U.F.R Médicale de Paris Ile-de-France Ouest
Année 2013
Mémoire
pour l’obtention du Diplôme d’Étude Spécialisé Complémentai...
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TABLE DES MATIERES
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RÉSUMÉ
Les méthodes de diagnostic rapide des aneuploïdies se sont largement développées avec notamment
l’utilisation de ...
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I. INTRODUCTION
La mise en place du diagnostic prénatal en France remonte au début des années 70. Ce sont les travaux
d’...
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III. MATÉRIEL ET MÉTHODES
A. Organisation
La mise en place de la technique Karyolite BoBs dans le service a été discutée...
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Sur chaque bille sont fixés trois BACs correspondant à la région d’intérêt. Pour un chromosome, il y a donc
quatre bille...
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2. Déroulement de la technique
Pour chaque technique, l’ADN des patients et des ADN de références masculins et féminins ...
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D. Vérification en FISH
Pour les premières techniques, une vérification en FISH a été effectuée pour les cas d’aneuploïd...
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IV. RÉSULTATS
A. Prélèvements
1. Nombre de prélèvement
Durant la période d’étude entre juillet 2012 et juillet 2013, 997...
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Dans le cas des prélèvements de villosités choriales, la présence de signes d’appel échographique tels qu’un
hygroma, u...
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4. Indications des FISH
Le tableau 3 présente les indications et le nombre de FISH directes effectuées selon le schéma ...
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B. Résultats des examens directs
Résultats BT directe
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Les tableaux 4, 5 et 6 présentent les résultats pour les trois techniques de diagnostics directs. Pour la
technique de ...
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Les profils obtenus pour les aneuploïdies impliquant le chromosome 13 sont également faciles à interpréter
(Figure 7). ...
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Dans certaines situations, nous avons analysé les résultats avec les différentes références : références M et
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Figure 11. Profil d’un syndrome de Klinefelter à gauche et d’un homme double Y à
droite.
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3. Anomalies particulières
a) Madame M, échantillon 139
Madame M est une patiente âgée de 37 ans. Elle a déjà accouchée...
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Figure 14. Caryotypes obtenus après culture des cellules amniotiques confirmant la délétion 22qter.
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b) Madame Y, échantillon 703
Madame Y est une patiente âgée de 39 ans, G3P1. Elle a accouchée d’une première fille en 2...
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Le caryotype des parents a été réalisé. Le caryotype du père était normal. Le caryotype de la mère a montré
la présence...
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c) Madame L, échantillon 742
Madame L est une patiente de 33 ans. Il s’agissait de la première grossesse du couple. Le ...
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Le caryotype fœtal obtenu après culture des cellules amniotiques et l’examen FISH avec les sondes
télomériques des bras...
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d) Madame MK, échantillon 909
Madame MK est une patiente âgée de 34 ans. La grossesse s’est déroulée sans particularité...
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Le caryotype a montré la présence de deux chromosomes 18 normaux et un chromosome 12 remanié avec
un dérivé 12 d’une tr...
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e) Madame G, échantillon 934
Madame G est une patiente âgée de 38 ans G2P1. Elle a eu une petite fille avec un premier ...
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Les examens complémentaires en FISH ont montré la présence d’un signal 4q sur un chromosome du
groupe E (Figure 31). En...
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RP11-22C6
Figure 33. Hybridation avec la sonde RP11-22C6 (18p11.3)
montrant la présence de trois signaux avec un signal...
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D. Faux Positifs et faux négatifs
1. Faux positif : madame K, échantillon 585
Madame K est une patiente de 36 ans G2P1 ...
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Figure 36. Deuxième profil obtenu
pour l’échantillon 585 en le testant à
nouveau dans une deuxième
technique.
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2. Faux négatif
a) Madame T, échantillon 744
Madame T est une patiente de 43 ans. Elle a bénéficié d’un diagnostic prén...
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c) Triploïdie XXY
Madame L, échantillon 170 est une patiente âgée de 32 ans. A l’échographie du 1er
trimestre, il exist...
32
3. Faux négatif et faux positif : madame C, échantillon 987
Madame C est une patiente 28 ans G2P0. Elle a eu une premiè...
33
Figure 43. Hybridation avec les sondes de
peinture chromosomique wcp8 (en vert) et wcp9
(en rouge) montrant que le déri...
34
V. DISCUSSION
A. Général
Les méthodes permettant un diagnostic rapide des aneuploïdies se sont largement développées de...
35
tandis que sur l’extrémité terminale du bras long du chromosome 22, les trois sondes sont situées à moins
de 4Mb du tél...
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technique de BoBs (Annexe 3, p.42). Actuellement, nous reconsidérons notre manière de faire et nous
proposons de réalis...
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probablement été viable à terme entraînant donc la naissance d’un enfant qui aurait présenté ensuite des
difficultés da...
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Bibliographie
1. Peter Harper. Interview André et Joelle Boué. (2005). at
<http://www.genmedhist.info/interviews/Boue%2...
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Annexes
Annexe 1. Protocole simplifié de la réalisation de la technique de BoBs.
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Numéro Vérification FISH Caryotype Corrélation
échantillon Autosomes Gonosomes
2 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 +
7 Nl D...
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718 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 +
730 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 +
738 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 +
739 Triso...
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Numero Caryotype Corrélation
147 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 +
159 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 +
162 Trisomie 18 Fé...
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Numero Caryotype Corrélation
37 45,XY,der(14;21)(q10;q10)pat +
67 46,XYY,der(13;14)(q10,q10)pat +
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Technique Karyolite BoBs : bilan d’un an d’utilisation en routine pour le diagnostic prénatal direct

  1. 1. U.F.R Médicale de Paris Ile-de-France Ouest Année 2013 Mémoire pour l’obtention du Diplôme d’Étude Spécialisé Complémentaire de Cytogénétique Humaine Technique Karyolite BoBs : bilan d’un an d’utilisation en routine pour le diagnostic prénatal direct Dr. Capucine Hyon Service de Génétique et d’Embryologie Médicales Hôpital Trousseau
  2. 2. 2 TABLE DES MATIERES RÉSUMÉ............................................................................................................................................................. 3 I. INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 4 II. OBJECTIF DU TRAVAIL................................................................................................................................ 4 III. MATÉRIEL ET MÉTHODES ...................................................................................................................... 5 A. Organisation .......................................................................................................................................... 5 B. Matériel d’étude.................................................................................................................................... 5 C. Technique BAC on Beads Karyolite........................................................................................................ 5 1. Principe général................................................................................................................................. 5 2. Déroulement de la technique............................................................................................................ 7 D. Vérification en FISH ............................................................................................................................... 8 IV. RÉSULTATS............................................................................................................................................. 9 A. Prélèvements......................................................................................................................................... 9 1. Nombre de prélèvement................................................................................................................... 9 2. Indications des prélèvements............................................................................................................ 9 4. Indications des FISH......................................................................................................................... 11 B. Résultats des examens directs ............................................................................................................ 12 C. Profils des anomalies........................................................................................................................... 13 1. Profils des trisomies autosomiques................................................................................................. 13 2. Profils des gonosomes anormaux.................................................................................................... 15 3. Anomalies particulières................................................................................................................... 17 D. Faux Positifs et faux négatifs............................................................................................................... 28 1. Faux positif : madame K, échantillon 585 ....................................................................................... 28 2. Faux négatif ..................................................................................................................................... 30 3. Faux négatif et faux positif : madame C, échantillon 987 ............................................................... 32 V. DISCUSSION ............................................................................................................................................. 34 A. Général ................................................................................................................................................ 34 B. Avantages ............................................................................................................................................ 34 C. Limites ................................................................................................................................................. 35 D. Coût de la technique............................................................................................................................ 36 VI. CONCLUSION ....................................................................................................................................... 37 Bibliographie.................................................................................................................................................... 38 Annexes ........................................................................................................................................................... 39
  3. 3. 3 RÉSUMÉ Les méthodes de diagnostic rapide des aneuploïdies se sont largement développées avec notamment l’utilisation de la FISH directe sur liquide non cultivé. De nombreux laboratoires utilisent maintenant la technologie Prenatal BoBs qui permet non seulement le diagnostic des aneuploïdies les plus fréquentes mais également celui de certains syndromes microdélétionnels. Nous avons mis en place dans notre laboratoire le diagnostic rapide par la méthode Karyolite BoBs qui repose sur la même méthode mais qui permet de faire le diagnostic des aneuploïdies de l’ensemble des chromosomes en rendant possible également celui des anomalies de structures déséquilibrées de plus ou moins grande taille. L’objectif du travail a été d’évaluer l’apport de cette méthode pour le diagnostic prénatal rapide en routine des aneuploïdies et des remaniements chromosomiques de grande taille pendant un an au laboratoire de cytogénétique. Sur les 997 prélèvements reçus au laboratoire, nous avons effectué 717 examens BoBs et 211 FISH directes ou examens directs de villosités choriales. Nous avons eu un taux d’échec <1% pour la technique de BoBs. Elle nous a permis d’identifier tous les cas d’aneuploïdies 13, 18 et 21 mais également les deux cas de trisomie 16. Nous avons mis en évidence cinq anomalies de structures déséquilibrées dont une anomalie qui n’était pas visible au caryotype. Nous avons eu deux faux positifs et cinq faux négatifs pour certains liés à une des limites de la technique, à savoir l’impossibilité de détecter les triploïdies. Le coût de cette technique est évalué à 90€ par diagnostic. Cette méthode nous offre la possibilité de réaliser un diagnostic rapide pour un grand nombre d’échantillon avec une diminution du temps technique et médical nécessaire. Elle nous permet également de faire le diagnostic de certaines anomalies de structure permettant ainsi une prise en charge plus rapide des patientes. Malgré son coût plus élevé, la technique Karyolite BoBs est une alternative intéressante à la pratique de la FISH grâce à son automatisation et au nombre de diagnostics qu’elle autorise. Son évaluation doit être poursuivie, notamment par rapport à d’autres techniques moléculaires susceptibles d’être utilisées de façon routinière en cytogénétique prénatale. Mots-clés : Karyolite BoBs, Prenatal BoBs, Diagnostic prénatal, Diagnostic rapide.
