ACADEMIE DE VERSAILLES
UNIVERSITE DE VERSAILLES SAINT-QUENTIN EN YVELINES
U F R MEDICALE DE PARIS-ILE-DE-FRANCE-OUEST
ANNE...
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REMERCIEMENTS
A Monsieur le Professeur Michel Vekemans qui m’avez fait l’honneur d’accepter la
présidence de ce jury. Vo...
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Aux Docteurs Férechté Razavi, Tania Attié-Bitach, Jélèna Martinovic et Maryse
Bonnière Darcy, pour votre contribution et...
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A vous qui êtes là depuis le début de l’aventure ou bien plus récemment mais qui serez
toujours là j’en suis sûr
Merci à...
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TABLE DES MATIERES
TITRE ET RESUME EN ANGLAIS .............................................................................
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IV. Matériels et méthodes..................................................................................................
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TITLE
Search for chromosomal aberrations using array CGH in fetuses with congenital
diaphragmatic hernia.
SUMMARY
Congen...
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ABREVATIONS
ADN : acide désoxyribonucléique
CAV : canal atrio-ventriculaire
CGH : comparative genomic hybridization
CGH ...
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LISTE DES FIGURES
Figure 1. Vue inférieure du diaphragme, d’après le Laboratoire d’Anatomie Faculté de
Médecine Toulouse...
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Figure 24. FISH interphasique réalisée avec le contig 17pter chez le sujet 49 montrant la
présence de 3 signaux verts (...
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I. Introduction
Le diaphragme est un organe essentiel séparant les viscères thoraciques des viscères
abdominaux. Les an...
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II. Le diaphragme
A. Anatomie du diaphragme
Le diaphragme est une cloison musculo-aponévrotique qui joue un double rôle...
13
Figure 1. Vue inférieure du diaphragme, d’après le Laboratoire d’Anatomie Faculté de Médecine
Toulouse-Purpan 2
.
Le ce...
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2. Portion périphérique musculaire
La partie musculaire est elle-même composée de 3 parties : lombaire, costale et
ster...
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B. Embryologie du diaphragme
Le diaphragme se forme à partir de la réunion de 4 structures qui vont former le
diaphragm...
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d. Paroi thoracique
Le quatrième composant du diaphragme vient de la paroi du corps, plus tardivement,
entre la 9ème
et...
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2. Muscularisation du diaphragme
Les myoblastes dérivés des myotomes cervicaux migrent et forment la musculature
diaphr...
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C. Anomalies du développement du diaphragme.
Les anomalies de développement du diaphragme surviennent dans environ 1/30...
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2. Hernies non postéro-latérales9
a. Hernies de Morgagni.
Le terme de hernie de Morgagni regroupe les hernies retroster...
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Figure 3. Illustration des différents types de hernies diaphragmatiques (vue inférieure du diaphragme),
d’après Pober9
.
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D. Bases génétiques des hernies diaphragmatiques
La pathogénie et l’étiologie des hernies diaphragmatiques sont encore ...
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Figure 4. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement
pulmonaire, d’après K...
23
Ceci est en faveur de la survenue d’une anomalie simultanée du parenchyme
pulmonaire et du diaphragme dans la genèse de...
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Si le rétinol subit une oxydation, celui-ci est pris en charge dans le cytoplasme par la
cellular retinol binding prote...
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Figure 6. Schéma général de la voie de signalisation des rétinoïdes, d’après Montedonico et al6
.
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-Rôle des rétinoïdes dans les HCD
La première preuve du lien existant entre les rétinoïdes et les HCD provient des étud...
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b. Modèles génétiques
Différents modèles de souris génétiquement modifiées ayant des lacunes
diaphragmatiques variables...
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-Modèle Fog2 (Friend of GATA protein 2)
En 2007, l’équipe d’Ackerman a étudié des souris traitées par un agent chimique...
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You en 2005, suite à ces résultats, étudie ce gène Coup-tfII chez la souris26
. Des études
précédentes avaient montré q...
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-Modèle Gata4 (GATA binding protein 4)
La microdélétion de la région 8p23.1, chez l’Homme, contenant le gène GATA4 a ét...
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2. Chez l’Homme
a. Rétinoïdes et hernie
En 1998, Major et al. ont réalisé une étude clinique pour évaluer le lien entre...
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Tableau 2. Syndromes monogéniques pour lesquels la HCD est l’élément principal, d’après Pober12
.
On retrouve dans ce t...
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-Anomalies chromosomiques
Dès 1996, des anomalies chromosomiques ont été identifiées comme étant
responsables de hernie...
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Nous retrouvons parmi ces anomalies, les délétions 15qter comprenant le gène COUP-
TFII qui sont rapportées 26 fois dan...
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III.Notre travail
A. Intérêt de la CGH array pour l’étude génétique
des hernies de coupole diaphragmatique
congénitales...
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En revanche, l’utilisation de la CGH array au cours du diagnostic prénatal reste
prudente en raison des difficultés d’i...
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IV.Matériels et méthodes
A. Recrutement des sujets
Cinquante sujets au total ont été inclus dans cette étude. Ils provi...
38
B. Techniques d’étude
1. Caryotypes
Tous les sujets de la «cohorte prospective» inclus dans l’étude ont bénéficié d’un
...
39
b. Matériel d’études
Pour confirmer les résultats obtenus par la CGH array, une étude en FISH a été
réalisée.
Dans le c...
40
Les sondes marquées ont ensuite été co-précipitées avec une autre sonde marquée avec
un fluorochrome différent puis rem...
41
Nous utilisons en pratique courante dans le service cette FISH ciblées depuis 2005
puisque ces régions sont connues com...
42
Figure 9. Synoptique comparatif des principales étapes entre la CGH sur
chromosomes et la CGH array, d’après Sanlaville...
43
Figure 10. Représentation graphique de la technique en « dye
swap ».
Les points rouges représentent la technique où l’A...
44
-Marquage des ADN
L’ADN a été marqué par une technique de « Random priming ». Cette technique
consiste à chauffer l’ADN...
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témoin. Dans une deuxième technique, le patient A est marqué par la cyanine-5 et hybridé
avec le patient C marqué par l...
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Les mélanges ont été chauffés à 99°C pendant 10 minutes puis placés à 37°C pour une
étape de préhybridation pendant une...
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L’interprétation des résultats a été faite en fonction du ratio log Cy5/log Cy3. Sur les
représentations graphiques, la...
48
V. Résultats
A. Résultats de l’étude en CGH array
Sur l’ensemble des individus étudiés, nous avons mis en évidence 171 ...
49
b. Résultats cytogénétiques
-Caryotypes et FISH ciblée
Le caryotype en bandes G et en bandes R avec un niveau de résolu...
50
-CGH array
La CGH array a été réalisée sur une puce SpectralChip de la société BlueGnome. La
qualité de la technique ét...
51
Figure 13. Profil du chromosome 9 en CGH array chez le sujet 4.
Présence d’une image en miroir en 9p22.3 pour le clone ...
52
-Confirmation par FISH
Pour le clone situé en 1p36.1, la sonde RP11-159A19, marquée avec un fluorochrome
dérivé de la r...
53
-Etude chez les parents
L’étude du caryotype des parents n’a pas montré d’anomalie. L’étude en FISH avec la
sonde RP11-...
54
Chez le père, on a noté la présence de deux signaux présentant une asymétrie de signal
importante, identique à celle re...
55
2. Sujet 38
a. Clinique
Il s’agit d’un fœtus de sexe masculin dont les parents sont jeunes et non apparentés. Le
diagno...
56
Figure 17. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 38.
La couleur bleue indique une région a...
57
D’une part, il existait une image en miroir dans la région 4qter (Figure 18). Même si
tous les rapports de fluorescence...
58
D’autre part, il existait une autre région en miroir. Cette anomalie correspond à une
délétion de la région terminale d...
59
-Confirmation par FISH
La confirmation de ces deux anomalies a été effectuée sur des appositions de tissus
provenant du...
60
Pour confirmer la délétion 15qter, nous avons choisi d’utiliser le clone RP11-89K11,
qui n’était pas répertorié comme v...
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3. Sujet 49
a. Clinique
Il s’agit d’un fœtus dont les parents ne sont pas apparentés. Le diagnostic de hernie de
coupol...
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Figure 22. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 49, mettant en évidence
une anomalie sur ...
63
Lorsqu’on observe le chromosome 17, on voit la présence d’une image en miroir sur la
partie terminale du bras court du ...
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-Confirmation par FISH
Nous avons effectué la vérification sur une apposition faite à partir de tissu cardiaque.
Pour a...
Recherche de microremaniements chromosomiques par CGH array chez des foetus présentant une hernie diaphragmatique
Recherche de microremaniements chromosomiques par CGH array chez des foetus présentant une hernie diaphragmatique
Recherche de microremaniements chromosomiques par CGH array chez des foetus présentant une hernie diaphragmatique
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  1. 1. ACADEMIE DE VERSAILLES UNIVERSITE DE VERSAILLES SAINT-QUENTIN EN YVELINES U F R MEDICALE DE PARIS-ILE-DE-FRANCE-OUEST ANNEE 2009 N° MEMOIRE DU DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES DE BIOLOGIE MEDICALE Conformément aux dispositions du décret du 23 janvier 2003 tient lieu de THESE POUR LE DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE PAR Capucine HYON Née le 20 juin 1980 à Fontenay aux Roses Présentée et soutenue publiquement le 30 septembre 2009 Recherche de microremaniements chromosomiques par CGH array chez des fœtus présentant une hernie diaphragmatique Président : M. Le Professeur M. VEKEMANS Directrice : Mme Le Docteur N. MORICHON-DELVALLEZ
  2. 2. 2 REMERCIEMENTS A Monsieur le Professeur Michel Vekemans qui m’avez fait l’honneur d’accepter la présidence de ce jury. Vous m’avez accueillie dans votre service, et m’avez toujours apporté votre soutien dans la réalisation de mes projets. Veuillez accepter mes hommages respectueux. A Monsieur le Professeur Michel Vidaud. Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de participer à ce jury, veuillez accepter mes remerciements respectueux. A Monsieur le Professeur Jean Michel Dupont. Pour avoir accepter de juger ce travail, veuillez accepter toute ma reconnaissance. A Madame le Docteur Alexandra Bénachi qui m’a permis de réaliser ce travail dans le cadre du Centre de Référence Maladies Rares pour les hernies diaphragmatiques congénitales et qui a eu la gentillesse de participer au jury de cette thèse. Veuillez accepter toute ma gratitude. A Madame le Docteur Nicole Morichon-Delvallez. Pour avoir accepter de diriger ce travail et pour m’avoir donné des conseils avisés, soyez en ici, remerciée. A toute l’équipe du Laboratoire d’Histologie-Embryologie et Cytogénétique de l’hôpital Necker-Enfants Malades et notamment : Au Professeur Serge Romana et au Docteur Valérie Malan, pour m’avoir donné l’envie de faire de la Cytogénétique. Merci à tous deux de m’avoir initiée aux techniques de cytogénétique moléculaire et en particulier à la CGH array. Valérie, merci sincèrement pour ton aide et ta disponibilité. A Jean-Michel et Marie-Christine pour m’avoir aidée à la réalisation de toutes les techniques : sans vous, cela aurait été bien plus difficile. Merci beaucoup pour votre aide. A Céline, Sophie et Stéphanie pour avoir réalisé toutes les techniques de sang du protocole mais également pour votre disponibilité et votre gentillesse.
