Agua destilada
Buffer de fosfatos pH= 7.2
Solución salina fisiológica
64. Diagrama de trabajo
Dilución de la -muestra.
Muestra
Revisar estado Físico
Muestras viscosas calentar
en baño maría a 45 C
Pesar o medir el
equivalente a 10 g o 10 m.
Colocar una muestra en
cada uno de los caldos:
soya tripticaseína y
Tioglicolato.
Identificar cada uno de
los caldos
Reservar el caldo soya
tripticaseína
Incubar 37 C por un
periodo de 24-72 h
Revisar cada 24 h y
registrar cambios
65. Mesófilos aerobios, Hongos y Levaduras; Microorganismos Objetables.
Botella de Dilución
Caldo Soya Tripticaseína
Hongos y Levaduras Mesófilos aerobios Microorganismos
objetables
Tomar 0.1 de la muestra y
estriar en cada uno de los
medios
Tomar 4 ml del caldo
soya tripticaseína
Tomar 4 ml del caldo
soya tripticaseína
Adicionar de 20 a 25 ml
de medio dextrosa-
Saboraud fluido (45 C)
Colocar cada 1 en
cada una de las 4
cajas petri estériles
Agar Sales-Manitol
Agar MacConkey
Agar Cetrimida
Agar Salmonella-Shigella
Colocar cada 1 en
cada una de las 4
cajas petri estériles
Rotular cajas petri e
incubar:
37 C/24-48 h
Adicionar de 20 a 25 ml de
medio Cuenta Estándar
fluido (45 C)
Homogeneizar la
muestra, Dejar
gelificar
Homogeneizar la
muestra, Dejar
gelificar
Si existe
crecimiento:
Identificar colonias
y realizar pruebas
bioquímicas primarias
y secundarias.Rotular cajas petri e
incubar:
2 cajas a 37 C/24 h
2 cajas a 25C/1 semana
Rotular cajas petri e
incubar:
2 cajas a 37 C/24 h
2 cajas a 25C/24 h
Realizar conteo,
obtener promedios
Realizar conteo,
obtener promedios
66. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA.
NOMBRE DE LA PRÁCTICA PRODUCTOS FARMACEÚTICOS NO ESTÉRILES
Fecha de la Práctica No. de Práctica
NOMBRE DE LOS ANALISTAS
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
NOMBRE
LOTE
CODIGO
FECHA DE RECEPCIÓN
AISLAMIENTO
TIPO DE MEDIO 24 48 72 96
CALDO SOYA-
TRIPTICASEÍNA
CALDO
TIOGLICOLATO
MESÓFILOS AEROBIOS UFC/mL UFC/mL Promedio.
Caja 01
Caja 02
HONGOS Y LEVADURAS UFC/mL UFC/mL Promedio.
Caja 01
Caja 02
PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRIMARIAS
GRAM INDOL ( NITRITOS ( ) LISINA (
67. ) )
O/F
( )
RM (
)
NITRATOS ( ) ORNITINA (
)
CATALASA (
)
VP (
)
H2S (
)
ARGININA ( )
OXIDASA
( )
CITRATOS ( ) GAS (
)
FENILALANINA (
)
MOTILIDAD (
)
MALONATOS (
)
UREA (
)
NOMBRE DE LA PRÁCTICA PRODUCTOS FARMACEÚTICOS NO ESTÉRILES.
COAGULASA (
)
NOV 5μg
( )
BACITRACINA 0.04 UI (
)
BILIS ESCULINA (
)
HIPURATO (
)
NaCl 6.5%
( )
CAMP
( )
OTRAS PRUEBAS
Carbohidratos
GLU ( ) SAC ( ) FRUC ( ) LAC (
)
MAN ( ) RAM ( ) TRE (
)
XIL (
)
ARA ( ) ADO ( ) MEL ( ) SOR (
)
DUL (
)
MNL ( ) RAF (
)
SAL ( )
Otros carbohidratos:
MICROORGANISMO IDENTIFICADO.
69. 9 PRODUCTOS FARMACÉUTICOS ESTÉRILES
9.1 INTRODUCCIÓN
Un producto farmacéutico estéril es el que se encuentra libre de microorganismos y
pirógenos, y cuando es administrado no ocasiona una respuesta adversa por
contaminación microbiológica. En este tipo de productos se eliminan todas las formas
viables de microorganismos, por la realización de un proceso de esterilización en el cual
las células microbianas o sus componentes se remueven o destruyen, de tal modo que ya
no son detectables en medios de cultivo adecuados para su proliferación. Un requisito
fundamental para todo producto estéril es que tenga la máxima calidad y ofrezca la mejor
seguridad al paciente. Los productos farmacéuticos estériles son diversos como:
inyectables (sueros, soluciones, nutritivas, ampolletas, intramusculares, subcutánea,
intravenosa), sólidos estériles (polvos liofilizados para inyectables), ungüentos (óticos y
oftálmicos), líquidos (oftálmicos), etc. 1
La Norma Oficial Mexicana 056-SSA1-1993, establece una serie de características
sanitarias que un área de proceso para productos farmacéuticos debe cumplir, tales
características son: superficie adecuada (espacio suficiente para trabajar y limpiar
cómodamente), acabados sanitarios (superficies lisas, eliminando ángulos de 45° y que
resistan la acción de los sanitizantes), ventilación apropiada (aire filtrado por filtros
absolutos de ser requerido), extracción eficiente (donde se genere calor, gases y/o
vapores) e iluminación suficiente (natural o artificial).2,3
Las guías de la FDA (Federal Drug Administration) describen el procesamiento aséptico
como un proceso en que el producto, contenedor y tapones son sujetos a procesos de
esterilización, sin embargo, al ser estas operaciones separadas, tienen sus
correspondientes consecuencias (como riesgo de contaminación) debido a que no hay
cercanía entre un proceso y otro para mantener la esterilidad del producto y en
contenedor final.