  4. 4. 4 I. INTRODUCTION La mise en place du diagnostic prénatal en France remonte au début des années 70. Ce sont les travaux d’André et Joëlle Boué à la fin des années 60 et au début des années 70 qui ont permis le développement du diagnostic prénatal chromosomique1 . En effet leurs travaux ont mené à la mise au point des techniques de cultures de cellules amniotiques. La possibilité de cultiver les cellules amniotiques a ensuite permis de réaliser des caryotypes à partir de ces cellules fœtales. Cette avancée importante a permis le développement du diagnostic prénatal pour les femmes ayant un risque élevé d’anomalie chromosomique, en particulier les femmes âgées puisque l’implication de l’âge dans la survenue de la trisomie 21 était à cette époque-là déjà bien connue2 . Par la suite, le développement du prélèvement des villosités choriales à un stade plus précoce de la grossesse a également été un grand pas dans l’histoire du diagnostic prénatal. En effet, en cas d’anomalie chromosomique, le prélèvement de villosité choriale offrait la possibilité de réaliser une interruption médicale de la grossesse à un stade plus précoce et souvent moins traumatisant pour la patiente et le couple. Cependant, la réalisation du caryotype à partir de cellules amniotiques, ou bien à partir de villosités choriales, nécessitait toujours un temps de culture de 7 à 10 jours pouvant parfois paraître long pour la patiente et le couple. C’est pourquoi, au début des années 90 s’est développé le diagnostic rapide des principales aneuploïdies3 . Ce développement a été rendu possible grâce à l’évolution des techniques de cytogénétique moléculaire. En effet, au cours des années 80 la cytogénétique moléculaire s’est développée avec l’utilisation de sondes permettant d’identifier des régions spécifiques du génome répétées ou uniques. Les premières sondes utilisées étaient des sondes radioactives donc difficiles à manier puis les sondes fluorescentes ont été mises au point permettant l’hybridation in situ fluorescente ou FISH (Fluorescente In Situ Hybridization). La FISH a tout d’abord été réalisée sur chromosome métaphasique et au début des années 90, l’utilisation sur noyau en diagnostic post natal puis en diagnostic prénatal s’est développée. Les premiers diagnostics rapides sur noyaux non cultivés ont été rapportés en 1992 par Klinger et al3 . La FISH sur noyau interphasique comportait plusieurs avantages : elle permettait d’obtenir un résultat rapide en 24 à 48h pour les principales aneuploïdies (21, 18, 13, X et Y) et elle nécessitait peu de matériel, puisque 2 à 3 ml de LA étaient suffisants pour obtenir un résultat fiable. Cette technique a été utilisée dans de nombreux laboratoires pour le diagnostic rapide des aneuploïdies en anténatal. Puis progressivement, des techniques de biologie moléculaires se sont développées pour le diagnostic rapide des aneuploïdies : QMPSF, PCR quantitative en temps réel, MLPA4 ... La technique de FISH s’est largement développée et est maintenant la technique de référence pour le diagnostic rapide des aneuploïdies les plus fréquentes 13, 18 et 21 ainsi que pour l’étude des chromosomes sexuels. En revanche, elle ne permet d’explorer que quelques chromosomes et ne met en évidence que certaines aneuploïdies. II. OBJECTIF DU TRAVAIL L’objectif principal du travail est d’évaluer l’apport du kit Karyolite BoBs (BAC on Beads) en anténatal pour le diagnostic rapide des aneuploïdies et des remaniements chromosomiques de grande taille pendant un an au laboratoire de cytogénétique de l’hôpital Armand Trousseau.
  5. 5. 5 III. MATÉRIEL ET MÉTHODES A. Organisation La mise en place de la technique Karyolite BoBs dans le service a été discutée au préalable avec les membres du Centre Pluridisciplinaire de Diagnostic Prénatal (CPDP) de l’Est Parisien. Le choix de réaliser deux séries par semaine en fonction des jours de prélèvements a été fait. Nous réalisons donc une série le lundi avec rendu du résultat le mardi et une série le jeudi avec rendu des résultats le vendredi. Tous les prélèvements de liquide amniotique ou de villosité choriale arrivant au laboratoire entre juillet 2012 et juillet 2013 ont eu un examen BoBs sauf pour les cas particuliers rapportés dans le tableau 1. En effet, le souhait de conserver un délai de réponse inférieur à 48h et d’utiliser un minimum de matériel pour l’examen direct a conduit à poursuivre la FISH directe dans certaines situations. Indication BoBs FISH Demande de FISH spécifique associée (4p, 5p, 12p) + Grossesse gémellaire + LA > 25SA Arrivée Lundi - Mardi - Jeudi + Arrivée Mercredi - Vendredi + B. Matériel d’étude L’ADN a été extrait à partir de 3 ml de liquide amniotique ou bien à partir d’une villosité choriale avec le kit d’extraction QIAamp DNA Mini Kit de chez QIAGEN selon la procédure recommandée par le fabricant. C. Technique BAC on Beads Karyolite 1. Principe général La technique de BoBs repose sur les propriétés de dénaturation et de réassociation spécifique des acides nucléiques utilisées en cytogénétique moléculaire en particulier pour la réalisation d’Hybridation In Situ (FISH) ou bien de puces à ADN. Dans le cas de la technique de BoBs, les BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) d’une taille d’environ 150 kb sont fixés sur des billes de polystyrènes (Figure 1). La technique Karyolite BoBs est une technique quantitative qui permet la recherche d’aneuploïdie mais également l’étude d’un bras entier ou bien des régions télomériques d’un chromosome. Chaque bille est colorée selon un gradient de concentration de deux colorants luminescents permettant d’obtenir un code couleur différenciant 100 types de billes différents (Figure 2). Tableau 1. Indications de la méthode d’examen direct en fonction de la demande des cliniciens. Figure 1. Aperçu de la bille de polystyrène avec les BACs fixés à la surface.
  6. 6. 6 Sur chaque bille sont fixés trois BACs correspondant à la région d’intérêt. Pour un chromosome, il y a donc quatre billes correspondant à quatre régions d’intérêt : une bille pour chaque télomère (bras court et bras long) et une bille pour chaque région péricentromérique de chaque bras (Figure 3), sauf pour les chromosomes acrocentriques où il n’y a que trois billes correspondant aux régions péricentromériques, intercalaires et terminales. Figure 2. Principe de la méthode de marquage des billes fluorescentes par deux fluorochromes différents permettant de différencier 100 billes. Figure 3. Représentation schématique de la localisation des BACs correspondant à la région d’intérêt pour chaque bille.