  3. 3. 3 Aux Docteurs Férechté Razavi, Tania Attié-Bitach, Jélèna Martinovic et Maryse Bonnière Darcy, pour votre contribution et votre disponibilité. A Chantal pour son aide précieuse pour la préparation des échantillons de foetopathologie. Merci encore pour ta grande disponibilité. Aux Docteurs Catherine Turleau, Odile Raoul et Marie-Christine Deblois, pour votre soutien et votre écoute, un grand merci. A tous les autres, médecins, techniciens, secrétaires et agents du laboratoire, sans qui ce travail n’aurait pas pu se faire. Merci à vous tous pour votre aide et votre disponibilité. A toute l’équipe du Laboratoire de Cytogénétique de l’hôpital Armand Trousseau : Au Professeur Jean-Pierre Siffroi, pour m’avoir accueillie dans votre service. Aux Docteurs Marie-France Portnoï, Jacqueline Van Den Akker, Sandra Chantot et Nicole Joyé pour vos enseignements, vos conseils et votre soutien. A toutes les techniciennes et personnels du service. Merci pour votre gentillesse et votre bonne humeur. A tous ceux que j’ai rencontrés pendant mon internat et qui m’ont guidée jusque là : Aux Docteurs Marie-Céline Blanc et Nathalie Neveux pour m’avoir fait découvrir et apprécier la Biologie Médicale. Au Docteur Alexandra Doloy, merci pour tes encouragements ta disponibilité et ton soutien. A toute l’équipe de Robert Debré, en particulier Elisabeth, Julie, Kelly, Laure et Lydia, merci pour votre soutien et votre gaîté.
  4. 4. 4 A vous qui êtes là depuis le début de l’aventure ou bien plus récemment mais qui serez toujours là j’en suis sûr Merci à Chacha, Martin, Mim’s et Arnaud. Merci sincèrement pour votre soutien sans faille, votre disponibilité et votre bonne humeur. Merci à Candice pour tes précieux conseils et surtout pour les fous rires que tu m’as fais partager, ça fait toujours un grand bien. Merci à Marie Laure et Philippe pour votre gaîté. A ma famille, Merci à vous de m’avoir guidée et amenée jusque là. A Thomas, Merci pour tout le soutien et le bonheur que tu m’apportes chaque jour.
  5. 5. 5 TABLE DES MATIERES TITRE ET RESUME EN ANGLAIS .................................................................................................................. 7 ABREVATIONS ................................................................................................................................................... 8 LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................................... 9 LISTE DES TABLEAUX................................................................................................................................... 10 LISTE DES ANNEXES...................................................................................................................................... 10 I. Introduction ............................................................................................................................................... 11 II. Le diaphragme........................................................................................................................................... 12 A. Anatomie du diaphragme........................................................................................................................ 12 1. Centre phrénique................................................................................................................................ 12 2. Portion périphérique musculaire ........................................................................................................ 14 3. Orifices principaux............................................................................................................................. 14 4. Vaisseaux et nerfs .............................................................................................................................. 14 B. Embryologie du diaphragme .................................................................................................................. 15 1. Diaphragme primitif........................................................................................................................... 15 a. Septum transversum...................................................................................................................... 15 b. Mésentère dorsal de l'œsophage.................................................................................................... 15 c. Membranes pleuro-péritonéales .................................................................................................... 15 d. Paroi thoracique ............................................................................................................................ 16 2. Muscularisation du diaphragme......................................................................................................... 17 3. Migration du diaphragme................................................................................................................... 17 C. Anomalies du développement du diaphragme. ....................................................................................... 18 1. Hernies de Bochdalek ........................................................................................................................ 18 2. Hernies non postéro-latérales............................................................................................................. 19 a. Hernies de Morgagni..................................................................................................................... 19 b. Hernies centrales ........................................................................................................................... 19 3. Eventration......................................................................................................................................... 19 D. Bases génétiques des hernies diaphragmatiques.................................................................................... 21 1. Modèles animaux............................................................................................................................... 23 a. Modèle de tératogenèse................................................................................................................. 23 - Métabolisme des rétinoïdes ...................................................................................................... 23 - Rôle des rétinoïdes dans les HCD ............................................................................................ 26 b. Modèles génétiques....................................................................................................................... 27 - Modèle Fog2 (Friend of GATA protein 2) ............................................................................... 28 - Modèle Coup-tfII (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor II)................ 28 - Modèle Gata4 (GATA binding protein 4)................................................................................. 30 - Modèle Wt1 (Wilms tumor 1)................................................................................................... 30 2. Chez l’Homme................................................................................................................................... 31 a. Rétinoïdes et hernie....................................................................................................................... 31 b. Anomalies génétiques fréquentes associées à des HCD................................................................ 31 - Syndromes monogéniques........................................................................................................ 31 - Anomalies chromosomiques..................................................................................................... 33 - Formes familiales ..................................................................................................................... 34 III. Notre travail .......................................................................................................................................... 35 A. Intérêt de la CGH array pour l’étude génétique des hernies de coupole diaphragmatique congénitales...................................................................................................................................................... 35 B. Objectif de l’étude................................................................................................................................... 36
  6. 6. 6 IV. Matériels et méthodes........................................................................................................................... 37 A. Recrutement des sujets............................................................................................................................ 37 1. Cohorte prospective ........................................................................................................................... 37 2. Cohorte rétrospective......................................................................................................................... 37 B. Techniques d’étude................................................................................................................................. 38 1. Caryotypes ......................................................................................................................................... 38 2. Hybridation In Situ Fluorescente (FISH)........................................................................................... 38 a. Principe général............................................................................................................................. 38 b. Matériel d’études........................................................................................................................... 39 c. Préparation des sondes .................................................................................................................. 39 d. Hybridation et lecture.................................................................................................................... 40 e. Applications .................................................................................................................................. 40 - FISH ciblée « hernie diaphragmatique » .................................................................................. 40 - Vérification des CNV............................................................................................................... 41 3. Comparative Genomic Hybridization Array (CGH array)................................................................. 41 a. Principe général............................................................................................................................. 41 b. Préparation des échantillons.......................................................................................................... 43 - Matériel d’étude ....................................................................................................................... 43 - Marquage des ADN.................................................................................................................. 44 c. Hybridation ................................................................................................................................... 45 - Puces BlueGnome .................................................................................................................... 45 - Puces PerkinElmer.................................................................................................................... 45 d. Lecture des lames.......................................................................................................................... 46 e. Analyses........................................................................................................................................ 46 - Puces BlueGnome .................................................................................................................... 46 - Puces PerkinElmer.................................................................................................................... 46 V. Résultats ..................................................................................................................................................... 48 A. Résultats de l’étude en CGH array......................................................................................................... 48 B. Patients présentant une anomalie........................................................................................................... 48 1. Sujet 4 ................................................................................................................................................ 48 a. Clinique......................................................................................................................................... 48 b. Résultats cytogénétiques ............................................................................................................... 49 - Caryotypes et FISH ciblée........................................................................................................ 49 - CGH array ................................................................................................................................ 50 - Confirmation par FISH............................................................................................................. 52 - Etude chez les parents .............................................................................................................. 53 2. Sujet 38 .............................................................................................................................................. 55 a. Clinique......................................................................................................................................... 55 b. Résultats cytogénétiques ............................................................................................................... 55 - CGH array ................................................................................................................................ 55 - Confirmation par FISH............................................................................................................. 59 3. Sujet 49 .............................................................................................................................................. 61 a. Clinique......................................................................................................................................... 61 b. Résultats cytogénétiques ............................................................................................................... 61 - CGH array ................................................................................................................................ 61 - Confirmation par FISH............................................................................................................. 64 VI. Discussion .............................................................................................................................................. 65 VII. Conclusion ............................................................................................................................................. 74 ANNEXES ........................................................................................................................................................... 75 BIBLIOGRAPHIE.............................................................................................................................................. 81
  7. 7. 7 TITLE Search for chromosomal aberrations using array CGH in fetuses with congenital diaphragmatic hernia. SUMMARY Congenital diaphragmatic hernia (CDH) is a common major malformation affecting 1/4000 births. Although the exact etiology of most cases of CDH remains unknown, it is becoming increasingly clear that genetic factors play an important role. The data supporting genetic etiologies include single gene disorders associated with CDH and the association of CDH with recurring chromosome abnormalities. The aim of this work was to study 50 fetuses with syndromic CDH or isolated CDH using array CGH to identify and map new chromosome aberrations in this disease. We identified three different chromosome aberrations: 15q26 deletion which is well known to be implicated in CDH, PTPRD intragenic deletion located on chromosome 9p23 inherited from a healthy parent, responsible for abnormal diaphragmatic development in mouse models and 17pter duplication which implication requires further exploration.
