1. Tema 17 Reacciones multisustrato
Reacciones enzimáticas con dos sustratos
1. Introducción
2. Nomenclatura
3. Reacción enzimáticas con 2 sustratos y 2 productos.
4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción:
Ecuaciones con dos substratos
4.1. Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar.
4.2. Mecanismo Secuencial Bi Bi ordenado.
4.3.Mecanismo Bi BiPing-Pong
2. Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos de transformación
enzimática de un sustrato en un único producto.
Sin embargo, en los sistemas biológicos, son casos excepcionales,
restringidos a reacciones de isomerización.
Las reacciones enzimáticas que implican a más de un sustrato,
transformándolos en varios productos son las más frecuentes.
1.Introducción
S + E <==> ES <==> EP <==> E + P
- Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas:
- Por ejemplo:
A + B P + Q
3. Adenilato ciclasa
Citrato sintasa
Alcohol-DH
Malato-DH
Ribitol-DH
Lactato-DH
Coenzima-A transferasa
Glutamato-alanina transaminasa
Glucosa oxidasa etc. ....
Estudio cinético:
A) Velocidad inicial
B) Depender la velocidad de la reacción de uno solo de los
reactantes (Resto saturación).
Reacción orden cero con respecto todos los substratos menos uno
SK
S
Vv
`
`max
4. a) En cuanto al número de sustratos y productos:
Reacción Nombre
A -----> P Uni-Uni
A + B -----> P Bi-Uni
A + B + C -----> P + Q Ter-Bi
A + B -----> P + Q Bi-Bi
b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los
productos:
* Reacciones secuenciales:
- al azar
- ordenadas
* Reacciones de desplazamiento:
- Ping-Pong
2. Nomenclatura
5. De acuerdo con la simbología de Cleland, el progreso de la
reacción se simboliza por una línea horizontal.
El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser
bastante complicado a la hora de representar los esquemas de
las reacciones
A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero el
que más éxito ha tenido ha sido el propuesto por Cleland.
La entrada de sustratos y la salida de productos se representan
por flechas verticales que indican la dirección de entrada o
salida de la reacción.
- Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos
concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos
y se forman 2 productos:
6. E EEA E
A P
EB
B Q
E EEA EAB
A B
EQ
P Q
EPQ
Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong
Secuencial: Bi-Bi ordenada
7. ¿Se atreve a nombrar los siguientes mecanismos?
E E
A B P QCa)
E E
A B C QPb) R
E E
A B CQPc) R
8. Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi:
A + B --- P + Q
-Mecanismos secuenciales
- al azar
- ordenadas
- Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento
3. Reacciones enzimáticas de dos sustratos y dos productos
9. A) Mecanismos secuenciales,
Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se
libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo
ternario EAB o EBA debe formarse como requisito
indispensable antes de que se produzca la formación de
productos.
La formación del complejo ternario es independiente del
orden de unión de los sustratos.
Este tipo de reacciónes se denominan
reacciones secuenciales al azar,
La formación del complejo ternario debe producirse en un
orden determinado para que el complejo sea productivo
desde el punto de vista catalítico.
Este tipo de reacción se denomina
reacciones secuenciales ordenadas).
10. Analicemos, desde el punto de vista esquemático, estos dos tipos
de reacciones secuenciales.
Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico:
E + A <=> EA
E + B <=> EB
EAB <=> EPQ
EQ <=> E + Q
EP <=> E + P
B
A
P
Q
Bi-Bi al azar
E + A <==> EA + B <==> EAB <=> EPQ <==> EQ + P <==> E + Q
Bi-Bi ordenado
11. Utilicemos ahora la simbología o nomenclatura de Cleland:
Bi-Bi al azar
E E
A B
EA
B A
EB
EAB
Q
QP
P
EP
EQ
EBA
EPQ
EQP
Bi-Bi ordenada
E EEA EAB
A B
EQ
P Q
EPQ
12. E EEA
A B
EQ
P Q
- Un caso especial, es el siguiente:
- Este mecanismo se conoce como “Mecanismo de Theorell-Chance”, y en realidad es
un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB ni
EPQ
La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrámeroque contiene zinc en el
centro activo y que cataliza la oxidación de etanol) por el coenzima
nicotinamina adenina dinuclótido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido
13. B) Mecanismo “ping-pong” o de doble desplazamiento
E + A <=> EA <=> E + P +B <=> EB <=>EQ <==> E + Q
- Este tipo de mecanismo es muy común en las reacciones en las
que un grupo químico se transfiere desde el sustrato A al B, es
decir en reacciones de transferencias.
En este tipo de mecanismo, tras la unión del primer sustrato se
libera uno de los productos, en una reacción parcial en la que se
genera una forma modificada de la enzima.