  7. 7. 7 2. Déroulement de la technique Pour chaque technique, l’ADN des patients et des ADN de références masculins et féminins sont analysés. Pour les ADN de référence, nous utilisons un pool d’ADN de patient du laboratoire ayant eu une Analyse Chromosomique sur Puce à ADN et qui était normale. Le déroulement de la technique est résumé dans l’annexe 1. a) Marquage Pour chaque échantillon et référence, 240 ng d’ADN (soit 24µl) sont marqués par une technique de « random priming » : 20 µl de Random Primers Mix sont ajoutés au 24 µl puis l’ensemble est chauffé à 98°C pendant 5 minutes et redescendu à 37°C. Ensuite, 5µl de Biotin-dNTP Mix et 1 µl de polymérase sont ajoutés à chaque échantillon et référence et incubé à 37°C pendant 60 à 90 min. L’ADN marqué est ensuite purifié sur une plaque de purification NucleoFast (Macherey-Nagel). L’ADN marqué est remis en suspension avec 25 µl de TE puis agité pendant 5 minutes. La concentration est ajustée à 175 ng/µl si nécessaire. b) Hybridation Pendant que l’ADN marqué est remis en suspension, un mix d’hybridation est préparé en mélangeant 11 µl d’Hybridization Buffer et 1 µl de Karyolite BoBs Mix pour un échantillon. Le mix est fortement vortexé pour mélanger parfaitement les billes. L’ADN de chaque échantillon est ensuite transféré dans une plaque PCR et 11 µl de mix d’hybridation sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite agitée pendant 5 min à 58°C puis la dénaturation est effectuée à 85°C pendant 5 min et l’hybridation se fait sur la nuit à 52°C et sous agitation continue. c) Révélation Après 16h à 20h d’incubation, chaque puits est lavé une première fois pendant 20 min à 50°C. En parallèle, le mix de reporter est préparé en mélangeant 0.45 µl de Reporter Concentrate qui contient la streptavidine avec 112.5 µl de Reporter Diluent par échantillon. Après une nouvelle étape de lavage, 100 µl de mix reporter est ajouté à chaque puits et la plaque est incubée à 37°C pendant 30 min avec une agitation à 1200 rpm. La plaque est à nouveau lavée pour éliminer l’excès de streptavidine. d) Lecture La lecture s’effectue à l’aide d’unautomate Luminex : un premier laser rouge excite les deux colorants de chaque bille permettant d’identifier chacune d’entre elles tandis qu’un second laser vert excite la streptavidine permettant ensuite la quantification d’ADN fixée sur la bille. La fixation de trois BACs différents pour une seule région d’étude permet l’utilisation d’ADN de moins bonne qualité. e) Analyse L’analyse est faite avec le logiciel BoBsoft® - 2.0 (Perkin Elmer). L’interprétation des résultats se fait en comparant, pour une bille donnée, l’intensité de fluorescence du patient (P) par rapport aux témoins masculin (TM) ou féminin (TF). On obtient alors pour chaque bille un ratio P/TM et P/TF. Différents références sont disponibles pour l’interprétation des résultats. En effet, le logiciel peut utiliser les références M et F de la technique pour les appliquer à chaque échantillon ou bien il peut déterminer des références artificielles Mcomp et Fcomp. Le logiciel sépare tous les échantillons de la technique selon leur sexe (défini par le ratio des intensités de fluorescence (IFM) moyen de l’X/ IFM moyen de l’Y) et crée deux références Mcomp et Fcomp et les applique ensuite à l’ensemble des échantillons. Enfin une référence artificielle cumulée peut être calculée. Elle repose sur l’accumulation des références artificielles sur plusieurs techniques et, dans ce cas, les techniques doivent avoir été réalisées avec le même lot de billes.
  8. 8. 8 D. Vérification en FISH Pour les premières techniques, une vérification en FISH a été effectuée pour les cas d’aneuploïdies. Durant toute la période d’inclusion, une vérification en FISH a été effectuée lorsqu’il y avait un profil anormal portant sur une ou deux billes d’un même chromosome.
  9. 9. 9 IV. RÉSULTATS A. Prélèvements 1. Nombre de prélèvement Durant la période d’étude entre juillet 2012 et juillet 2013, 997 prélèvements effectué en prénatal ont été reçus au laboratoire. Sur ces prélèvements, 719 ont eu un examen direct avec la technique de BoBs. Le détail du type de prélèvement ainsi que le type et le nombre d’examens directs effectués est rapporté dans le tableau 2. Type de prélèvement Prélèvements BoBs FISH directes BT directes LA 737 531 180 0 VC 210 177 23 8 SF 39 0 0 0 Tissus 11 11 0 0 Total 997 719 203 8 2. Indications des prélèvements L’indication principale ayant conduit à la réalisation d’un prélèvement de liquide amniotique est le dépistage maternel (45%) effectué soit au premier trimestre de la grossesse avec l’évaluation du risque combiné soit au 2ème trimestre avec le dosage des marqueurs sériques seuls. La deuxième indication la plus fréquente est la présence de signes d’appel échographiques (Figure 4). Tableau 2. Répartition des prélèvements reçus au laboratoire durant la période d’étude, nombre et type d’examen pratiqué. LA : liquide amniotique ; VC : Villosités choriales ; SF : Sang fœtal ; Tissus : villosités choriales récupérées lors d’une fausse couche spontanée précoce. Figure 4. Indications ayant conduit à la réalisation d’un diagnostic prénatal invasif par ponction de liquide amniotique.
  10. 10. 10 Dans le cas des prélèvements de villosités choriales, la présence de signes d’appel échographique tels qu’un hygroma, une ou plusieurs malformations associées ou bien un anasarque est l’indication la plus fréquente (30%). Puis le dépistage du premier trimestre qui place la patiente dans un groupe à risque (22%). Les indications complémentaires qui regroupent les prélèvements pour diagnostic en génétique moléculaire représentent 21% des cas (Figure 5). Figure 5. Indications ayant conduit à la réalisation d’un diagnostic prénatal par prélèvement de villosités choriales.
  11. 11. 11 4. Indications des FISH Le tableau 3 présente les indications et le nombre de FISH directes effectuées selon le schéma de prise en charge des prélèvements en diagnostic prénatal, mis en place au début de l’étude (cf Tableau 1). Dans environ la moitié des cas, une FISH directe a été réalisée car le prélèvement avait été effectué au-delà de 25SA. Dans 20% des cas, c’est la demande de réalisation d’une FISH complémentaire qui a motivé la réalisation d’une FISH directe Indications FISH FISH spécifique associée 41 4p 16 4p + 5p 2 TBX1 20 SNRPN 1 Hernie diaphragmatique (8p, 12p, 15q) 1 FISH spécifique 1 Convenance personnelle 1 Autre 161 LA > 25SA 105 LA < 25SA 32 Nuque ou SAE 9 Jours fériés 3 Jumeaux 2 ? 4 Dépistage maternel 22 Jours fériés 10 ? 12 2ème prélèvement 1 ? 1 BT 23 Dépistage combiné 6 Jours fériés 3 ? 3 Nuque ou SAE 16 Jours fériés 7 Rendu + rapide pour IMG chirurgicale 2 ? 6 Forte suspicion clinique 1 Jumeau 1 Total 203 Tableau 3. Indications ayant conduit à la réalisation d’une FISH directe.
  12. 12. 12 B. Résultats des examens directs Résultats BT directe Normaux 4 Aneuploïdies autosomiques 0 Trisomie 21 0 Trisomie 18 0 Trisomie 13 0 Anomalies autosomes 2 45,XY,der(14; 21)(q10 ;q10)pat 1 46, XY,t(4;10)(q23;p13)mat 1 Anomalies autosomes + gonosomes 1 46, XYY, rob(13;14)(q10,q10)pat 1 Autres anomalies 1 Triploïdie XXX 1 Total 8 Résultats FISH Normaux 178 Aneuploïdies autosomiques 21 Trisomie 21 15 Trisomie 18 6 Trisomie 13 0 Anomalies des gonosomes 2 Monosomie X 2 Autres anomalies 2 Triploïdie XXX 1 der(6)t(6 ;16) 1 Total 203 Résultats BoBs Normaux 639 Echec 6 Contamination maternelle 1 Aneuploïdies autosomiques 57 Trisomie 21 35 Trisomie 18 16 Trisomie 13 3 Trisomie 16 2 Mosaique Trisomie 22 1 Anomalies des gonosomes 5 Monosomie X 3 Klinefelter 1 Double Y 1 Anomalies des autosomes 5 Ségrégation 3:1 t(11;22) 1 Ségrégation 3:1 t(5;12) 1 Duplication 4qter 1 Délétion 22qter 1 Trisomie 18qter 1 Faux positifs 1 Duplication 22qter, XXY Faux négatifs 4 XXX 1 Triploïdie XXX 2 Triploïdie XXY 1 Faux positif et faux négatif 1 Délétion 8p, Duplication 8q Total 719 Tableau 4. Résultats obtenus pour les échantillons ayant eu un diagnostic direct par technique de BoBs. Tableau 5. Résultats obtenus pour les échantillons ayant eu un diagnostic direct par technique de FISH. Tableau 6. Résultats obtenus pour les échantillons ayant eu une analyse de trophoblaste par technique directe.