  8. 8. 8 ABREVATIONS ADN : acide désoxyribonucléique CAV : canal atrio-ventriculaire CGH : comparative genomic hybridization CGH array : comparative genomic hybridization array CIV : communication interventriculaire CNP : copy number polymorphisms CNV : copy number variations Cy3 : cyanine 3 Cy5 : cyanine 5 DGV : Database of Genomic Variants dNTP : désoxynucléotides triphosphate DS : déviation standard EDTA : acide éthylène diamine tetra acétique FITC : isothiocyanate de fluorescéine FISH : hybridation in situ fluorescente HCD : hernie de coupole diaphragmatique congénitale IRM : image par résonance magnétique kb : kilobases Mb : mégabases PH : phytohémagglutinine RCIU : retard de croissance intra-utérin SA : semaine d’aménorrhée SDS : sodium dodécyl sulfate SSC : citrate sodique de sel T.E : tris-EDTA
  9. 9. 9 LISTE DES FIGURES Figure 1. Vue inférieure du diaphragme, d’après le Laboratoire d’Anatomie Faculté de Médecine Toulouse-Purpan 2 . .................................................................................................. 13 Figure 2. Coupe tranversale embryonnaire montrant la fermeture des canaux péricardo- péritonéaux, d’après Larsen4 ................................................................................................... 16 Figure 3. Illustration des différents types de hernies diaphragmatiques (vue inférieure du diaphragme), d’après Pober9 ................................................................................................... 20 Figure 4. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement pulmonaire, d’après Klaassens et al14 . ........................................................... 22 Figure 5. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement du diaphragme, d’après Klaassens et al14 . ..................................................... 22 Figure 6. Schéma général de la voie de signalisation des rétinoïdes, d’après Montedonico et al6 . ............................................................................................................................................ 25 Figure 7. Aperçu du thorax et de l’abdomen après dissection et aspect du diaphragme chez des souris témoins et des souris mutantes pour Coup-tfII, d’après You et al26 . ...................... 29 Figure 8. Schéma récapitulatif des principales anomalies chromosomiques associées aux HCD, d’après Holder et al39 . ................................................................................................... 33 Figure 9. Synoptique comparatif des principales étapes entre la CGH sur chromosomes et la CGH array, d’après Sanlaville et al52 ...................................................................................... 42 Figure 10. Représentation graphique de la technique en « dye swap ». ................................. 43 Figure 11. FISH ciblée métaphasique, chez le Sujet 4, ne montrant pas d’anomalie. ............ 49 Figure 12. Profil du chromosome 1 en CGH array chez le sujet 4.......................................... 50 Figure 13. Profil du chromosome 9 en CGH array chez le sujet 4.......................................... 51 Figure 14. FISH métaphasique chez le sujet 4 montrant une asymétrie de signal franche avec la sonde RP11-176P17 située en 9p23 (en vert)...................................................................... 52 Figure 15. FISH réalisée chez la mère du sujet 4 montrant deux signaux verts (sonde RP11- 176P17) en place et symétriques.............................................................................................. 53 Figure 16. FISH réalisée chez le père du sujet 4 montrant une asymétrie de signal pour la sonde RP11-176P17 située en 9p23 (vert)............................................................................... 54 Figure 17. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 38. ........... 56 Figure 18. Profil du chromosome 4 en CGH array chez le sujet 38........................................ 57 Figure 19. Profil du chromosome 15 en CGH array chez le sujet 38..................................... 58 Figure 20. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-52G4 chez le sujet 38 montrant la présence de 3 signaux verts (RP11-52G4) dans tous les noyaux examinés......................... 59 Figure 21. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-89K11 chez le sujet 38 montrant la présence d’un seul signal vert (RP11-89K11) dans tous les noyaux examinés. .................. 60 Figure 22. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 49, mettant en évidence une anomalie sur le bras court du chromosome 17. ............................................ 62 Figure 23. Profil du chromosome 17 en CGH array du sujet 49............................................. 63
  10. 10. 10 Figure 24. FISH interphasique réalisée avec le contig 17pter chez le sujet 49 montrant la présence de 3 signaux verts (contig 17pter) et de 2 signaux rouges (contig 8qter). ............... 64 Figure 25. Détail de la région comprenant NR2F2 (COUP-TFII) et IGF1R.......................... 66 Figure 26. Schéma de la translocation t(4;15)(q34.1;q26.2) et les dérivés der(4) et der(15). 67 Figure 27.Aspect du diaphragme et coupe transversale du diaphragme chez des souris témoins et des souris double-mutantes (RPTP-σ-/-/δ-/-), d’après Uetani et al63 ..................... 69 Figure 28. Idéogramme du bras court du chromosome 17 avec la schématisation de la duplication 17p retrouvée chez notre patient (sujet 49) et celles rapportées dans la littérature.................................................................................................................................. 71 LISTE DES TABLEAUX Tableau 1. Exemples de modèles murins de HCD, d’après Ackerman et al5 . ......................... 27 Tableau 2. Syndromes monogéniques pour lesquels la HCD est l’élément principal, d’après Pober12 . .................................................................................................................................... 32 LISTE DES ANNEXES Annexe I. Caractéristiques de la cohorte prospective.............................................................. 75 Annexe II. Caractéristiques de la cohorte rétrospective.......................................................... 76 Annexe III. Protocole de culture de sang périphérique. .......................................................... 77 Annexe IV. Principe de la RCA. ............................................................................................... 78 Annexe V. Principe de marquage par la technique de « Nick-translation »............................ 79 Annexe VI. Protocole d’extraction d’ADN à partir de sang frais total. .................................. 80 Annexe VII. Protocole d’extraction d’ADN à partir de tissus congelés. ................................. 80
  11. 11. 11 I. Introduction Le diaphragme est un organe essentiel séparant les viscères thoraciques des viscères abdominaux. Les anomalies de son développement embryonnaire conduisent à différents types de pathologies congénitales dont les hernies diaphragmatiques. De nombreux arguments existent en faveur d’une origine génétique des hernies de coupole diaphragmatique congénitales (HCD). En effet, celles-ci sont retrouvées dans de nombreux syndromes monogéniques. Par ailleurs, des anomalies chromosomiques récurrentes sont également associées à la survenue d’une HCD. Enfin, l’existence de récidives de HCD dans certaines familles conforte cette hypothèse. Ceci nous a poussé à explorer, par une étude globale du génome, des fœtus ayant une HCD, pour rechercher de nouvelles anomalies chromosomiques responsables de hernies syndromiques ou non. Nous avons choisi comme méthode d’analyse, la CGH array (Comparative Genomic Hybridization array). Celle-ci permet une étude rapide de l’ensemble du génome avec une résolution bien supérieure à celle du caryotype standard. Cette étude a été rendue possible car l’hôpital Necker-Enfants Malades est Centre de Références des Maladies Rares pour la hernie de coupole diaphragmatique. Ce centre, dont le coordonnateur est le Docteur Alexandra Bénachi, a initié plusieurs travaux de recherche sur les bases moléculaires des HCD. C’est dans ce cadre qu’un protocole de recherche sur les causes chromosomiques de HCD a été instauré.
  12. 12. 12 II. Le diaphragme A. Anatomie du diaphragme Le diaphragme est une cloison musculo-aponévrotique qui joue un double rôle, d’une part, il permet de séparer la cavité thoracique de la cavité abdominale et, d’autre part, il est l’élément essentiel de la dynamique respiratoire. La partie périphérique du diaphragme est un muscle large et mince formé d’une portion verticale, dite vertébro-lombaire qui correspond aux piliers et d’une portion horizontale, dite sterno-chondro-costale, composée de 2 coupoles qui, en expiration forcée, se projettent au niveau du 4ème espace intercostal pour la coupole droite et au niveau du 5ème espace intercostal pour la coupole gauche1 . Il est composé d’un ensemble de muscles digastriques dont les tendons intermédiaires sont réunis sur un centre tendineux unique que l’on appelle le centre phrénique. La partie musculaire périphérique prend ses insertions sur le squelette de la cage thoracique en ventral et latéral, et sur le rachis lombaire en dorsal. On distingue donc à cet ensemble musculaire, situé en périphérie, une partie lombaire, une partie costale et une partie sternale. 1. Centre phrénique Le centre phrénique, partie centrale du diaphragme, est une nappe tendineuse blanc nacrée, en forme de feuille de trèfle à trois folioles, constituée par la réunion de l'ensemble des tendons intermédiaires : - la foliole antérieure, large et courte, est allongée transversalement et se rapproche en ventral du sternum ; - les folioles latérales, réunies à la foliole antérieure par une portion rétrécie ou pédicule, sont obliques en dorsal et en latéral. Au niveau de la foliole latérale droite, les deux bandelettes semi-circulaires supérieure et inférieure délimitent l'orifice de la veine cave inférieure (Figure 1).
  13. 13. 13 Figure 1. Vue inférieure du diaphragme, d’après le Laboratoire d’Anatomie Faculté de Médecine Toulouse-Purpan 2 . Le centre phrénique est représenté en gris. La portion périphérique musculaire est représentée en marron. 1. Orifice de la veine cave inférieure ; 2. Orifice de l’œsophage ; 3. Orifice de l’aorte.
  14. 14. 14 2. Portion périphérique musculaire La partie musculaire est elle-même composée de 3 parties : lombaire, costale et sternale. La partie lombaire est la plus puissante et composée des piliers gauche et droit du diaphragme. Ils participent à la formation des orifices oesophagien et aortique (Figure 1). Ils sont reliés entre eux par le ligament médian. L'orifice aortique se situe en face de T12-L1 et l'orifice oesophagien est situé au niveau de T10, ventralement par rapport à l'aorte. Ce dernier est complètement encerclé par des muscles. La partie costale du muscle diaphragmatique naît à partir de 6 arcs costaux cartilagineux et irradie vers la partie tendineuse. Il existe un hiatus sans élément musculaire entre les parties lombaire et costale; plus souvent à gauche qu'à droite (hiatus de Bochdalek). Dans ces zones "affaiblies", seuls la plèvre et le péritoine séparent les cavités péritonéale et pleurale. La partie sternale est constituée de petits segments musculaires émergeants de l'aponévrose abdominale et du processus xiphoïde. Entre les parties sternale et costale, on observe un espace étroit clos par du tissu conjonctif : à droite, l'espace de Morgagni et à gauche la fente de Larey par où transitent des vaisseaux épigastriques et lymphatiques. 3. Orifices principaux Le hiatus aortique, fibreux et inextensible, se projette au niveau de T12. L’aorte est accompagnée en arrière par le canal thoracique. Le hiatus oesophagien, musculaire et extensible, se projette au niveau de T10, il contient également les nerfs pneumogastriques. L’orifice de la veine cave inférieure, fibreux et inextensible se projette en T9. 4. Vaisseaux et nerfs La vascularisation du diaphragme est assurée principalement par les artères phréniques inférieures droite et gauche naissant de l’aorte abdominale à hauteur de T12. Les artères phréniques inférieures, plus accessoires naissent de l’artère thoracique interne. L’innervation est assurée par les nerfs phréniques droit et gauche. Ils naissent essentiellement du 4ème nerf spinal. Ce sont les nerfs moteurs du diaphragme.
  15. 15. 15 B. Embryologie du diaphragme Le diaphragme se forme à partir de la réunion de 4 structures qui vont former le diaphragme primitif. Celui-ci va ensuite se musculariser puis migrer pour atteindre sa position définitive3 . 1. Diaphragme primitif Le diaphragme primitif se forme entre la 4ème et la 7ème semaine de vie intra-utérine par fusion du septum transversum, des membranes pleuro-péritonéales, du mésentère dorsal de l'œsophage et des muscles de la paroi thoracique. a. Septum transversum Cette structure forme le centre phrénique du diaphragme adulte. Le septum transversum est identifiable à la fin de la 3ème semaine sous forme d'une masse ventrale, non divisée, de mésoblaste. Au cours de la quatrième semaine, cette masse s'étend en arrière et forme une cloison incomplète, ou diaphragme partiel qui sépare le cœlome en deux cavités secondaires, l'une ventro-craniale ou péricardique, l'autre dorso-caudale ou pleuro-péritonéale, qui communiquent latéralement par les gouttières pleuro-péricardiques. Le septum transversum fusionne en arrière, sur la ligne médiane avec le méso-œsophage. b. Mésentère dorsal de l'œsophage Le mésentère dorsal de l'œsophage constitue la partie médiane du diaphragme. Il donne en arrière les deux piliers principaux du diaphragme. c. Membranes pleuro-péritonéales Elles naissent de la partie dorso-latérale de la paroi du corps et forment progressivement les canaux péricardo-péritonéaux entre la 5ème et la 6ème semaine. Elles vont se fixer, en avant, à la partie dorsale du septum transversum et en dedans, aux bords latéraux du mésentère dorsal de l'œsophage (Figure 2). Elles achèvent ainsi le cloisonnement entre la cavité thoracique et la cavité abdominale. C'est le diaphragme primitif. La dernière partie à se former est postéro-latérale et correspond au Foramen de Bochdalek.