El término de área aséptica se define de manera sencilla como: “Zona comprendida
dentro de un área limpia, diseñada y construida para minimizar la contaminación por
partículas viables y no viables, manteniéndola dentro de límites preestablecidos”4
. Esta
área cuenta con un ambiente microbiológico controlado, y está diseñada de tal forma que
permita una limpieza fácil y eficiente.
1
TESIS. “Auditorias Técnicas en la Industria Farmacéutica”. Alejandra Manzano Montiel. FESC,
2004
2
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. “Buenas Prácticas de Fabricación para
Establecimientos de la Industria Químico Farmacéutica dedicados a la Fabricación de Medicamentos”.
3
GUIA DE PRÁCTICAS ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS LIMPIOS. CIPAM. Monografía
Técnica No. 1. México DF, 1989.
4
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. “Buenas Prácticas de Fabricación para
Establecimientos de la Industria Químico Farmacéutica dedicados a la Fabricación de Medicamentos”.
70. 9.1.1 CLASIFICACIÓN DE LAS ÁREAS ASÉPTICAS
Las áreas asépticas se clasifican en grado A, B, C y D de acuerdo con las características
requeridas del aire. Ésta clasificación se representa en la Tabla 9-1
Tabla 9-1 Clasificación de los tipos de área aséptica usadas en la fabricación de productos farmacéuticos
estériles.
Para controlar el nivel de contaminación microbiana de las distintas zonas de
funcionamiento, deben monitorizarse las áreas (Ver práctica “Monitoreo Ambiental”).
Cuando se realicen operaciones asépticas, la monitorización debe ser frecuente utilizando
métodos como placas de sedimentación, muestreo volumétrico del aire y de superficies
(por ejemplo, hisopos y placas de contactos). Los resultados del monitoreo deben
estudiarse al revisar la documentación del lote para la liberación del producto terminado.
Las superficies y el personal deben supervisarse tras las operaciones críticas. También es
necesario realizar un monitoreo microbiológico después de la validación de sistemas,
limpieza y desinfección, etc. Este monitoreo es adicional y distinto al que se lleva de rutina
en la producción
9.1.2 AREAS DE FABRICACIÓN DE MEDICAMENTOS
La fabricación de medicamentos está sujeta a requisitos especiales para minimizar los
riesgos de contaminación microbiana, de partículas y de pirógenos. La garantía de calidad
reviste una importancia especial y esta fabricación debe seguir estrictamente métodos de
preparación y procedimientos establecidos y validados cuidadosamente. La confianza en
la esterilidad u otros aspectos de la calidad no debe basarse exclusivamente en un
proceso final o en los ensayos sobre un producto terminado.
Las diversas operaciones de preparación de los componentes, preparación del producto y
llenado deberán realizarse en zonas separadas dentro de la zona limpia.
Las operaciones de fabricación se clasifican en dos categorías: aquellas en que el
producto se esteriliza al final y aquellas que se realizan asépticamente en todas o
alguna de sus partes.
71. 9.2 PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS
9.2.1 PRUEBAS DE IRRITABILIDAD
9.2.1.1 Pruebas de Irritabilidad para Medicamentos de Uso Oftálmico.
Los productos oftálmicos son preparados estériles de acuerdo a las buenas prácticas de
manufactura para garantizar su seguridad y efectividad por lo que deben cumplir con la
prueba de irritabilidad. Esta prueba se debe realizar no solo a colirios y pomadas
oftálmicas sino también, a aquellos medicamentos de uso tópico que accidentalmente
puedan introducirse al ojo (ungüentos, cremas o soluciones que se apliquen en la cara).
Se basa en la evaluación de las reacciones oculares observadas después de la
administración del producto oftálmico. Para la realización de la prueba se utilizan conejos
albinos, adultos, sanos, de cepa adecuada y cuyo peso debe estar entre 1 a 3 Kg. Se
deben mantener en jaulas individuales y aisladas, en condiciones de ventilación,
temperatura, iluminación controlada. Los animales se deben emplear con una frecuencia
no mayor de dos veces por semana, separando los ensayos consecutivos por un mínimo
de tres días. Se aplican en el ojo derecho de cada uno de los conejos, 3 o 4 gotas del
producto oftálmico en estudio y en el ojo izquierdo, el cual se toma como control, se aplica
solución isotónica de cloruro de sodio estéril. Se observa la reacción del ojo a los 5
minutos y a las 24 horas, después de la aplicación de unas gotas de fluoresceína en los
dos ojos, detectando la respuesta con la ayuda de una lámpara de luz ultravioleta
5
.