  13. 13. 13 Les tableaux 4, 5 et 6 présentent les résultats pour les trois techniques de diagnostics directs. Pour la technique de BoBs (tableau 4), le nombre d’échantillons pour lesquels il n’a pas été possible de rendre un résultat est de 6 sur les 719 échantillons testés ce qui correspond à un taux d’échec <1%. Nous avons également eu un cas de contamination maternelle pour lequel nous avons dû effectuer une vérification en FISH. Nous avons mis en évidence 7.9% d’aneuploïdies impliquant principalement les chromosomes 21, 18 et 13 mais également deux cas d’aneuploïdie impliquant le chromosome 16. Des anomalies des gonosomes ont été mises en évidence dans cinq cas : trois cas de monosomie X, un cas de syndrome de Klinefelter et un cas de double Y. Par ailleurs, nous avons mis en évidence 6 anomalies de structure déséquilibrées qui concernaient des autosomes que nous détaillerons plus loin. Enfin, nous avons mis en évidence un faux positif, quatre faux négatifs et un cas qui présentait à la fois un faux positif et un faux négatif que nous détaillerons également plus loin. C. Profils des anomalies 1. Profils des trisomies autosomiques La figure 6 reprend un exemple des profils obtenus pour les aneuploïdies concernant le chromosome 21. Dans la totalité des cas, l’identification de la trisomie est aisée. Il existe une déviation franche des trois billes du chromosome 21 par rapport au témoin masculin et au témoin féminin. Nous avons effectué une vérification du résultat en FISH pour les deux premiers échantillons de la cohorte. Figure 6. Exemple de profils obtenus pour les cas de trisomie 21.
  14. 14. 14 Les profils obtenus pour les aneuploïdies impliquant le chromosome 13 sont également faciles à interpréter (Figure 7). Il existe une déviation significative pour les 3 billes du chromosome aussi bien avec le témoin masculin qu’avec le témoin féminin. En revanche, les profils obtenus dans les cas de trisomie 18 sont plus difficile à interpréter (Figure 8). En effet, la bille télomérique du bras court est souvent dans les limites de la normale. Mais le fait que toutes les billes soient déviées facilite l’interprétation. Cette difficulté d’interprétation peut s’explique par le fait que la séparation totale de l’X pour ces techniques était faible (<0.5%). Figure 7. Exemple de profils obtenus pour les cas de trisomie 13. Figure 8. Exemple de profils obtenus pour les cas de trisomie 18.
  15. 15. 15 Dans certaines situations, nous avons analysé les résultats avec les différentes références : références M et F de la technique, références artificielles Mcomp et Fcomp et références artificielles cumulées. La figure 9 montre un exemple de profils obtenus pour le même échantillon trisomique 18 (échantillon 730) avec les différentes références. On peut noter que la déviation des billes varie plus ou moins en fonction de la référence utilisée. 2. Profils des gonosomes anormaux La figure 10 reprend les profils des gonosomes obtenus pour les monosomies X et la figure 11 les profils obtenus pour le cas de syndrome de Klinefelter (à gauche) et le cas de double Y (à droite). Figure 10. Profils obtenus pour les cas de monosomie X. On note une discordance entre le profil de l’X et le profil de l’Y. Figure 9. Figure 9. Profils obtenus pour l’échantillon 730 avec les différentes références. À gauche : références M et F ; au centre : références artificielles Mcomp et Fcomp ; à droite : références artificielles cumulées.
  16. 16. 16 Figure 11. Profil d’un syndrome de Klinefelter à gauche et d’un homme double Y à droite.
  17. 17. 17 3. Anomalies particulières a) Madame M, échantillon 139 Madame M est une patiente âgée de 37 ans. Elle a déjà accouchée d’un premier garçon en 1999 en bonne santé. La grossesse actuelle a été obtenue par FIV avec un nouveau conjoint. Le début de grossesse a été sans particularité avec à l’échographie du premier trimestre effectuée à 12SA +2j une nuque mesurée à 1.3 mm pour une LCC à 58 mm. Les marqueurs sériques du 2ème trimestre ont montré un risque à 1/39, motivant la réalisation d’une amniocentèse à 18SA. L’examen direct en BoBs a montré la présence d’une déviation significative de la bille terminale du bras long du chromosome 22 (ratio à 0.79 par rapport au témoin féminin et 0.87 par rapport au témoin masculin) en faveur d’une délétion 22qter (Figure 12). Cette délétion a été confirmée par FISH directe sur liquide amniotique avec la sonde couvrant le locus du gène SHANK3 (Figure 13). Le caryotype a confirmé la délétion 22qterminale. Figure 12. Profil de l’échantillon 139 montrant une déviation significative de la bille terminale du chromosome 22. Figure 13. Confirmation de la délétion 22qter avec la sonde TBX1/SHANK3 (Kreatech) montrant la présence d’un seul signal vert dans l’ensemble des noyaux étudiés. TBX1 SHANK3
  18. 18. 18 Figure 14. Caryotypes obtenus après culture des cellules amniotiques confirmant la délétion 22qter.
  19. 19. 19 b) Madame Y, échantillon 703 Madame Y est une patiente âgée de 39 ans, G3P1. Elle a accouchée d’une première fille en 2007, bien portante. La grossesse a été marquée par la présence d’un dépistage combiné du 1er trimestre à 1/38 avec une clarté nucale à 2.8 mm pour une LCC à 68.7 mm, une hCGβ libre à 1.7 MoM et une PAPP-A à 1.33 MoM. La patiente a donc eu une biopsie de villosités choriales au terme de 13SA +6j avec une demande de réalisation d’un caryotype et d’un examen direct. L’examen direct a mis en évidence une déviation significative de la bille 11qter et de la bille 22q proximale en faveur d’une trisomie 11qter et 22q proximale (Figure 15). Un examen FISH a été réalisé sur un lysat de villosités choriales avec une sonde Tel11q qui a confirmé la présence de 3 signaux pour la région 11qter dans les 50 cellules observées (Figure 16). La présence d’un marqueur surnuméraire dérivé d’une translocation t(11;22) a alors été évoqué. Le caryotype après culture a confirmé la présence du marqueur surnuméraire dans l’ensemble des cellules dérivé d’une translocation t(11;22)(q23;q11) (Figure 17). Tel11q 11c Figure 15. Profil obtenu pour l’échantillon 703 montrant la présence d’une trisomie 11qter et une trisomie 22qproximale. Figure 16. Confirmation de la duplication 11qter avec une sonde télomérique tel11q montrant 3 signaux dans l’ensemble des noyaux observés.
  20. 20. 20 Le caryotype des parents a été réalisé. Le caryotype du père était normal. Le caryotype de la mère a montré la présence d’une translocation t(11;22)(q23;q11) (Figure 18) Figure 17. Caryotype obtenu après culture des cellules trophoblastiques montrant la présence d’un élément surnuméraire dans l’ensemble des cellules. Figure 18. Caryotype sanguin réalisé chez Madame Y lors de l’enquête familiale.
  21. 21. 21 c) Madame L, échantillon 742 Madame L est une patiente de 33 ans. Il s’agissait de la première grossesse du couple. Le début de grossesse s’est déroulé sans particularité. Le dépistage du premier trimestre ne la plaçait pas dans un groupe à risque. L’échographie du 2ème trimestre était sans particularité. Enfin à l’échographie du 3ème trimestre il a été noté la présence d’un profil particulier ayant motivé la réalisation d’une amniocentèse pour une étude cytogénétique. La patiente ayant parlé de cet examen à sa mère, celle-ci l’a informée qu’elle avait eu elle-même une amniocentèse pour elle et qu’il existait une translocation entre un chromosome 5 et un chromosome 12, sans autre précision. La patiente a donc eu un prélèvement de liquide amniotique à 33SA +6j ainsi qu’un prélèvement de sang pour analyser la translocation chez elle. L’examen BoBs a montré la présence d’une déviation significative pour la bille terminale du bras court du chromosome 5 et pour les deux billes du bras court du chromosome 12 évoquant une trisomie partielle du bras court du chromosome 5 et une trisomie 12p complète (Figure 19). Cette image en BoBs a fait évoquer la présence d’un dérivé surnuméraire t(5;12) par malségrégation 3:1 d’une translocation t(5;12). La trisomie 5ptel et la trisomie 12ptel a été confirmée par une FISH directe sur du LA conservé avec des sondes contig télomériques (Figure 20). Figure 19. Profil de l’échantillon 742 en faveur d’une duplication 5p terminale et d’une duplication 12p complète. Contig 5pter Contig 5qter Contig 12pter Contig 12qter Figure 20. Confirmation de la présence de trois signaux verts avec la sonde contig 5ptel (à gauche) et de trois signaux rouges avec la sonde contig 12ptel (à droite).