  16. 16. 16 d. Paroi thoracique Le quatrième composant du diaphragme vient de la paroi du corps, plus tardivement, entre la 9ème et la 12ème semaine. Les cavités pleurales s'agrandissent et s'enfoncent dans les parois corporelles latérales. Les tissus de la paroi du corps laissés en dedans par la pénétration pleurale vont constituer les parties périphériques externes du diaphragme et vont se développer aux dépens des membranes pleuro-péritonéales qui ne représentent plus que de toutes petites parties intermédiaires sur le diaphragme final. L'extension ultérieure des cavités pleurales dans la paroi du corps forme les culs-de-sac costo-diaphragmatiques et détermine la forme en dôme du diaphragme primitif. Figure 2. Coupe transversale embryonnaire montrant la fermeture des canaux péricardo-péritonéaux, d’après Larsen4 . A. Début de la 5ème semaine de développement embryonnaire, les flèches indiquent la migration des membranes pleuro-péritonéales. B. Septième semaine de développement embryonnaire, la fermeture du canal pleuro- péritonéal est complète. Aorte Membrane pleuro – péritonéale Intestin antérieur Veine cave inférieure Septum transversum Paroi du tronc A B Latéral gauche Ventral
  17. 17. 17 2. Muscularisation du diaphragme Les myoblastes dérivés des myotomes cervicaux migrent et forment la musculature diaphragmatique. Cette colonisation musculaire postérieure est complétée à partir des cellules mésenchymateuses du septum transversum et à partir des myotomes thoraciques lors du creusement de la paroi du corps. 3. Migration du diaphragme Pendant la 4ème semaine, le septum transversum ou diaphragme partiel se situe en face des somites cervicaux supérieurs. Pendant la 5ème semaine, le nerf venu du 4ème segment cervical pénètre dans le septum transversum et constitue, de chaque coté, le nerf phrénique. La croissance rapide de la partie dorsale du corps de l'embryon par rapport à celle de la partie ventrale, produit une migration apparente ou descente du diaphragme. Vers la 6ème semaine, le diaphragme en développement est situé au niveau des somites thoraciques, et c'est au cours de la 8ème semaine que la partie dorsale du diaphragme se retrouve au niveau de la première vertèbre lombaire.
  18. 18. 18 C. Anomalies du développement du diaphragme. Les anomalies de développement du diaphragme surviennent dans environ 1/3000 à 1/4000 naissances vivantes5 . Il faut savoir que le terme de « hernie diaphragmatique » recouvre en définitive un large spectre d’anomalies, ce qui augmente la difficulté de compréhension des mécanismes de survenue. Sous le terme de hernies diaphragmatiques, il faut distinguer les hernies diaphragmatiques proprement dites qui se caractérisent par la présence d’un brèche dans le diaphragme entraînant une communication anormale entre la cavité abdominale et la cavité thoracique, des éventrations diaphragmatiques qui sont caractérisées par la persistance d’une fine membrane et qui sont en réalité un défaut de muscularisation du diaphragme. Toutefois, il est possible de voir coexister les deux types d’anomalies chez un même patient. Le plus souvent, les hernies diaphragmatiques sont accompagnées d’une anomalie du développement pulmonaire engageant le pronostic respiratoire5 . Dans près de la moitié des cas, elles sont accompagnées de malformations touchant d’autres organes, on parle alors de hernies syndromiques. Dans près de 85% des cas, la hernie survient du côté gauche, dans 13% des cas du côté droit et dans 2% des cas des deux côtés à la fois6 . On distingue également les hernies en fonction de leur localisation, antérieure ou postérieure. 1. Hernies de Bochdalek La hernie de Bochdalek se situe dans la région postéro-latérale du diaphragme. C’est le type de hernie le plus fréquent, environ 90 à 95% des hernies congénitales7 . La majorité des hernies de Bochdalek surviennent du côté gauche tandis que les hernies de Bochdalek, à droite ou bilatérales, ne comptent que pour 15 à 20 %7,8 . Différents degrés de déficit du rebord musculaire postérieur sont retrouvés : dans certains cas, la musculature est complètement absente tandis que dans d’autres cas, le bord est bien préservé (Figure 3). Le plus souvent le feuillet péritonéal et le feuillet pleural sont continus au niveau de la brèche, c’est la hernie sans sac. Parfois, la masse intestinale est recouverte d’un feuillet péritonéal et pleural, c’est la hernie avec sac.
  19. 19. 19 2. Hernies non postéro-latérales9 a. Hernies de Morgagni. Le terme de hernie de Morgagni regroupe les hernies retrosternales ou parasternales. Elles représentent 5 à 10% des HCD. Les hernies de Morgagni se développent à droite dans 90% des cas et à gauche dans seulement 2% des cas en raison de la présence du cœur. Elles comportent de façon quasi-constante un sac herniaire à la différence des hernies de Bochdalek. Les hernies de Morgagni sont latentes dans la plus part des cas, découvertes de façon fortuite à l’âge adulte. b. Hernies centrales Les hernies centrales concernent la partie tendineuse du diaphragme. Elles sont liées à un défaut de développement du septum transversum. Liu et al. ont démontré en 2003 qu’elles avaient un mécanisme de survenue bien différent des autres types de hernie10 . 3. Eventration L’éventration se caractérise par la présence d’une paroi diaphragmatique très fine qui se distend et qui permet aux viscères abdominaux de se retrouver dans la cavité thoracique. La surface intéressée par cette finesse du diaphragme peut varier de quelques centimètres à pratiquement toute une coupole diaphragmatique.
  20. 20. 20 Figure 3. Illustration des différents types de hernies diaphragmatiques (vue inférieure du diaphragme), d’après Pober9 .
  21. 21. 21 D. Bases génétiques des hernies diaphragmatiques La pathogénie et l’étiologie des hernies diaphragmatiques sont encore très mal comprises. Actuellement, deux concepts principaux s’affrontent au sujet du primum movens de la hernie de coupole diaphragmatique congénitale : - l’orifice diaphragmatique est primitif et entraîne une hypoplasie pulmonaire ; - une anomalie primitive du mésenchyme pulmonaire permet aux viscères abdominaux de pénétrer dans le thorax, ce qui empêche la fermeture du diaphragme et entraîne une hypoplasie du diaphragme11 . En 2008, dans une revue de la littérature portant sur les aspects génétiques des hernies diaphragmatiques12 , Pober souligne les faits suivants en faveur d’une origine génétique des hernies diaphragmatiques syndromiques : - existence d’anomalies chromosomiques récurrentes chez des patients non apparentés, révélant la présence de hot spots de HCD ; - existence de syndromes monogéniques dont la malformation principale est une hernie diaphragmatique ; les gènes pour la plupart de ces anomalies sont connus et permettent d’avoir un aperçu des voies de signalisation impliquées dans le développement normal du diaphragme ; - survenue de plusieurs cas dans une même famille. Il existe également quelques arguments en faveur d’une origine génétique dans les HCD isolées. En effet, Ackerman et al., en 2005, ont mis en évidence une mutation dans le gène FOG2 chez une patiente ayant une HCD isolée13 . En 2009, Klassens et al., dans le but de préciser les gènes et facteurs pouvant être impliqués dans la survenue de HCD, décrivent dans deux schémas les différentes voies de signalisation et les différents gènes impliqués dans la formation des poumons et du diaphragme (Figure 4 et 5)14 .
  22. 22. 22 Figure 4. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement pulmonaire, d’après Klaassens et al14 . Figure 5. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement du diaphragme, d’après Klaassens et al14 . Ces deux schémas permettent de mettre en évidence plusieurs voies de signalisation communes au développement de ces deux organes, en particulier la voie des rétinoïdes. Ils mettent également en avant le rôle de certains gènes tels que COUP-TFII, FOG2 et GATA4 dans le développement normal de ces deux organes.
  23. 23. 23 Ceci est en faveur de la survenue d’une anomalie simultanée du parenchyme pulmonaire et du diaphragme dans la genèse de la hernie diaphragmatique. 1. Modèles animaux Pour essayer de préciser l’origine des hernies diaphragmatiques, différentes études ont été menées à l’aide de modèles animaux. Ces modèles sont très différents puisque certains font appel à la tératogenèse, d’autres sont obtenus par mutagenèse ou transgenèse. Le premier modèle animal étudié est celui dont la hernie a été induite par le nitrofène, un toxique qui intervient sur la voie des rétinoïdes. a. Modèle de tératogenèse Depuis de nombreuses années, le nitrofène (2,4-dichlorophenyl-p-nitropheniyl ether) est utilisé chez le rat pour créer des modèles de hernies diaphragmatiques. En effet, le nitrofène est inoffensif chez le rat adulte, mais administré entre le 8ème et le 10ème jour de gestation chez le rat, celui-ci entraîne un fort taux de hernie diaphragmatique associée à une hypoplasie pulmonaire et des anomalies de vascularisation des poumons, similaires aux anomalies retrouvées chez l’Homme15 . -Métabolisme des rétinoïdes6 Les rétinoïdes sont une famille de molécules qui dérivent de la vitamine A essentielle à la différenciation, à la croissance et au développement. La vitamine A est retrouvée dans l’alimentation en particulier dans la viande animale ou bien le β-carotène présent dans les légumes. Après absorption aux niveau de l’intestin, les rétinyl esters sont transportés jusqu’au foie pour y être stockés puis métabolisés en rétinol. Le rétinol est ensuite transporté aux tissus cibles par l’intermédiaire de la retinol-binding-protein (RBP) sécrétée par le foie complexé à la transthyrétine (Figure 6). Le rétinol se fixe ensuite sur le récepteur cellulaire puis est internalisé dans la cellule cible. Dans le cytoplasme, le rétinol peut être soit oxydé en rétinal, soit estérifié en rétinyl ester par la lecithin retinol acetyltransferase, pour être stocké.
  24. 24. 24 Si le rétinol subit une oxydation, celui-ci est pris en charge dans le cytoplasme par la cellular retinol binding protein I (CRBP-I) puis est transformé en rétinal par la retinol dehydrogenase (ROLDH) suivi d’une deuxième étape de déshydrogénation par les quatre retinal dehydrogenase cytosoliques (RALDH), pour être transformé en acide rétinoïque. La retinal dehydrogenase RALDH2 est celle qui a un rôle prépondérant dans la formation de l’acide rétinoïque. L’acide rétinoïque est le métabolite actif des rétinoïdes. Une fois synthétisé dans la cellule, celui-ci entre dans le noyau et se fixe à deux classes de facteurs de transcription intra- nulcéaires : retinoic acide receptors (RARs) et retinoid X receptors (RXRs). Il existe trois membres de chaque classe nommés RARα, RARβ et RARγ et RXRα, RXRβ et RXRγ. Pour agir sur un gène sensible à l’acide rétinoïque, il se forme un hétérodimère entre une des molécules RARs et RXRs. C’est l’hétérodimère RAR-RXR qui est l’unité active pour la transduction du signal de la voie des rétinoïdes, au niveau du gène. Par ailleurs, l’acide rétinoïque est inactivé par l’enzyme Cyp26, de la famille du cytochrome P450.
  25. 25. 25 Figure 6. Schéma général de la voie de signalisation des rétinoïdes, d’après Montedonico et al6 .