Además de estas pruebas realizadas in-vivo se pueden realizar técnicas in vitro en
huevos fertilizados (se mide la irritación de la membrana coriónica después de administrar
el medicamento), y existe la medición de la irritación de la cornea en ojos de ternera
recién sacrificada. Todas estas técnicas se encuentran en la NOM-039-SSA1-1993
Aunado a la técnica realizada en conejos, se puede realizar pruebas de irritabilidad en piel
de cobayos, e incluso se encuentran pruebas realizadas en piel de humano (prueba del
parche)6
.
9.2.1.2 Prueba de esterilidad.
Las pruebas de esterilidad tal como están descritas en la farmacopea, son adecuadas
para revelar la presencia de formas viables de bacterias, hongos y levaduras. No
contempla la realización de pruebas específicas para detectar virus, ya que estas
técnicas, para su cultivo son muy complicadas y están limitadas a la detección de algunas
especies. Todos los lotes de productos inyectables en sus envases finales deben
probarse en cuanto a su esterilidad. La USP XXV describe los requerimientos oficiales
que se deben cumplir. La FDA usa esos requerimientos como guía para probar productos
estériles no oficiales. La prueba oficial principal se realiza por el método de la filtración,
pero se utiliza transferencia directa si la filtración por membrana es inadecuada. Esta
prueba no pretende ser una evaluación definitiva para un producto sometido a un proceso
de esterilidad de eficacia desconocida, sino que está concebida en mayor medida como
5
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. “Determinación de los Índices de Irritación Ocular,
Primaria Dérmica y Sensibilización”
72. una prueba para verificar la probabilidad de que un procedimiento de esterilización
convalidado con anterioridad se haya repetido, o para asegurar la continuidad de su
eficiencia. Al realizar la prueba de esterilidad a un determinado número de unidades de un
lote, si los resultados obtenidos son negativos, indican que la probabilidad de encontrar
unidades contaminadas en la parte no analizada, es menor al nivel detectable señalado
en los planes de muestreo utilizados. Ningún plan de muestreo puede asegurar que todas
las unidades del lote se encuentren libres de microorganismos, por lo que la garantía de
que el producto sea estéril, se logra mediante la validación del proceso de esterilización.
La sensibilidad de esta prueba se ve afectada por la naturaleza del medio de crecimiento,
por lo tanto debe realizarse utilizando medios de cultivo altamente nutritivos para que
favorezcan el desarrollo de todos los microorganismos y esporas presentes en la muestra.
Estos medio deben ser según la USP de caldo tioglicolato, apropiado para bacterias y el
digerido de soya Tripticaseína para hongos y levaduras. Durante el desarrollo de la
prueba esterilidad se deben tener las precauciones necesarias que eviten la
contaminación de la muestra para que esta mantenga sus características microbiológicas
originales.
Una vez preparados y esterilizados los medios de cultivo y antes de ser utilizados, tienen
que ser sometidos a un proceso de control de calidad para confirmar que realmente hayan
quedado estériles y que no pierdan su capacidad de promover el crecimiento bacteriano.
Si después de incubar los tubos de tioglicolato a 30-35 °C y los de digerido de soya
Tripticaseína a 20-25 °C durante un período de 7 días, no presenta turbidez, se
comprueba la esterilidad de los medios.
La prueba de esterilidad es aplicable a medicamentos, materias primas, materiales de
curación y productos de uso clínico. Los medicamentos que deben ser estériles cuando el
paciente adquiere son los parenterales, los oftálmicos y los óticos. La calidad
microbiológica de esos productos farmacéuticos por dos técnicas:
9.2.1.3 Método de siembra directa
Se aplica a productos que no contengan inhibidores del desarrollo bacteriano y todos
aquellos que permitan apreciar fácilmente el crecimiento microbiano en los tubos,
después del período de incubación. Los ungüentos o líquidos oleosos, deberán esparcirse
y los sólidos deberán disolverse en diluyentes estériles que no inhiban el desarrollo
bacteriano y con esta solución se realizan los inóculos correspondientes. La prueba de
esterilidad para gasa, algodón, y otros implementos quirúrgicos, debe realizarse lavando
el material con solución isotónica estéril la cual después de arrastrar los microorganismos,
se siembra en los medios especificados. La cantidad del inóculo y de medio dependerá
del contenido del envase, pero nunca será inferior a 1 ml y 15 ml respectivamente. Los
tubos de tioglicolato inoculados se incuban durante 14 días a 30-35 °C y los de digerido
de soya Tripticaseína a 20-25 °C6
.
6
PRADEU. “Análisis Químicos Farmacéuticos de Medicamentos”. Editorial Limusa. México
DF.1998