  22. 22. 22 Le caryotype fœtal obtenu après culture des cellules amniotiques et l’examen FISH avec les sondes télomériques des bras cours des chromosomes 5 et 12 a confirmé la présence d’un élément surnuméraire dans l’ensemble des cellules (Figure 21). Le caryotype de la mère a également été effectué et a confirmé la présence de la translocation t(5;12)(Figure 22). Les FISH complémentaires ont montré que seuls ces deux chromosomes étaient impliqués dans la translocation (Figure 23). Le résultat obtenu avec la technique BoBs a permis de préciser les points de cassure. En effet, les sondes proximales du bras court du chromosome 5 n’étant pas déviées, on peut supposer que le point de cassure est situé en 5p13.2 ou 5p13.3 (Figure 24). Sur le chromosome 12, les sondes proximales du bras long du chromosome 12 n’étant pas déviées, le point de cassure est situé au niveau de la bande q13.11 ou au- dessus. Figure 21. A. Caryotype montrant la présence du der(5 ;12) surnuméraire. B. Hybridation avec les sondes contig télomérique 5p (rouge) et 12p (vert). La flèche blanche indique le dérivé surnuméraire. Contig 5pter Contig 12pter Figure 22. Caryotype montrant la présence du de la translocation t(5 ;12). wcp5 wcp12 Figure 23. Hybridation avec les sondes De peinture wcp5 et wcp12 montrant l’implication des chromosomes 5 et 12 uniquement. A B
  23. 23. 23 d) Madame MK, échantillon 909 Madame MK est une patiente âgée de 34 ans. La grossesse s’est déroulée sans particularité. A l’échographie du 3ème trimestre, il a été noté la présence de petits signes à contrôler par un référent du CPDPN à savoir une « éversion des cils », un rein droit peu différencié et un hydramnios. Concernant le pôle céphalique, le corps calleux était étiré avec le 3ème ventricule et les cornes frontales trop visibles et au niveau de la fosse postérieur, les dimensions du cervelet étaient à recontrôler. La grande citerne n’était pas visualisée. Une ponction de liquide amniotique a été réalisée au terme de 32SA et 1j pour la réalisation d’un caryotype et d’un examen direct. L’examen direct avec la technique de BoBs a montré la présence d’une déviation significative des deux billes du bras long du chromosome 18 alors que les deux billes du bras court étaient normales (Figure 25). L’interprétation des profils des trisomies 18 étant difficiles, l’anomalie a été confirmée en FISH avec les sondes subtélomèriques 18p et 18q. La FISH directe sur LA a montré trois signaux avec la sonde subtélomèrique 18q (en rouge sur la figure 26) et seulement deux signaux avec la sonde subtélomèrique 18p. il a donc confirmé la présence d’une trisomie du bras long du chromosome 18. Figure 24. Délimitation de la région (en orange) contenant les BACs des billes proximales des bras court du chromosome 5 (en haut) et du chromosome 12 (en bas) permettant d’avoir une indication sur le point de cassure sur chacun des bras. Figure 26. Hybridation avec les sondes contig télomériques 18p et 18q montrant la présence de trois signaux pour la région 18qter (rouge) et deux signaux pour la région 18pter (vert) confirmant la présence d’une trisomie 18qter et l’absence de trisomie 18pter. Figure 25. Profil de l’échantillon 909 montrant une déviation des billes du bras long du chromosome 18. Contig 18pter Contig 18qter
  24. 24. 24 Le caryotype a montré la présence de deux chromosomes 18 normaux et un chromosome 12 remanié avec un dérivé 12 d’une translocation t(12;18)(p13.33;q12.2)(Figure 27). Des examens complémentaires en FISH ont montré la présence de signaux asymétriques avec la sonde du contig 12p faisant évoquer une délétion terminale de la région télomèrique 12p (Figure 28). Le caryotype de la mère a été réalisé et était normal. Le caryotype du père n’a pas pu être fait. Figure 27. Caryotype après culture de cellules amniotiques montrant le dérivé 12. wcp12 wcp18 Contig12p Contig18p Figure 28. A. Hybridation avec les sondes de peinture wcp12 et wcp18 montrant le dérivé der(12) de la translocation t(12;18). B. Hybridation avec la sonde contig 12p (en rouge) montrant une asymétrie de signal et la sonde contig 18q montrant la présence de trois signaux. A B
  25. 25. 25 e) Madame G, échantillon 934 Madame G est une patiente âgée de 38 ans G2P1. Elle a eu une petite fille avec un premier conjoint en 2005 qui était décrite comme ayant quelques difficultés. A l’échographie du 1er trimestre la clarté nucale a été mesurée à 3.1 mm pour une LCC à 78.8 mm. Le dépistage combiné du 1er trimestre était de 1/70. La patiente a été adressée au CPDPN de l’hôpital Trousseau pour la prise en charge. Une ponction de liquide amniotique a été faite pour la réalisation d’un caryotype et d’un diagnostic direct. L’examen BoBs a montré une déviation significative de la bille de l’extrémité terminale du bras long du chromosome 4 en faveur d’une duplication 4qter (Figure 29). Un examen FISH direct sur liquide amniotique a confirmé le résultat avec la présence de trois signaux pour la région 4qter. Le caryotype obtenu après culture a montré des chromosomes 4 apparemment normaux (Figure 30). Figure 29. Profil obtenu pour l’échantillon 934 montrant la présence d’une déviation significative de la bille terminale du bras long d’un chromosome 4. Figure 30. Caryotype après culture de cellules amniotiques ne montrant pas de chromosome 4 remanié.
  26. 26. 26 Les examens complémentaires en FISH ont montré la présence d’un signal 4q sur un chromosome du groupe E (Figure 31). En reprenant le profil BoBs il a été effectivement remarqué une déviation de la bille de l’extrémité du bras court du chromosome 18 en faveur d’une délétion de la région terminale du bras court du chromosome 18. Le résultat a donc été confirmé en FISH avec des sondes télomériques 4qter et 18pter . Le caryotype de la maman a ensuite été réalisé et n’a pas montré de chromosomes remaniés. En revanche, l’examen en FISH a révélé la présence d’une translocation t(4;18) apparemment équilibrée et n’impliquant que ces chromosomes (Figure 32). La patiente a été revue en consultation et l’histoire familiale a été reprise. En raison de difficultés scolaires chez la première fille, un caryotype a été réalisé chez celle-ci.. Le caryotype était normal mais l’examen en FISH a montré la présence d’un dérivé 4 de la translocation t(4;18). Après une consultation de conseil génétique avec l’ensemble des résultats, le couple a fait la demande d’une interruption médicale de la grossesse qui a été acceptée par le CPDPN. Figure 31. Hybridation avec la sonde contig 4q télomèrique (en rouge) montrant trois signaux (flèche pleine) et la sonde contig 18q télomèrique (en vert) montrant un seul signal (flèche pointillée). Contig4q Contig18p Figure 32. A. Hybridation avec la sonde wcp4 et wcp18 montrant la translocation t(4;18). B. Hybridation avec les sondes contig 4q (en rouge) montrant le dérivé 18 (flèche bleue) et la sonde contig 18p (en vert) montrant le dérivé 4 (flèche jaune). Contig4q Contig18p wcp4 wcp18 A B
  27. 27. 27 RP11-22C6 Figure 33. Hybridation avec la sonde RP11-22C6 (18p11.3) montrant la présence de trois signaux avec un signal supplémentaire sur le dérivé 4.
  28. 28. 28 D. Faux Positifs et faux négatifs 1. Faux positif : madame K, échantillon 585 Madame K est une patiente de 36 ans G2P1 sans antécédents particuliers. L’échographie du premier trimestre était sans particularité avec une nuque fine (pas de résultat dans le dossier). Les marqueurs sériques du 2ème trimestre ont montré la présence d’un risque à 1/49 motivant la réalisation d’une amniocentèse. L’examen direct par technique BoBs a montré la présence d’une déviation significative pour la bille terminale du chromosome 22 en faveur d’une duplication ainsi qu’un profil de l’X et de l’Y en faveur d’un Klinefelter (Figure 34). Cependant, le CV des autosomes pour cet échantillon était >6% qui est la limite fixée dans le laboratoire. Le résultat a donc été vérifié par FISH directe sur liquide conservé, il a montré la présence de deux signaux dans tous les noyaux pour la région terminale du chromosome 22 ainsi que des signaux féminins (Figure 35). Le résultat n’a donc pas été confirmé par la FISH. La technique de BoBs a été refaite pour cet échantillon pour voir le résultat dans une deuxième technique. Dans cette nouvelle technique, le contrôle de qualité de l’échantillon était meilleur avec un CV à 2,20%. Il a montré un examen normal (Figure 36). Le caryotype après culture était féminin sans particularité. Figure 34. Profil montrant la déviation de la bille terminale du chromosome 22 et un profil des gonosomes en faveur d’un syndrome de Klinefelter. Figure 35. Hybridation avec les sondes Aneuvysion montrant la présence de deux signaux pour le chromosome X (en vert) et l’absence de signaux avec la sonde de l’Y (en rouge). CEP18 CEPX CEPY
  29. 29. 29 Figure 36. Deuxième profil obtenu pour l’échantillon 585 en le testant à nouveau dans une deuxième technique.