  26. 26. 26 -Rôle des rétinoïdes dans les HCD La première preuve du lien existant entre les rétinoïdes et les HCD provient des études menées dès les années 1940 par Andersen, chez des rats ayant une alimentation déficiente en vitamine A. Dans 25 à 70% des cas, il existe une hernie diaphragmatique chez les jeunes rats avec une prédominance de hernie de coupole droite16 . Dans les années 1950, Wilson et al. montrent que la réintroduction de la vitamine A dans l’alimentation permet de diminuer le taux de hernies diaphragmatiques et que celui-ci devient nul si la vitamine A est réintroduite aux 10ème et 11ème jours de gestation17 . Différents auteurs ont étudié les modèles de hernies induites pas le nitrofène. Ces études suggèrent que le nitrofène agit sur l’activité de la RALDH2 en inhibant celle-ci18,19 . D’autres auteurs ont montré que l’administration concomitante de nitrofène et de vitamine A permettait de diminuer le taux de hernie de 80 à 20 - 40% en fonction du moment où la vitamine A était réintroduite20-22 . Une autre étude a montré que la diminution était encore plus marquée si l’acide rétinoïque était administré, à la place de la vitamine A (incidence diminuée de 54% à 8%)23 . Ceci suggère que la diminution de l’activité enzymatique de RALDH2 induite par le nitrofène peut être bloquée par une forte dose de substrat (vitamine A). D’autre part, l’administration d’acide rétinoïque diminue fortement l’incidence des hernies chez le rat car elle permet de contourner l’altération de RALDH223 . L’ensemble de ces résultats montre que la voie de signalisation des rétinoïdes ainsi que le précurseur, la vitamine A semblent jouer un rôle important dans la survenue des hernies diaphragmatiques. D’autres modèles animaux ont également été étudiés pour approfondir les mécanismes de survenue des HCD.
  27. 27. 27 b. Modèles génétiques Différents modèles de souris génétiquement modifiées ayant des lacunes diaphragmatiques variables ont été étudiés. Il a été mis en évidence que certains gènes impliqués dans l’apparition d’un orifice anormal chez la souris sont également impliqués chez l’Homme. En 2007, Ackerman et al. ont rassemblé les principaux modèles murins qui ont été étudiés pour comprendre l’implication des différents gènes dans la formation normale et pathologique du diaphragme chez l’Homme5 . L’ensemble de ces modèles est rassemblé dans le tableau suivant : Tableau 1. Exemples de modèles murins de HCD, d’après Ackerman et al5 . Certains de ces modèles ont été particulièrement étudiés puisqu’ils sont associés à des anomalies chez l’Homme.
  28. 28. 28 -Modèle Fog2 (Friend of GATA protein 2) En 2007, l’équipe d’Ackerman a étudié des souris traitées par un agent chimique mutagène, le N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) et qui présentaient une hypoplasie pulmonaire associée à une anomalie de développement du diaphragme (hernie postérieure) et du coeur5 . Ils ont mis en évidence une mutation dans le gène Fog2, entraînant la synthèse d’une protéine Fog2 tronquée. Fog2 code pour une protéine à doigts de zinc qui module l’activité transcriptionnelle de Gata4, facteur de transcription impliqué dans l’embryogenèse précoce. D’autre part, le schéma de Klaassens met en évidence l’interaction de FOG2 avec COUP-TFII14 . L’étude chez l’Homme du gène orthologue FOG213 , situé en 8q23, dans une cohorte de 30 enfants décédés et présentant une hernie diaphragmatique, a mis en évidence la présence d’une mutation, survenue de novo, dans la séquence de FOG2 chez une seule patiente, entraînant l’apparition d’un codon STOP et une protéine tronquée n’ayant pas le domaine en doigts de zinc. Les auteurs considèrent que la mutation survenue de novo est responsable du phénotype de la patiente. Bleyl et al., en 2007, ont également séquencé FOG2 chez 96 patients présentant une hernie diaphragmatique24 . Ils ont mis en évidence une mutation chez deux patients. Ces mutations n’entraînent pas l’apparition d’un codon STOP mais sont responsables de la substitution d’un acide aminé conservé à proximité ou au niveau du domaine en doigts de zinc. Elles n’ont pas été retrouvées chez des sujets contrôles. Ce modèle montre l’importance de FOG2 dans le développement du diaphragme et le rôle qu’il peut jouer dans la survenue d’une hernie diaphragmatique par défaut d’interaction avec les autres gènes impliqués dans l’embryogenèse du diaphragme et en particulier GATA4 et COUP-TFII -Modèle Coup-tfII (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor II) En 2005, Klaassens par une étude en CGH array (Comparative Genomic Hybridization array) met en évidence une région critique pour les HCD25 d’environ 5Mb située en 15q26.1- q26.2. Quatre gènes sont situés dans cet intervalle et Klassens met en avant un gène, COUP- TFII, précédemment nommé NR2F2, qui est un gène codant pour un facteur de transcription agissant comme un répresseur sur la voie de signalisation des rétinoïdes.
  29. 29. 29 You en 2005, suite à ces résultats, étudie ce gène Coup-tfII chez la souris26 . Des études précédentes avaient montré que des souris Coup-tfII -/- présentaient un défaut d’angiogenèse et de développement cardiaque et mouraient avant le 10ème jour de développement embryonnaire27 . C’est pourquoi ils ont conçu un modèle de souris conditionnel, où Coup-tfII n’est pas exprimé dans le tissu mésentérique. La plupart de ces mutants présentaient une hernie postérieure de type Bochdalek, identique à celle que l’on retrouve chez l’Homme (Figure 7). Figure 7. Aperçu du thorax et de l’abdomen après dissection et aspect du diaphragme chez des souris témoins et des souris mutantes pour Coup-tfII, d’après You et al26 . Les auteurs ont montré que la délétion du gène Coup-tfII contribuait à l’apparition d’une HCD. Cependant, l’absence de hernie de coupole chez les mutants hétérozygotes soulève le problème du mécanisme de survenue des HCD chez les patients présentant une délétion de COUP-TFII. Pour expliquer cette différence, les auteurs suggèrent que d’autres mutations dans les allèles de COUP-TFII ou dans d’autres molécules telles que FOG2 interagissant avec COUP-TFII sont nécessaires pour le développement d’une hernie diaphragmatique chez l’Homme. CDH of P0 mutant mouse. (A and B) Frontal view of representative P0 newborn mice. (A) Control newborn. (B) Mutant CDH at P0. In the mutant, the stomach is located in the center of the thorax, just above the diaphragm, the liver is herniated, and the left lung is severely compressed. The heart is also mislocated to the right thorax, exhibiting dextroposition. (C and D) Dissected diaphragm illustrates the presence of a left-sided dorsolateral hernia in the mutant. The dissected diaphragm has been placed with the abdominal side facing the objective, with the dorsal side on top. Note the large left-sided dorsolateral defect of the diaphragm forming a hole (indicated by an arrow), which permitted the abdominal contents (e.g., stomach) to herniate into the thorax. H, heart; Lg, lung; SC, spinal cord; St, stomach; Lv, liver.
  30. 30. 30 -Modèle Gata4 (GATA binding protein 4) La microdélétion de la région 8p23.1, chez l’Homme, contenant le gène GATA4 a été rapportée de nombreuses fois dans les hernies diaphragmatiques28-32 . GATA4, gène codant pour un facteur de transcription connu pour être responsable d’anomalies du développement cardiaque, interagit avec FOG2. En tenant compte de tous ces points, Jay et al., en 2007, ont évoqué le rôle de GATA4 dans la survenue de HCD d’autant plus souvent qu’une anomalie cardiaque est associée33 . Pour vérifier cette hypothèse, ils ont conçu et étudié des souris mutantes Gata4 +/- . Ils ont mis en évidence la présence d’une hernie diaphragmatique associée à des anomalies des voies aériennes et du développement cardiaque. Les souris mutantes présentent une HCD dans environ 30% des cas, tandis que les malformations cardiaques sont constantes. Ils ont également montré que l’interaction entre Gata4 et Fog2 (ou d’autres facteurs de transcription) régule la fonction cellulaire du mésenchyme pendant le développement du diaphragme et des poumons. -Modèle Wt1 (Wilms tumor 1) Alors que des souris mutantes Wt1 -/- ont été produites pour étudier le rôle de ce gène dans les malformations du tractus urinaire, des cas de hernie diaphragmatique ont été identifiés34 . Le gène WT1, situé en 11p13, qui code pour une DNA-binding protein ayant 4 domaines en doigts de zinc est connu pour agir comme un facteur de transcription mais également comme ayant un rôle dans la formation des ARN. Clugston et al. ont décidé d’étudier ce gène puisqu’il est exprimé dans le mésothéliome pleural et abdominal qui aboutit à la formation du diaphragme. Dans cette étude, ils ont montré qu’il existait bien des hernies diaphragmatiques chez des souris Wt1 -/- et que celles-ci étaient liées à une anomalie du développement de la partie non musculaire de la membrane pleuro-péritonéale.
  31. 31. 31 2. Chez l’Homme a. Rétinoïdes et hernie En 1998, Major et al. ont réalisé une étude clinique pour évaluer le lien entre vitamine A et HCD chez l’Homme35 . Le rétinol et RBP ont été mesurés chez 11 nouveaux-nés en bonne santé et 11 nouveaux-nés présentant une hernie de coupole. Les résultats ont montré que la concentration en rétinol et RBP, mesurés au niveau du cordon, était diminuée de 50% chez les enfants avec hernie par rapport aux enfants sains. A l’inverse le taux de rétinol et de RBP était augmenté dans le sang des mères ayant un enfant avec une hernie. Devant ces résultats, les auteurs ont suggéré une possible détérioration du transport du rétinol à travers le placenta. b. Anomalies génétiques fréquentes associées à des HCD De nombreuses anomalies génétiques associées à la survenue d’une hernie diaphragmatique ont été rapportées dans la littérature. Ces différentes anomalies sont soit des syndromes monogéniques soit des anomalies chromosomiques récurrentes. -Syndromes monogéniques En 2008, dans une revue de la littérature sur les hernies diaphragmatiques, Pober regroupe les principaux syndromes monogéniques dans lesquels, la hernie diaphragmatique est fréquemment retrouvée12 . Le tableau 2 rassemble ces syndromes et les gènes impliqués lorsqu’ils sont connus.
  32. 32. 32 Tableau 2. Syndromes monogéniques pour lesquels la HCD est l’élément principal, d’après Pober12 . On retrouve dans ce tableau l’implication du gène STRA6 dans la survenue du syndrome de Matthew-Wood. D’après les schémas de Klaassens (Figure 4 et 5) STRA6 est impliqué dans la formation du diaphragme et des poumons. D’autre part, on voit également la présence du gène WT1 dont on a vu précédemment son implication dans la survenue de HCD.