(acil enzimas, fosforil enzimas)
Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formación del
segundo producto con regeneración de la forma nativa de la
enzima.
14. * Utilizando la simbología de Cleland, en el caso de reacciones
Ping-Pong, tenemos:
E EEA E
A P
EB
B Q
Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong,
o tetra-Uni Ping Pong
15. ¿De acuerdo con la nomenclatura de Cleland, cómo nombraría la
siguiente reacción?
EE
Succinil-CoA
HSCoA
Pi
Succinato
GDP
GTP
Succinil-E E-P
16. 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción:
Ecuaciones con dos substratos
Las condiciones de partida para derivar la ecuación de velocidad con dos o
más sustratos son las mismas que hemos utilizados para la derivación de la
ecuación de velocidad en un sistema sencillo: S --> P
a) Supondremos la formación de un equilibrio rápido:
entre la E y los S
b) La ec. de conservación nos dice que (Eo) = al sumatorio de
todas las especies químicas en las que pueda encontrarse la
enzima:
(Eo) = (EXi)
c) Supondremos la existencia de condiciones de estado
estacionario
17. 4.1 Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar.
B A
E + P+ Q
v = kcat [EAB=EBA]
EABEBEAEE
EBA
BEB
K
EAB
BEA
K
EB
BE
K
EA
AE
K
T
MM
BA
BAAB
AB
BA
M
M
B
A
K
K
K
K
A + B P +Q
E
A B
EA
EB
EAB kcat
KA
KB
KM
AB
KM
BA
EBA
KM
es la concentración de Substrato
en el cual v=1/2 Vmax cuando
el otro substrato está saturante
18. E
A B
EA
EB
EAB
kcatKA
KB
KM
AB
KM
BA
EBA
AMBA
T
T
AM
M
M
KK
BA
E
K
B
E
K
A
EEE
EABEBEAEE
KK
BA
EEAB
K
BEA
EAB
EAB
BEA
K
AB
AB
AB
AB
][
][
E + P+ Q
AB
MAKK
BA
Ekcatv
BAKBKAKK
BA
Ekcatv BAABAB
MMMA
T
Ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar
v = kcat [EAB]
19.
BAKBKAKK
BA
Ekcatv BAABAB
MMMA
T
BAKBKAKK
BA
Vv BAABAB
MMMA
max
Vmax = kcat [ET] Concentraciones saturante de A y B
ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA
Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar
20.
BAKBKAKK
BA
Vv BAABAB
MMMA
max
Constante [A]
AK
AKK
K
AK
AV
V
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max
´max
Un substrato constante pero no saturante
Ver anexo 1
BK
B
Vv
´
´max
21. Igual se hace para [B] constante pero no saturante
BAKBKAKK
BA
Vv BAABAB
MMMA
max
AK
A
Vv
´
´max
BK
BKK
K
BK
BV
V
AB
BA
AB
M
BM
M
´
max
´max
Constante [B]
23.
AK
AKK
K
BK
BV
V
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max
´max
[B] se hace muy grande, --> , condición de saturación
Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten
Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante
BAKBKAKK
BA
Vv BAABAB
MMMA
max
AK
A
Vv AB
M
max
AB
AB
M
M
K
A
AK
K
V
B
BV
V
´
max
max
´max
[B] Muy
grande
24. [A] se hace muy grande, --> , condición de saturación
Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten
Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante
BAKBKAKK
BA
Vv BAABAB
MMMA
max
BK
B
Vv BA
M
max
BA
BA
M
M
K
B
BK
K
V
A
AV
V
´
max
max
´max[A] Muy
grande
BK
BKK
K
AK
AV
V
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max
´max
25. 4.2. Mecanismo secuencial Bi-Bi ordenado
QPEEABBEAAE
KA KmAB kcat
EABEAEE
EAB
BEA
Km
EA
AE
K
T
AB
A
v
BAKAKK
BA
Ekcatv ABAB
MMA
T
V=kcat[EAB]
BAKAKK
BA
Vv ABAB
MMA
max
26. Constante B
BAKAKK
BA
Vv ABAB
MMA
max
BK
KK
K
BK
BV
V
AB
AB
AB
M
MA
M
`
max
`max
Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B
[B]
Vmax
AK
A
Vv
`
`max
V`max
Regresión No-linear
Vmax
KM
AB
K`
[B]
KA
27. Constante A
BAKAKK
BA
Vv ABAB
MMA
max
BK
B
Vv
`
`max
AB
AB
M
MA
K
A
KK
K
VV
`
max`max
K`
KM
AB
[A]
Pendiente es igual:
KA KAB
ORDEN DE UNÓN DE SUBSTRATOS EN UN MECANISMO
BIBI ORDENADO:
Cálculo de la Velocidad máxima haciendo constante un substrato:
Una relación de substrato concentración idependiente frente a valor
de Vmax indica que es el primer substrato que se une a la enzima
28. 4.3. Mecanismo Bi Bi Ping-Pong
No hay complejo ternario
k1 k2 k3 k4
E +A EA P + E* + B E*B E +
Q k -1 k-3
O con la nomenclatura de Cleland:
E EEA E*
A P
E*B
B Q
- Consideraremos velocidades iniciales unidireccionales.