  30. 30. 30 2. Faux négatif a) Madame T, échantillon 744 Madame T est une patiente de 43 ans. Elle a bénéficié d’un diagnostic prénatal par biopsie de villosités choriales au terme de 13SA +2j pour la réalisation d’un diagnostic moléculaire de maladie génique. L’examen direct en BoBs a été rendu normal (Figure 37). Le caryotype a mis en évidence la présence d’une trisomie X (Figure 38). En reprenant le résultat rétrospectivement, l’anomalie était visible et aurait dû être diagnostiquée. Il ne s’agit donc pas d’un faux-négatif à proprement parler mais d’une erreur d’interprétation des BoBs. b) Triploïdies XXX Madame D, échantillon 462 est une patiente de 32 ans. L’échographie du 1er trimestre a mis en évidence un syndrome polymalformatif avec la présence d’un hygroma à 4.6 mm, une hernie ombilicale, un épanchement pleural droit, une image kystique de la fosse postérieure et un placenta vasculaire très épais. Elle a été adressée au CPDP de l’hôpital Trousseau pour la réalisation d’une biopsie de villosités choriales au terme de 12SA +6j. L’examen direct en BoBs a montré un profil féminin normal. Madame C, échantillon 513 est une patiente de 27 ans. L’échographie réalisée au 1er trimestre a suspecté la présence d’un RCIU précoce avec un placenta de structure normale. La patiente a alors été adressée au CPDP de l’hôpital Trousseau à 17SA. Le jour du prélèvement, la grossesse était arrêté. Un examen BoBs a été réalisé et a montré un profil féminin normal. Dans les deux cas, le caryotype après culture a montré la présence d’une triploïdie XXX homogène. Figure 37. Profil obtenu pour l’échantillon 744 montrant une discrète déviation des billes pour le chromosome X. Figure 38. Caryotype obtenu après culture de cellules trophoblastiques montrant un triple X dans l’ensemble des cellules examinées.
  31. 31. 31 c) Triploïdie XXY Madame L, échantillon 170 est une patiente âgée de 32 ans. A l’échographie du 1er trimestre, il existait un hygroma à 4 mm avec présence d’un ventricule cérébral antérieur unique faisant évoquer une holoprosencépahlie probable et un placenta sans particularité. Une biopsie de villosités choriales a été réalisée au terme de 12SA pour la réalisation d’un caryotype et d’un examen direct. L’examen en BoBs a montré la présence d’un profil atypique pour les gonosomes mais faisant évoquer un profil masculin (Figure 39). Il n’a pas été vérifié par FISH. Le caryotype a montré la présence d’une triploïdie 69,XXY dans l’ensemble des cellules (Figure 40). Figure 39. Profil obtenu pour l’échantillon 170 montrant un profil anormal pour les chromosomes X et Y. Figure 40. Caryotype obtenu après culture de cellules trophoblastiques pour l’échantillon 170.
  32. 32. 32 3. Faux négatif et faux positif : madame C, échantillon 987 Madame C est une patiente 28 ans G2P0. Elle a eu une première grossesse interrompue pour la présence d’un tératome sacro-coccygien. Pour la grossesse actuelle, une échographie précoce réalisée à 9 SA a montré la présence d’une grossesse intra-utérine avec quelques images de vésicules faisant suspecter une môle. Une aspiration a été effectuée à 9SA avec réalisation d’un examen fœtopathologique et réalisation d’un caryotype. Un examen direct a été réalisé par une technique de BoBs et a montré une déviation significative pour la bille terminale de l’extrémité terminale du bras court du chromosome 8 en faveur d’une délétion terminale et une déviation significative de la bille terminale du bras court du chromosome 9 en faveur d’une duplication 9p (Figure 41). La présence d’un dérivé 8 d’une translocation t(8;9) a été évoquée. Le caryotype a confirmé la présence d’un dérivé d’un chromosome 8 mais les images n’étaient pas en faveur d’un fragment 9p (Figure 42). Un examen FISH a été réalisé sur les cultures. Il a montré que le dérivé 8 était constitué uniquement du chromosome 8 et qu’il existait une délétion 8p terminale et une duplication 8q terminale (Figure 43 et 44). En revanche les hybridations avec les sondes du chromosome 9 étaient normales. Figure 41. Profil obtenu pour l’échantillon 987 faisant évoquer la présence d’un dérivé de translocation der(9) d’une translocation t(8;9) avec une délétion de la région 8p terminale et une duplication de la région 9p terminale. Figure 42. Caryotype obtenu après culture de cellules trophoblastiques montrant la présence d’un dérivé 8.
  33. 33. 33 Figure 43. Hybridation avec les sondes de peinture chromosomique wcp8 (en vert) et wcp9 (en rouge) montrant que le dérivé 8 est constitué uniquement de chromosome 8. Figure 44. Hybridation avec les sondes télomériques 8pter (en vert) et 8qter (en rouge) montrant la présence de deux signaux rouge au niveau des régions télomériques du dérivé 8 en faveur d’une duplication 8qter. wcp8 wcp9 8ptel 8qtel
  34. 34. 34 V. DISCUSSION A. Général Les méthodes permettant un diagnostic rapide des aneuploïdies se sont largement développées depuis la mise en place du diagnostic prénatal. Différentes méthodes sont à disposition : Aneuvysion, PCR quantitative mais également des technologies qui permettent d’identifier d’autres anomalies chromosomiques comme la technologie Prenatal BoBs ou Karyolite BoBs. Plusieurs laboratoires utilisent la technique Prenatal BoBs car elle permet le diagnostic des principales aneuploïdies 13, 18, 21, X et Y ainsi que le diagnostic de neuf syndromes microdélétionnels. Au laboratoire, nous avons considéré que la recherche systématique de syndromes microdélétionnels en l’absence de données médicales suspectes (malformation cardiaque, hypotonie fœtale, RCIU, etc…), et notamment dans le cadre d’un diagnostic prénatal fait au titre du dépistage systématique de la trisomie 21, n’était pas justifiée. Nous avons donc fait le choix d’utiliser la technique Karyolite BoBs car elle permet de faire une analyse globale rapide de l’ensemble des chromosomes et permet de mettre en évidence à la fois des aneuploïdies mais aussi des délétions ou des duplications terminales de plus ou moins grande taille. B. Avantages L’utilisation de cette technique nous a permis de réaliser un diagnostic rapide, par un examen BoBs le plus souvent ou bien par la technique de FISH directe dans certaines situations, pour tous les prélèvements que nous avons reçus au laboratoire pour un diagnostic prénatal, mis à part les sangs fœtaux. En effet, le temps nécessaire à la réalisation d’une technique de BoBs, qu’il y ait quelques prélèvements ou de nombreux prélèvements, n’est pas plus long que le temps nécessaire à la réalisation d’une FISH directe. En revanche, le temps médical consacré au rendu des résultats est beaucoup plus court pour les techniques de BoBs. L’interprétation des profils est plus rapide que la lecture au microscope de deux fois 50 noyaux pour la technique de FISH directe. Sur les 997 prélèvements inclus, les 2/3 ont eu un examen BoBs à la place d’une FISH directe. Le taux d’échec dans notre sérié était de <1% ce qui est plus faible que dans la série rapportée précédemment avec la technique Karyolite BoBs5 . Cette différence peut s’expliquer par le type de prélèvements que nous avons testés. En effet, la série précédente concernait des prélèvements de produits de fausses couches. Dans notre série les échantillons arrivent au plus tard dans les 6 heures suivant le prélèvement et peut donc être conservé dans les conditions optimales jusqu’à la réalisation de la technique. Un deuxième facteur qui peut expliquer ce résultat est que lorsque la quantité de prélèvement paraissait insuffisante pour la réalisation d’un examen direct la mise en culture était privilégiée pour l’obtention du caryotype. Concernant le diagnostic des aneuploïdies autosomiques, la valeur prédictive positive dans notre série est de 100%. En effet, la technique n’a pas été mise en défaut pour le diagnostic des aneuploïdies les plus fréquentes 21, 18 et 13. De plus nous avons pu mettre en évidence une trisomie 16 sur deux prélèvements, résultats qui n’auraient pas pu être détectés par la technique de FISH directe. Ceci est d’autant plus important que dans un des cas, il n’a pas été possible d’obtenir un caryotype sur les cultures (Échantillon 44, annexe 2, p.40). La réalisation de la technique BoBs dans ce cas a vraiment été un avantage pour la patiente car un résultat a pu être rendu. Dans le deuxième cas, le diagnostic aurait été corrigé avec le résultat du caryotype. L’avantage d’utiliser la technique Karyolite BoBs par rapport à la technique Prenatal BoBs est la possibilité d’examiner les régions télomériques des chromosomes qui sont de plus ou moins grande taille selon les chromosomes. En effet, les sondes situées sur la bille couvrant la région terminale du bras court du chromosome 1 sont situées à 4Mb du télomère pour la plus distale et à 15.5Mb pour la plus proximale