  33. 33. 33 -Anomalies chromosomiques Dès 1996, des anomalies chromosomiques ont été identifiées comme étant responsables de hernies diaphragmatiques36 . En 2003, Lurie a analysé près de 150 cas de hernies diaphragmatiques rapportées dans la littérature. Les délétions des régions 15q26, 8p23, sont le plus fréquemment rapportées en association avec une HCD37,38 . Les régions 22q11, 4q28.3q32, sont également rapportées comme des régions associées aux HCD mais lorsqu’elles sont dupliquées. La tétrasomie 12p associée au syndrome de Pallister-Killian est une anomalie chromosomique souvent impliquée dans les HCD puisque Lurie dénombre plus de 50 cas de hernie diaphragmatique associés à ce syndrome. En 2007, Holder reprend toutes les anomalies chromosomiques répertoriées dans la littérature39 et délimite les régions les plus fréquemment impliquées dans les HCD. Son travail est schématisé dans le Figure 8. Figure 8. Schéma récapitulatif des principales anomalies chromosomiques associées aux HCD, d’après Holder et al39 .
  34. 34. 34 Nous retrouvons parmi ces anomalies, les délétions 15qter comprenant le gène COUP- TFII qui sont rapportées 26 fois dans la littérature, et les délétions 8p23 comprenant le gène GATA4. -Formes familiales Dans la littérature, plus de 50 familles, dont au moins deux apparentés sont atteints et pour lesquels il n’a pas été mis en évidence d’anomalie chromosomique, ont été rapportées9 . D’après l’Association of Congenital Diaphragmatic Hernia Research, Advocacy and Support (CHERUBS), dans 2% des cas, le sujet atteint a un apparenté du premier degré également atteint. Cependant, les cas familiaux de HCD représentent un groupe très hétérogène. En effet, différents modes de transmission ont été évoqués : - dans le cas des familles consanguines, l’hypothèse d’une transmission autosomique récessive est évoquée40,41 ; - dans le cas des familles non consanguines, l’hypothèse d’une transmission autosomique récessive ou bien liée à l’X est proposée car dans certaines familles étudiées, les sujets atteints sont parfois de sexe opposé mais le plus souvent de même sexe masculin9,42,43 ; - dans quelques cas, transmission apparemment autosomique dominante, avec deux cas rapportés dans la littérature, de parents atteints d’une éventration diaphragmatique, ayant eu un enfant avec une HCD44,45 . Cependant, un mode de transmission plus complexe faisant intervenir plusieurs gènes ayant des effets complémentaires ne peut pas être exclu. Par ailleurs, les formes familiales sont également hétérogènes du point de vue clinique puisqu’elles peuvent être isolées ou bien syndromiques. Des analyses de liaison n’ont pas encore été réalisées du fait de la mortalité liée à la hernie et de l’hétérogénéité des formes familiales.
  35. 35. 35 III.Notre travail A. Intérêt de la CGH array pour l’étude génétique des hernies de coupole diaphragmatique congénitales Les techniques de cytogénétique ont beaucoup évolué depuis la découverte du nombre exact de chromosomes chez l’Homme en 1956. La réalisation du caryotype, avec l’introduction des techniques de bandes, a permis d’améliorer la résolution et la sensibilité de l’analyse cytogénétique. Cependant, l’analyse du caryotype en haute résolution ne permet pas de mettre en évidence des anomalies dont la taille est inférieure à 5 Mb. L’introduction des techniques de cytogénétique moléculaire et en particulier l’Hybridation In Situ Fluorescente (FISH) dans les années 1990 a permis d’augmenter le degré de résolution et la sensibilité de l’analyse cytogénétique. Toutefois cette technique a également une limite. Elle ne permet de mettre en évidence que des anomalies ciblées. C’est pourquoi, à la fin des années 1990 les puces à ADN ou micro-array ont été mises au point pour permettre un criblage global du génome avec une meilleure résolution. Jusqu’en 2005, la quasi-totalité des applications et des publications liées à la CGH array concernaient la cytogénétique oncohématologique et la cytogénétique des tumeurs. Cette technique a ensuite été utilisée en cytogénétique constitutionnelle, dans un premier temps pour borner des anomalies diagnostiquées par la cytogénétique classique ou la biologie moléculaire pantélomérique et maintenant, comme un outil de screening lorsque le caryotype et les ananlyses ciblées sont normales46 . En effet, la CGH array convient particulièrement au diagnostic en cytogénétique constitutionnelle puisque les anomalies retrouvées sont souvent uniques. De plus, de nombreuses études ont montré l’intérêt de l’utilisation de la CGH array dans les cas de syndromes où une anomalie chromosomique est évoquée tels que le retard mental de l’enfant associé à des malformations et/ou à une dysmorphie. Différentes études montrent que dans les cas de retard mental, la CGH array peut mettre en évidence une anomalie dans 4 à 17% des cas47 .
  36. 36. 36 En revanche, l’utilisation de la CGH array au cours du diagnostic prénatal reste prudente en raison des difficultés d’interprétation des CNV (Copy Number Variations). Le terme CNV désigne un segment d’ADN ayant une longueur supérieure à 1 kb, avec un nombre de copies qui est variable lorsqu’il est comparé à un génome de référence48,49 . Ce terme ne préjuge pas du caractère pathogène ou non de cette variation. L’interprétation des CNV n’est pas toujours aisée. Il est parfois difficile de démontrer le lien de causalité entre un CNV mis en évidence et le phénotype du patient. Cette incertitude rend difficile en période prénatale, l’appréciation du pronostic et le conseil génétique. B. Objectif de l’étude Par arrêté du Ministre de la santé et des solidarités en date du 3 mai 2007, l’hôpital Necker-Enfants Malades a été désigné en qualité de Centre de référence Maladies Rares pour la hernie diaphragmatique congénitale. Les objectifs du Centre de référence sont d’harmoniser l’accès au diagnostic et à la prise en charge par la mise en place d’une filière de soins, la définition de protocoles thérapeutiques, une veille épidémiologique, et une surveillance à long terme. Enfin, ce centre a initié un travail de recherche sur les bases moléculaires de la malformation. C’est dans ce cadre qu’un protocole de recherche sur les causes chromosomiques des HCD a été instauré. Notre objectif était donc de rechercher la présence de microremaniements chromosomiques déséquilibrés, par CGH array, dans le but d’identifier des nouveaux gènes présents éventuellement dans ces régions et pouvant être impliqués dans la genèse des HCD.
  37. 37. 37 IV.Matériels et méthodes A. Recrutement des sujets Cinquante sujets au total ont été inclus dans cette étude. Ils proviennent d’une cohorte prospective et d’une cohorte rétrospective. 1. Cohorte prospective Les sujets inclus dans cette cohorte ont été adressés par la maternité de l’hôpital Necker-Enfants Malades entre le mois de janvier 2008 et le mois d’avril 2009. Les familles ont reçu et signé un consentement pour participer à une étude génétique sur les hernies diaphragmatiques. Cette cohorte comporte 25 fœtus et nouveaux-nés décédés ainsi que 9 enfants vivants. Ce groupe est constitué majoritairement de sujets présentant une hernie isolée. Seuls quatre sujets présentaient des malformations associées [Annexe 1]. 2. Cohorte rétrospective Cette cohorte est constituée de 14 fœtus pour lesquels il y a eu un examen embryo- fœtopathologique à l’hôpital Necker-Enfants Malades, entre 2001 et 2007. Ces fœtus ont été inclus dans cette étude car ils présentaient pour la majorité une autre malformation associée à la hernie de coupole. Les familles avaient signées un consentement pour la réalisation d’examens permettant de mettre en évidence les causes du décès. Tous les fœtus inclus dans cette cohorte ont eu un caryotype en période anténatale dont le résultat était consigné dans le dossier. Cette cohorte comporte également 2 enfants vivants. Le sujet 49 a été inclus car il a deux frères ayant également une hernie de coupole isolée. Le sujet 50 a été inclus dans cette cohorte car il présente une dysmorphie [Annexe 2].
  38. 38. 38 B. Techniques d’étude 1. Caryotypes Tous les sujets de la «cohorte prospective» inclus dans l’étude ont bénéficié d’un caryotype en bandes R (RHG-banding : R-bands by heating using Giemsa) et en bandes G (GTG-banding : G-bands by trypsin using Giemsa) selon les recommandations de l’ACLF (Association des Cytogénéticiens de Langue Française)50 . Cette étude du caryotype a été effectuée sur un prélèvement de liquide amniotique. La formule chromosomique était rendue en suivant la nomenclature de l’ISCN (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature). Les sujets pour lesquels il existait une anomalie visible au caryotype n’étaient pas inclus dans l’étude. Pour les sujets de la « cohorte rétrospective », le résultat du caryotype était indiqué dans le dossier. 2. Hybridation In Situ Fluorescente (FISH) a. Principe général Les techniques d'Hybridation In Situ sont fondées sur la propriété de réassociation spécifique des acides nucléiques. Une sonde dénaturée (ADN simple brin marqué) en solution peut s'hybrider spécifiquement avec sa séquence cible (préparation chromosomique dénaturée) grâce à la complémentarité des bases nucléotidiques. La sonde s'apparie par des liaisons hydrogènes établies selon les critères de Watson et Crick. Les hybridations aspécifiques et les molécules de sonde non hybridées sont éliminées par lavage, puis les hybrides spécifiques sont révélés. Enfin, l'observation s'effectue grâce à un microscope à fluorescence.
  39. 39. 39 b. Matériel d’études Pour confirmer les résultats obtenus par la CGH array, une étude en FISH a été réalisée. Dans le cas de la «cohorte prospective», les étalements cellulaires ont été obtenus à partir de sang frais prélevé sur héparinate de lithium puis mis en culture dans un milieu contenant de la phytohémagglutinine (PH) permettant la stimulation des lymphocytes T. La culture cellulaire a été synchronisée au bout de 48 heures pour obtenir une meilleure qualité d’étalement cellulaire [Annexe 3]. Pour cette cohorte, nous avons pu réaliser une FISH métaphasique et interphasique. Dans le cas de la « cohorte rétrospective », les étalements ont été obtenus par apposition de tissus fœtaux congelés. Cette technique consiste à abraser le bloc congelé pour obtenir une surface plane. Ensuite, une empreinte est réalisée par apposition, sans pression ni translation de la lame à la surface du bloc. Selon les tissus, la température du bloc est ajustée entre -15°C et -20°C et les lames préalablement chauffées ou non pendant 5 minutes sur une platine chauffante à 45°C. Une température plus élevée et un chauffage de la lame favorisent le transfert des cellules vers la lame et la densité cellulaire de l’empreinte. Après séchage, les empreintes sont conservées à température ambiante. Dans ce cas, seule une FISH interphasique a pu être réalisée. c. Préparation des sondes Les sondes utilisées pour l’étude en FISH ont été préparées à partir de la banque de sondes BAC (bacterial artificial chromosome) du service de Cytogénétique de l’hôpital Necker-Enfants Malades. Tout d’abord, l’amplification a été réalisée par la technique de « Rolling Circle Amplification », technique permettant l’amplification exponentielle de l’ADN circulaire ou linéaire jusqu’à 10 kb et l’obtention de 5 à 10 µg d’ADN à partir de quelques ng au départ [Annexe 4]. Les sondes ont ensuite été marquées par la technique de « Nick Translation » [Annexe 5]. Une Dnase coupe l’ADN puis, une polymérase reconstitue le brin complémentaire en présence de dNTP, et de dUTP couplé à un fluorochrome, l'Isothiocyanate de Fluorescéine (FITC) ou la rhodamine.