KM
A KM
B
29. k1 k2 k3 k4
E +A EA P + E* + B E*B E + Q
k -1 k-3
KM
A KM
B
La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB
v = k4 [E*B]
BEEEAEE
BE
BE
k
kk
K
EA
AE
k
kk
K
T
B
M
A
M
**
´
*
3
43
1
21
Las constantes de Michaelis y el balance de masas en el estado estacionario
4kkcat
30.
2
4
2
4
1
max
k
k
BAAKBK
k
k
BAV
v
B
M
A
M
Despejando [E*B]de las ecuaciones anteriores
ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO
BI BI PING PONG
2
4
42
4
k
k
kk
kkcat
BAAKBK
BAV
v B
M
A
M
max
Paso limitante
31. Constante B
BAAKBK
BA
Vv BAAB
MM
max
BK
BK
K
BK
BV
V
B
A
B
M
M
M
`
max
`max
Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B
[B]
Vmax
AK
A
Vv
`
`max
V`max
Regresión No-linear
Vmax
KM
B
K`
[B]
KM
B
KM
A
KM
B
32. Constante A
AK
A
Vv
`
`max
AK
AK
K
AK
AV
V
A
B
A
M
M
M
`
max
`max
BAAKBK
BA
Vv BAAB
MM
max
[B]
Vmax
V`max
K`
KM
A
KM
B
KM
A
Regresión No-linear
Vmax
KM
A
35. Inhibición por productos
Diferentes tipos de inhibición por producto en las reacciones
que transcurren con dos substratos y dos productos
Mecanismo Inhibidor Substrato
A
(B saturante)
Substrato
B
(A saturante)
Bi-Bi ordenado P
Q
Acompetitiva
Competitiva
No competiva
------------------
Ping Pong P
Q
Competitiva
-----------------
------------------
Competitiva
Bi-Bi al azar P
Q
No competitiva
No Competitiva
No competitiva
No competitiva
A + B --- P + Q
36. RESUMEN
Los conceptos utilizados para la obtención de datos cinéticos en reacciones monosubstratos
,son útiles para el estudio de las reacciones más complejas, con más de un substrato y más
de un producto de reacción, si se hace depender la reacción de un solo reactante y los
demás permanecen a concentraciones saturantes, es decir, la reacción será de orden cero
con respecto a todos los reactantes menos uno.
En el caso de reacciones bisustratos puede distinguirse si la reacción tiene lugar mediante
un complejo ternario, o si el enzima queda modificado al reaccionar con el primer substrato
(mecanismo Ping Pong). En el caso de formación de un complejo ternario puede obtnerse
al azar (mecanismo BiBi al azar) o de manera ordenada (mecanismo Bi-Bi ordenado).
Se han deducido la s ecuaciones de velocidad y la forma de obtener las constantes
cinéticas que describen el proceso enzimático.
La inhibición por los productos P y Q puede servir para discriminar mecanismos
probables de reacción.
En general la información cinética puede ayudarnos para comprender propiedades
locales de las enzimas, necesarias parea entender el control de la actividad enzimática y
el papel de una enzima en el proceso de metabolismo celular.
37. Anexo 1
BAKBKAKK
BA
Vv BAABAB
MMMA
max
A constante
B
AK
AKK
B
AK
V
v
B
AK
KAKK
B
AK
V
v
AK
BAKKAKK
B
AK
V
v
AK
BAKBKAKK
B
AK
V
v
BAKBKAKK
BA
Vv
BA
ABBA
BA
ABABBA
BA
BAABABBA
BA
BAABABBA
BAABAB
M
AMM
M
MMAM
M
MMMAM
M
MMMAM
MMMA
)(
max
max
)(
max
max
max
AK
AKK
K
AK
AV
V
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max
´max
Se divide
BK
B
Vv
´
´max
38. PROBLEMAS.
1. Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma
AX +B Bx + A
Fue investigada a temperatura, pH y concentración de enzima constante
dejando constante la concentración de B, y variando la concentración de
substrato AX. Los resultados obtenidos.
INICIAL [AX] [B]=2.0mM 4.0 mM 6.0 mM
2.0 250 286 300
2.5 278 323 341
3.3 313 371 395
5.0 357 435 469
10.0 417 526 577
¿Qué tipo de mecanismo cursa esta reacción bisustrato?