  35. 35. 35 tandis que sur l’extrémité terminale du bras long du chromosome 22, les trois sondes sont situées à moins de 4Mb du télomère permettant de mettre en évidence des microdélétions terminales. C’est le cas de l’échantillon 934 pour lequel une microduplication de la région terminale du bras long du chromosome 4 a été identifiée et a permis de mettre en évidence une translocation cryptique t(4;18). Ce cas est particulièrement intéressant car il a été retrouvé chez une patiente ayant eu un diagnostic prénatal pour un risque combiné à 1/79. Si elle avait eu une FISH directe, celle-ci aurait été normale ainsi que le caryotype et le déséquilibre chromosomique chez le fœtus serait passé inaperçu. Aucune exploration complémentaire n’aurait été effectuée. Par ailleurs, pour la patiente, sa fille aînée ayant des difficultés peu invalidantes, il ne lui semblait pas nécessaire de faire des explorations et le diagnostic de la translocation serait resté méconnu. C’est donc le résultat du BoBs qui a permis de faire le diagnostic pour la grossesse actuelle et qui a permis d’orienter le diagnostic chez la fille aînée de la patiente lors de l’enquête familiale. Un autre avantage de l’utilisation des BoBs est la possibilité de faire un diagnostic plus rapide par rapport au délai de rendu du caryotype. En effet, pour les cinq autres anomalies que nous avons mises en évidence, le diagnostic aurait pu être fait sur le caryotype. Cependant, la possibilité de rendre un résultat précoce est à prendre en compte pour les patientes. C’est particulièrement le cas pour l’échantillon 742 dont le prélèvement a été effectué à 33SA +6j, pour lequel, la translocation chez la patiente n’était pas parfaitement connue. Les seuls renseignements étaient la présence d’une translocation impliquant les chromosomes 5 et 12. Il aurait été possible de réaliser une FISH directe avec les sondes des extrémités terminales des bras courts et des bras longs des chromosomes 5 et 12 mais dans ce cas, on avait une analyse plus globale qui donnait un aperçu des points de cassure de la translocation. Un résultat a pu être rendu à la patiente et une interruption médicale de la grossesse a pu être proposée rapidement. Dans le cas de l’échantillon 703, présentant un dérivé surnuméraire d’une translocation t(11;22) maternelle, la translocation chez la patiente n’était pas connue. Dans ce cas, la méthode BoBs apporte un avantage sur la technique de FISH car la patiente aurait été faussement rassurée. Nous avons mis en évidence 5 anomalies de structures qui n’auraient pas pu être identifiée en FISH directe et une anomalie qui n’aurait pas non plus été identifiée au caryotype. C. Limites Nous avons décidé de réaliser deux techniques par semaine, une première débutant le lundi matin avec rendu des résultats le mardi en fin de matinée et la deuxième débutant le jeudi matin avec un rendu des résultats le vendredi matin. Cette organisation est très appréciée par les cliniciens. En effet, dans certains centres, il n’y a qu’une seule technique de BoBs par semaine. Cependant, dans certaines situations, le temps de rendu du résultat risque d’être trop long en particulier en cas de menace d’accouchement prématuré et nécessite de réaliser un examen en FISH directe. La technique de BoBs est difficilement applicable en situation d’urgence et la FISH est donc encore souvent utilisée pour ces situations (environ 10% des prélèvements). Nous avons réalisé une FISH directe à la place d’une technique de BoBs pour environ 1/3 des prélèvements. Ceci est lié à différentes raisons. Tout d’abord comme nous venons de le voir, il n’est pas possible de réaliser une technique en urgence dans le cas de MAP. Par ailleurs, dans les cas où les patientes sont prélevées après 25SA les obstétriciens préfèrent avoir un résultat rapide au cas où la patiente entrerait en travail suite à l’amniocentèse. Cette situation est à l’origine de la réalisation de la moitié des FISH directe (Voir tableau 3). Ceci est un des inconvénients de notre fonctionnement. En effet, certains échantillons n’ont pas d’examen BoBs alors qu’il serait plus intéressant de le faire. C’est le cas de l’échantillon 981 pour lequel une FISH directe a été faite car le prélèvement avait été fait à 33SA +4j. Le caryotype a mis en évidence un dérivé 12 d’une translocation t(1;12)(q42;p13) qui aurait pu être mise en évidence par la
  36. 36. 36 technique de BoBs (Annexe 3, p.42). Actuellement, nous reconsidérons notre manière de faire et nous proposons de réaliser une FISH directe uniquement en cas de MAP avérée ou de demande spécifique de la part des obstétriciens. Concernant l’interprétation des profils, nous avons eu quelques difficultés. En effet, nous l’avons vu, par exemple pour les trisomies 18, les billes du bras court ne sont pas toujours déviées de manière significative. Un autre problème que nous avons rencontré est la présence de faux positifs et de faux négatifs. Nous avons vu que concernant la trisomie X, le résultat faux négatif était lié à l’interprétation de la technique. En effet, rétrospectivement, l’anomalie était tout à fait identifiable. Les autres cas de faux négatifs concernent les résultats de triploïdie. C’est une des limites majeure de la technique6 . Tout comme la CGH array, la technique de BoBs ne permet pas d’identifier les triploïdies en particulier lorsque le caryotype est 69,XXX. Dans le cas des triploïdies 69,XXY, le profil des gonosomes évoque un profil de contamination maternelle comme nous l’avons vu pour l’échantillon 170. Ceci nous a montré qu’il était indispensable de réaliser une vérification en FISH des résultats faisant évoquer une contamination maternelle, dans le but de quantifier cette contamination mais également d’éliminer une triploïdie XXY. En revanche, nous avons eu deux cas de faux positifs (échantillon 585 et 987). Pour l’échantillon 585, les critères de qualité de la technique étaient bon avec un CV des autosomes des références <6% et une séparation totale de l’X > 0.6. En revanche, le CV des autosomes pour l’échantillon était à 7.27% ce qui est supérieur aux critères du laboratoire puisque nous nous étions fixés comme limite 6%. Cependant, dans les recommandations du fabricant la limite étant fixée à 8% nous avons tenu compte du résultat du BoBs tout en effectuant tout de même une vérification en FISH. Les discussions avec la société Perkin Elmer n’ont pas permis d’identifier l’origine de ce faux positif. De plus lorsque nous avons repassé l’échantillon dans une nouvelle technique, le résultat était cette fois-ci normal. Ceci nous a amenés à retenir la limite de 6% pour le critère de qualité du CV des autosomes comme nous l’avions fixé initialement. Pour l’échantillon 987 en revanche, nous avons eu à la fois un faux positif et un faux négatif (mise en évidence d’une délétion 9pter et l’absence de duplication 8qter). Lorsque nous l’avons testé à nouveau dans une seconde technique, le résultat était normal pour la région 9pter mais la duplication 8qter n’avait toujours pas été mise en évidence. Dans les deux cas, les critères de qualité étaient corrects avec un CV des autosomes des témoins et des échantillons <6%. L’échantillon a été réanalysé par la société Perkin Elmer et le résultat était celui attendu soit une duplication 8qter et une délétion 8pter alors que la technique était de moins bonne qualité. Nous n’avons pas d’explication à cet évènement. Le kit Karyolite BoBs analyse les régions péricentromériques et terminales de l’ensemble des chromosomes. Il est dommage que la bille couvrant la région péricentromérique du chromosome 22 ne soit pas située sur la région de TBX1 impliquée dans le syndrome de DiGeorge, d’autant plus qu’une telle bille serait facile à inclure puisque ce syndrome microdélétionnel est identifiable dans le kit Prenatal BoBs. Ceci nous permettrait de réaliser une technique de BoBs plutôt qu’une technique de FISH directe lorsque qu’une FISH complémentaire 22q11 est demandée. La demande d’une FISH 22q11 complémentaire est l’indication la plus fréquente des FISH complémentaire (Voir tableau 2). D. Coût de la technique Le coût unitaire de la technique de BoBs est de 90 euros environ ce qui est trois fois plus élevé que le coût d’un examen en FISH directe (environ 33 euros) car il est possible de diluer les sondes de FISH directe permettant de diminuer le coût unitaire. Cependant, cette technique permet un gain de temps de technicienne et de médecin important, ce qui est un avantage majeur dans la période de restriction budgétaire actuelle. Elle nous a également permis de mettre en évidence une anomalie de structure qui n’aurait pas été identifiée ni par la FISH directe ni par le caryotype. Ce réarrangement aurait très
  37. 37. 37 probablement été viable à terme entraînant donc la naissance d’un enfant qui aurait présenté ensuite des difficultés dans les acquisitions et probablement un retard mental par la suite. D’un point de vue strictement économique, sa prise en charge aurait été très coûteuse pour la société. A l’heure actuelle cet examen est côté en BHN 1100 (cotation B049 « CGH sur bille » selon la nomenclature de Montpellier) et n’est donc pas facturé à la patiente. VI. CONCLUSION L’utilisation de la technique Karyolite BoBs pour le diagnostic rapide au laboratoire est une technique tout à fait adaptée. Elle permet un diagnostic rapide des aneuploïdies mais également le diagnostic d’anomalies de structure de plus ou moins grande taille. Il permet de proposer un résultat rapide pour toutes les patientes. Le coût de cette technique est bien sûr plus élevé que le coût de la FISH directe mais cette technique nous a permis d’identifier une anomalie qui n’aurait pas été détectée avec les autres techniques de cytogénétique disponibles au laboratoire.