  40. 40. 40 Les sondes marquées ont ensuite été co-précipitées avec une autre sonde marquée avec un fluorochrome différent puis remis en suspension dans un tampon d’hybridation contenant de la formamide Avant d’utiliser les sondes préparées pour la vérification des résultats de CGH array, la localisation des sondes a été vérifiée en hybridant, sur des préparations chromosomiques d’un témoin, un mélange de la sonde à tester avec une sonde témoin située sur le même chromosome. d. Hybridation et lecture La préparation chromosomique et la sonde ont été co-dénaturées sur une platine chauffante à 72°C pendant 3 minutes. Pour les appositions de tissus, la co-dénaturation était de 4 minutes à 80°C. L’hybridation a ensuite été réalisée à 37 °C pendant au moins 16 à 24 heures dans une chambre noire et humide. Après une étape de lavage pour éliminer les hybridations aspécifiques, les lames hybridées ont ensuite été lues au microscope à fluorescence à l’aide de filtres permettant la lecture de chaque fluorochrome. e. Applications -FISH ciblée « hernie diaphragmatique » L’étude préliminaire de la « cohorte prospective » a été complétée par la réalisation d’une FISH ciblée en faisant appel à trois sondes : - Une sonde constituée du clone RP11-46C2 marqué avec un fluorochrome à fluorescence rouge dérivé de la rhodamine (Tétramethyl Rhodamine Isothiocyanate). Ce clone est localisé en 15q26.2 et comprend le gène COUP-TFII. - Une sonde composée des clones RP11-388A16 et RP11-359B12 marqués avec un fluorochrome à fluorescence verte, le FITC (Isothiocyanate de Fluorescéine). Ceux-ci sont situés en 12p13. Un compte sur 100 noyaux est effectué car la tétrasomie 12p est retrouvée en mosaïque dans le liquide amniotique. - Une sonde constituée du clone RP11-297K5 marqué avec un fluorochrome à fluorescence bleue, la coumarine. Ce clone est localisé en 8p23.1 et couvre le gène GATA4.
  41. 41. 41 Nous utilisons en pratique courante dans le service cette FISH ciblées depuis 2005 puisque ces régions sont connues comme les plus fréquemment associées aux HCD36 . Dans le cas de la « cohorte rétrospective », cette étude n’a pu être réalisée. -Vérification des CNV Une étape de vérification est nécessaire pour confirmer les résultats obtenus par CGH array. Dans notre étude, les vérifications ont été effectuées à l’aide de la FISH, aussi bien dans les cas de délétion que dans les cas de duplication. 3. Comparative Genomic Hybridization Array (CGH array) a. Principe général La CGH est une technique d'analyse globale du génome qui repose sur l'hybridation génomique comparative (CGH). Son principe a été décrit par Kallioniemi et al. en 1992, il consiste à cohybrider une même quantité d'ADN d'un patient et d'un témoin, marquée chacune par un fluorochrome différent, sur les métaphases d'un autre sujet témoin51 . La CGH array repose sur le principe de la CGH, mais cette technique est réalisée sur une lame de verre sur laquelle sont déposées des séquences d'ADN connues52 . Après avoir cohybridé dans une chambre noire et humide à 37°C l'ADN du patient et l'ADN du témoin pendant au moins 16 heures, la lecture des signaux est réalisée grâce à un scanner laser automatisé. Une analyse informatique des données est ensuite réalisée à l'aide d'un logiciel qui enregistre l'intensité de fluorescence de l'ADN marqué avec chacun des fluorochromes. On obtient alors un profil de CGH où chaque point représente le ratio des signaux émis par le fluorochrome 1 et le fluorochrome 2.
  42. 42. 42 Figure 9. Synoptique comparatif des principales étapes entre la CGH sur chromosomes et la CGH array, d’après Sanlaville et al52 . Afin d'assurer un contrôle interne, l’ADN de chaque patient est à nouveau hybridé avec l’ADN d’un témoin en inversant les fluorochromes. Cette technique permet une étude en « dye-swap ». En effet, dans la première technique, le patient est marqué avec le fluorochrome 1 et dans la deuxième technique, avec le fluorochrome 2. Dans les deux cas, c’est le ratio fluo1/fluo2 qui est étudié. Pour une même séquence d’ADN, si dans la première technique ce ratio est supérieur à la limite déterminée (par exemple +4 DS) alors dans la deuxième technique, il devra être inférieur à -4 DS, pour évoquer une anomalie. La représentation graphique donnera donc une image en miroir.
  43. 43. 43 Figure 10. Représentation graphique de la technique en « dye swap ». Les points rouges représentent la technique où l’ADN du patient est marqué avec le fluorochrome 1 et les points bleus, la technique où il est marqué avec le fluorochrome 2. b. Préparation des échantillons -Matériel d’étude Dans le cas de la «cohorte prospective», l’ADN nécessaire à la réalisation de la CGH array a été extrait à partir de sang fœtal frais total prélevé sur EDTA. Les globules rouges ont d’abord été lysés par un tampon de lyse qui provoque un choc hypotonique. Après agitation et centrifugation, un culot de globules blancs a été récupéré. A partir de celui-ci et après digestion par la protéinase K, la technique d’extraction phénol-chloroforme a été utilisée. Après précipitation en présence d’acétate de sodium et d’isopropanol, le prélèvement a été centrifugé puis séché. Le culot d’ADN a ensuite été élué dans du tampon Tris-EDTA (T.E), pour obtenir une concentration finale d’environ 200 à 300 µg/mL [Annexe 6]. Dans le cas de la « cohorte rétrospective », l’ADN a été extrait à partir de fragments de tissus congelés (poumon, thymus et muscle dans la majorité des cas ou bien à partir de culots globulaires conservés en banque). La technique d’extraction phénol-chloroforme a également été utilisée après un temps de digestion par la protéinase K. La concentration finale en ADN obtenue était également d’environ 200 à 300 µg/mL [Annexe 7].
  44. 44. 44 -Marquage des ADN L’ADN a été marqué par une technique de « Random priming ». Cette technique consiste à chauffer l’ADN du patient à 99°C pendant 10 minutes pour dénaturer les 2 brins d’ADN puis à le refroidir brutalement. Ensuite, un mélange d’oligonucléotides (hexanucléotide) de synthèse correspondant à toutes les combinaisons possibles (46 = 4096) est ajouté. Quelques uns de ces oligonucléotides vont s’hybrider au hasard avec l’ADN monobrin. Les oligonucléotides fixés vont servir d’amorces au fragment de Klenow de l’ADN polymérase I qui, par son activité polymérase, va reconstituer l’intégrité des 2 fragments en présence de désoxynucléotides triphosphates (dNTP) couplés à un marqueur fluorescent la cyanine. L’ADN du patient est marqué d’une part par la cyanine-3, sous forme de Cy3-dXTP et d’autre part par la cyanine-5, sous forme de Cy5-dXTP, pour réaliser la technique de « dye swap ». Pour les patients étudiés à l’aide des puces BlueGnome, une quantité de 450 ng d’ADN a été marquée avec chacun des fluorochromes. L’ADN marqué a ensuite été purifié sur des colonnes de Séphadex G50 Superfine. Cette étape permet d’éliminer les bases fluorescentes restées libres dans les produits de marquage avant hybridation sur la lame. Pour les patients étudiés à l’aide des puces PerkinElmer, une quantité de 1000 ng d’ADN a été marquée avec chacun des fluorochromes. La technique de marquage de PerkinElmer ne nécessite pas d’étape de purification. Pour réaliser l’hybridation, nous avons préparé deux mélanges pour chaque patient. Dans le premier mélange, nous avons associé l’ADN du patient marqué par la cyanine-3 à l’ADN de référence marqué par la cyanine-5 en proportion égale et dans le second, nous avons mélangé l’ADN du patient marqué par la cyanine-5 et l’ADN de référence marqué par la cyanine-3. Les mélanges ont été précipités dans du NaCl et de l’alcool. Le surnageant a été évacué et le culot séché. Il a ensuite été remis en suspension dans du tampon d’hybridation contenant de la formamide. Nous avons réalisé une technique en trio où chaque patient était le témoin d’un autre patient. Prenons l’exemple de 3 patients A, B et C. Dans la première technique, le patient A est marqué par la cyanine-3 et hybridé avec le patient B marqué par la cyanine-5 comme
  45. 45. 45 témoin. Dans une deuxième technique, le patient A est marqué par la cyanine-5 et hybridé avec le patient C marqué par la cyanine-3 comme témoin. Pour ne pas biaiser les résultats, nous avons constitué des trios de patients n’ayant pas la même présentation clinique. Ceci permet d’éviter de manquer une anomalie qui serait présente chez deux patients de l’étude. En effet, si deux patients ont la même présentation clinique, on peut supposer qu’ils ont la même anomalie cytogénétique. Dans ce cas, ils ont le même nombre de copies de la région anormale. En les hybridant simultanément, nous ne pouvons pas mettre en évidence dans cette région une variation du nombre de copies. c. Hybridation -Puces BlueGnome Vingt-trois patients de la «cohorte prospective» ont été testés sur une puce BlueGnome CytoChipTM v2, contenant 4000 clones BAC, couvrant l’ensemble du génome avec une résolution moyenne d’environ 1 Mb. La couverture du génome est plus dense dans les régions subtélomériques avec une résolution médiane de 250 kb. De plus, cette puce couvre 90 régions correspondant à des syndromes microdélétionnels connus avec une résolution médiane de 100 kb. Chaque lame contient deux plages d'hybridation. Avant l’hybridation, les mélanges ont été chauffés à 99°C pour être dénaturé pendant 10 minutes puis placés à 37°C pendant 1 heure. L’hybridation a été réalisée à l’aide d’une station d’hybridation TECAN HSTM 400 pro permettant l’automatisation de l’hybridation et des lavages. Au bout d’une heure, les mélanges ont été injectés dans chaque chambre d'hybridation puis l’hybridation a eu lieu pendant 22 heures. Le lavage en fin d’hybridation permet d’éliminer les hybridations non spécifiques et donc de diminuer le bruit de fond lors de la lecture de la lame. -Puces PerkinElmer Les 27 autres patients ont été testés sur une puce PerkinElmer Constitutional Chip® 3.0, contenant 5200 clones BAC, couvrant également l’ensemble du génome mais avec une résolution moyenne d’environ 650 kb. De la même manière, la couverture est plus dense dans les régions subtélomériques avec plus de 900 clones dans ces régions. La puce couvre également les régions impliquées dans des syndromes microdélétionnels connus.