  38. 38. 38 Bibliographie 1. Peter Harper. Interview André et Joelle Boué. (2005). at <http://www.genmedhist.info/interviews/Boue%20A%20and%20J> 2. Penrose, L. S. The relative effects of paternal and maternal age in mongolism. 1933. J. Genet. 88, 9–14 (2009). 3. Klinger, K. et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using fluorescence in situ hybridization (FISH). Am. J. Hum. Genet. 51, 55–65 (1992). 4. Mansfield, E. S. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms. Hum. Mol. Genet. 2, 43–50 (1993). 5. Grati, F. R. et al. Application of a new molecular technique for the genetic evaluation of products of conception: KaryoLiteTM BoBsTM for genetic analysis of products of conception. Prenat. Diagn. 33, 32–41 (2013). 6. Paxton, C. N., Brothman, A. R. & Geiersbach, K. B. Rapid aneusomy detection in products of conception using the KaryoLiteTM BACs-on-BeadsTM assay. Prenat. Diagn. 33, 25–31 (2013).
  39. 39. 39 Annexes Annexe 1. Protocole simplifié de la réalisation de la technique de BoBs.
  40. 40. 40
  41. 41. 41 Numéro Vérification FISH Caryotype Corrélation échantillon Autosomes Gonosomes 2 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 7 Nl Double Y 47,XYY + 24 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 33 Nl XXY 47,XXY + 40 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 44 Trisomie 16 Masculin Echec Bénéfice du BoBs 54 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 55 Trisomie 18 Féminin Confirmation T18 F mos + 84 Nl Masculin 46,XY,del(2)(q31q32) Limite du BoBs 92 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 111 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 125 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 126 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 139 Délétion 22qter Masculin Confirmation 46,XY,del(22q) Bénéfice du BoBs 148 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 170 Nl Masculin 69,XXY Limite du BoBs 184 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 194 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 208 Nl Monosomie X 45,X + 218 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 224 Trisomie 16 Masculin 47,XY,+16 + 229 Nl Masculin 47,XY,+mar[6]/46,XY[24] Limite du BoBs 232 Nl Féminin Echec Bénéfice du BoBs 267 Contamination maternelle probable Contamination maternelle probable Confirmation contamination maternelle 46,XY Limite du BoBs 275 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 278 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 305 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 322 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 339 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 340 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 356 Trisomie 18 XXX 48,XXX,+18 + 377 Nl Monosomie X 45,X + 378 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 395 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 400 Nl Monosomie X 45,X + 401 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 402 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 404 Echec Echec 46,XY Limite du BoBs 408 Echec Echec Echec Limite du BoBs et du caryotype 419 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 426 Trisomie 13 Masculin 47,XY,+13 + 437 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 451 Echec Echec 46,XX Limite du BoBs 452 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 458 Nl Masculin 46,XY,t(4;10)mat Bénéfice du BoBs 462 Nl Féminin 69,XXX Limite du BoBs 470 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 472 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 497 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 513 Nl Féminin 69,XXX Limite du BoBs 517 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 553 Trisomie 22 mosaïque Féminin F mosT22 + 563 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 582 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 585 Duplication 22qter XXY XX Nl 46,XX Faux positif BoBs 599 Nl Masculin Contamination maternelle Bénéfice du BoBs 600 Echec Echec 46,XY Limite du BoBs 620 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 645 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 665 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 672 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 703 Duplication 11qter, Duplication 22qprox Masculin Confirmation 47,XY,+der(22)t(11;22)(q23;q11)mat Bénéfice du BoBs Résultat BoBs Annexe 2. Tableau montrant la corrélation entre le résultat BoBs et le caryotype avec les avantages du BoBs et les limites. 40
  42. 42. 42 718 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 730 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 738 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 739 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 742 Duplication 5pter, Duplication 12pter et 12p proxFéminin Confirmation 47,XX,+der(12)t(5:12)(p10;p10)mat Bénéfice du BoBs 744 Nl Féminin 47,XXX Faux négatif 770 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 776 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 778 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 785 Echec Echec 46,XX Limite du BoBs 834 Trisomie 13 masculin 47,XY,+13 + 867 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 868 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 883 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 909 Trisomie 18q Féminin Confirmation 46,XX,der(12)t(12;18)(p13.32;q12.2) Bénéfice du BoBs 931 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 934 Trisomie 4qter Féminin Confirmation 46,XX,der(18)t(4;18)(q?;p?) Bénéfice du BoBs 946 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 947 Nl Masculin Contamination maternelle Bénéfice du BoBs 952 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 953 Trisomie 13 Féminin 47,XX,+13 + 964 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 978 Nl Masculin 46,XY,t(13;16)(q14;q22)mat Bénéfice du BoBs 987 Délétion 8pter, duplication 9pter Féminin + / Délétion 8pter, délétion 8qter et 9pter normal 46,XX,der(8)inv(8)(p23?;q23?) Faux négatif + Faux positif Numéro Vérification FISH Caryotype Corrélation échantillon Autosomes Gonosomes Résultat BoBs Annexe 2. Suite
  43. 43. 43 Numero Caryotype Corrélation 147 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 159 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 162 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 173 Trisomie 21 Masculin Echec Bénéfice du BoBs 182 Nl Féminin 46,XX,inv(5)(p13,2q13) + 233 Nl Masculin Echec Bénéfice du BoBs 255 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 273 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 360 Nl Masculin 45,X[9]/46,XY[15] Limite de la FISH directe 478 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 494 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 505 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 531 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 543 Nl Féminin 46,XX,ins(2 ;8)(q21 ;q21.2q24.1)dn Diagnostic sur caryotype 568 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 605 Nl Monosomie X en mosaïque Contamination maternelle probable Intérêt du caryotype 616 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 634 Trisomie 18 Masculin 47,XY,+18 + 649 Délétion 6qter, Duplication 16qter 46,XY,der(6)t(6 ;16)(q25 ;q24)mat + 652 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 668 Trisomie 18 Féminin 47,XY,+18 + 700 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 733 Trisomie 21 Féminin 47,XX,+21 + 768 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 795 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 806 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 825 Nl Monosomie X 45,X + 827 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 889 Trisomie 21 Masculin 47,XY,+21 + 981 Nl Masculin Madd(12) Bénéfice du BoBs Résultat FISH Annexe 3. Corrélation entre la technique de FISH directe et le caryotype et le bénéfice si un examen BoBs avait été réalisé.
  44. 44. 44 Numero Caryotype Corrélation 37 45,XY,der(14;21)(q10;q10)pat + 67 46,XYY,der(13;14)(q10,q10)pat + 179 69,XXX Limite du BoBs 262 46,XY,t(4;10)(q23;p13)mat + 316 69,XXX Limite du BoBs 46,XY,t(4;10)(q23;p13)mat 69,XXX Résultat BT directe 45,XY,der(14;21)(q10;q10)pat 46,XYY,der(13;14)(q10,q10)pat 69,XXX Annexe 4. Corrélation entre la technique directe et le caryotype et les limites si une technique de BoBs avait été réalisée à la place de la technique directe.

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