  46. 46. 46 Les mélanges ont été chauffés à 99°C pendant 10 minutes puis placés à 37°C pour une étape de préhybridation pendant une heure. L’hybridation a ensuite été effectuée dans les chambres d’hybridation recommandées par le fabricant et plongées dans un bain-marie à 37°C. L’hybridation a eu lieu pendant 20 à 24 heures à l’abri de la lumière. Les étapes de lavage ont été faites manuellement dans des bains successifs de plus en plus stringents contenant du SDS (Sodium Dodecyl Sulate) et du SSC (Citrate Sodique de Sel). La stringence augmente au cours du lavage pour éliminer les hybridations non spécifiques. d. Lecture des lames La lecture des lames a été faite à l’aide d’un scanner GenePix® 4000B. L’acquisition est faite à 10 µm, après un « préscan » de repérage de la zone à scanner à 40 µm. Le scanner est équipé de deux lasers qui excitent spécifiquement les fluorochromes cyanine-3 à 352 nm et cyanine-5 à 635 nm, ainsi que d’un tube photomultiplicateur couplé à un scanner pour analyser les photons émis par les cyanines. Les images acquises ont ensuite été enregistrées pour l’analyse. e. Analyses -Puces BlueGnome L’analyse a été faite à l’aide du logiciel « BlueFuse for microarrays » de la société BlueGnome® , analysant les deux techniques pour chaque patient en même temps. Ceci permet de faire l’analyse en « dye-swap ». Pour l’interprétation, la déviation standard des autosomes a été déterminée pour chaque patient et si le log2 du ratio Cy3/Cy5 était supérieur à +4 DS ou inférieur à –4 DS le résultat était considéré comme significatif. Un clone était vérifié en FISH si d’une part, il existait une image en miroir, c’est-à-dire, au-delà du seuil de significativité dans les deux techniques, et d’autre part s’il ne faisait pas partie des variants connus, aussi bien dans la base BlueGnome que dans la base « Database of Genomic Variants » de Toronto54 ou la base « Ensembl »55 . -Puces PerkinElmer Pour les puces PerkinElmer, l’analyse a été faite à l’aide du logiciel SpectralWare Web v2.3. Ce logiciel permet également de faire une analyse des patients en « dye-swap ».
  47. 47. 47 L’interprétation des résultats a été faite en fonction du ratio log Cy5/log Cy3. Sur les représentations graphiques, la courbe rouge représente la technique où l’ADN du patient est marqué par la cyanine-3 et la courbe bleue, celle où l’ADN du patient est marqué par la cyanine-5. Les bornes de significativité ont été déterminées individuellement pour chaque patient par le logiciel, à l’aide de la méthode « Iterative 2.5 sigmas », recommandée par le fabricant. Les clones pour lesquels le ratio log Cy5/log Cy3 dépassait ce seuil et donnait une image en miroir étaient considérés comme significatifs et donc vérifiés en FISH s’ils n’étaient pas répertoriés dans les bases de données.
  48. 48. 48 V. Résultats A. Résultats de l’étude en CGH array Sur l’ensemble des individus étudiés, nous avons mis en évidence 171 CNV ce qui correspond à une moyenne de 3 à 4 CNV par patient avec des valeurs allant de 0 à 12 CNV par patient. Ce nombre correspond aux données répertoriées dans la littérature puisque le nombre moyen de CNV par patient dans les différentes études est de 2 à 3 CNV par patient56 . Sur l’ensemble de ces CNV, 140 sont répertoriés dans la base de donnée des variants « Database of Genomic Variants » de Toronto, ce sont des CNP (Copy Number Polymorphisms), ils n’ont donc pas donné lieu à une vérification ultérieure. Ceci représente 2,8 CNP par patient, ce qui est le chiffre retrouvé dans la littérature57 . Par ailleurs nous avons mis en évidence 31 CNV qui n’étaient pas répertoriés dans les bases de données. La taille de ces CNV est très variable, allant de la taille d’un clone soit quelques kilobases à près de 18,4 Mb. Ces CNV ont été vérifiés en FISH. Sur les 31 vérifications effectuées, seul 4 CNV ont été confirmés en FISH. Ceci s’explique par les limites de la technique. B. Patients présentant une anomalie 1. Sujet 4 a. Clinique Il s’agit d’un nouveau-né de sexe masculin dont les parents ne sont pas apparentés. Au cours de la grossesse, le diagnostic de hernie de coupole a été posé et une amniocentèse a été réalisée au terme de 23 SA (semaines d’aménorrhée), pour réalisation d’un caryotype et d’un examen en FISH ciblée. A l’échographie il n’existait pas de malformation associée. La suite de la grossesse a été sans particularité et l’enfant est né au terme de 38 SA + 3 jours. L’enfant est décédé à 12 jours de vie des conséquences de la hernie diaphragmatique. La famille n’a pas souhaité l’autopsie. Il n’a donc pas été possible de préciser la position de l’orifice chez cet enfant.
  49. 49. 49 b. Résultats cytogénétiques -Caryotypes et FISH ciblée Le caryotype en bandes G et en bandes R avec un niveau de résolution de 500 bandes n’a pas montré d’anomalie. La FISH ciblée n’a pas permis de détecter d’anomalie (Figure 11). Figure 11. FISH ciblée métaphasique, chez le Sujet 4, ne montrant pas d’anomalie. RP11-46C2 (15q26.2) RP11-388A16+RP11-359B12 (12ptel) RP11-297K5 (8p23.1)
  50. 50. 50 -CGH array La CGH array a été réalisée sur une puce SpectralChip de la société BlueGnome. La qualité de la technique était bonne puisque le pourcentage de clones analysés était de 98,5% avec une déviation standard des autosomes de 0,087. Le résultat a montré une image en miroir pour 2 clones, le clone RP11-159A19 situé en 1p36.1 (Figure 12) et le clone RP11-176P17 situé en 9p23 (Figure 13). Figure 12. Profil du chromosome 1 en CGH array chez le sujet 4. Présence d’une image en miroir en 1p36.11 pour le clone RP11-159A19.
  51. 51. 51 Figure 13. Profil du chromosome 9 en CGH array chez le sujet 4. Présence d’une image en miroir en 9p22.3 pour le clone RP11-176P17. Ces deux clones n’étant pas répertoriés comme variants dans les bases de données, nous avons procédé à une vérification en FISH.
  52. 52. 52 -Confirmation par FISH Pour le clone situé en 1p36.1, la sonde RP11-159A19, marquée avec un fluorochrome dérivé de la rhodamine a généré deux signaux rouges en place et symétriques sur les métaphases observées et deux signaux sur tous les noyaux observés. En revanche, la sonde RP11-176P17, située en 9p23, marquée avec un fluorochrome vert, le FITC, a généré deux signaux verts en place mais présentant une asymétrie de signal importante (Figure 14). Figure 14. FISH métaphasique chez le sujet 4 montrant une asymétrie de signal franche avec la sonde RP11-176P17 située en 9p23 (en vert). [La flèche blanche indique le clone RP11-176P17 partiellement délété sur un des chromosomes 9]. L’étude en FISH confirme donc une délétion partielle du clone RP11-176P17 situé en 9p23. Une étude par FISH a été également réalisée chez les parents. RP11-176P17 (9p23) RP11-937L7 (9q34.3)
  53. 53. 53 -Etude chez les parents L’étude du caryotype des parents n’a pas montré d’anomalie. L’étude en FISH avec la sonde RP11-176P17 chez la mère n’a pas montré de remaniement (Figure 15). Les deux signaux sont en place et symétriques. Figure 15. FISH réalisée chez la mère du sujet 4 montrant deux signaux verts (sonde RP11-176P17) en place et symétriques. RP11-176P17 (9p23) RP11-937L7 (9q34.3)
  54. 54. 54 Chez le père, on a noté la présence de deux signaux présentant une asymétrie de signal importante, identique à celle retrouvée chez l’enfant (Figure 16). Figure 16. FISH réalisée chez le père du sujet 4 montrant une asymétrie de signal pour la sonde RP11- 176P17 située en 9p23 (vert). [La flèche blanche indique le clone RP11-176P17 partiellement délété sur un des chromosomes 9]. En conclusion, l’étude réalisée chez le sujet 4 montre une délétion partielle du clone RP11-176P17 localisée en 9p23, héritée du père qui ne présente pas de malformation diaphragmatique. RP11-176P17 (9p23) RP11-937L7 (9q34.3)
  55. 55. 55 2. Sujet 38 a. Clinique Il s’agit d’un fœtus de sexe masculin dont les parents sont jeunes et non apparentés. Le diagnostic de hernie de coupole a été fait pendant la grossesse. Une amniocentèse a été réalisée à 22 SA pour étude chromosomique. Le caryotype n’a pas montré d’anomalie. L’échographie réalisée à 29 SA a montré la présence d’un RCIU sévère puisque toutes les mensurations étaient inférieures au 3ème percentile. Il existait également un syndrome polymalformatif associant une hernie diaphragmatique gauche, un cœur totalement dévié à droite avec une hypoplasie cardiaque gauche, des anomalies rénales avec une absence de différenciation cortico-médullaire habituelle et enfin la présence de pieds en « piolet » et une dysmorphie faciale avec un rétrognatisme. Une échocardiographie a également été réalisée confirmant la présence d’une hypoplasie cardiaque gauche avec une hypoplasie mitrale et aortique, de mauvais pronostic. Devant la présence de cette hernie de coupole associée aux autres malformations de mauvais pronostic les parents ont choisi d’interrompre la grossesse au terme de 30 SA. L’examen embryo-fœtopathologique a confirmé le RCIU puisque toutes les mensurations étaient inférieures au 5ème percentile. Il a précisé également la présence d’une agénésie de la coupole diaphragmatique gauche avec hernie du lobe gauche du foie, de l’estomac et d’une partie de l’intestin grêle et du colon dans le médiastin gauche, associée à une éventration de la coupole diaphragmatique droite. Il existait une hypoplasie pulmonaire bilatérale et une hypoplasie du cœur gauche. Il y avait également un polysplénisme, des anomalies rénales avec des plages corticales dysplasiques, une artère ombilicale unique avec une dysmaturité placentaire associée. Il n’existait pas d’anomalie cérébrale. b. Résultats cytogénétiques -CGH array Pour ce fœtus, la CGH array a été réalisée avec de l’ADN extrait à partir d’un fragment de thymus congelé. La CGH array a été réalisée sur une lame fournie par la société PerkinElmer. La qualité de l’hybridation était assez bonne puisque 99% des clones ont été analysés et la déviation standard des autosomes était de 0,104. Sur l’aperçu global des résultats de la CGH array, on observe la présence de deux anomalies (Figure 17).
  56. 56. 56 Figure 17. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 38. La couleur bleue indique une région amplifiée et la couleur rouge une région délétée.
  57. 57. 57 D’une part, il existait une image en miroir dans la région 4qter (Figure 18). Même si tous les rapports de fluorescence n’étaient pas situés au dessus du seuil de significativité, nous avons considéré que toute la région était dupliquée, du fait de la qualité moyenne de l’hybridation (DS des autosomes 0,104). Cette duplication représente environ 18,4 Mb. Elle est située entre le clone RP11-M15 situé en 4q34.1 et le clone RP5-963K6 situé en 4q35.2 Figure 18. Profil du chromosome 4 en CGH array chez le sujet 38. On note la présence d’une image en miroir de la région 4qter à partir du clone RP11-12M15 situé en 4q34.1 et jusqu’au clone RP5-963K6 situé en 4q35.2.
  58. 58. 58 D’autre part, il existait une autre région en miroir. Cette anomalie correspond à une délétion de la région terminale du bras long du chromosome 15 (Figure 19). Cette délétion mesure environ 5,9 Mb. La délétion correspond à la région comprise entre le clone RP11- 79C10 situé en 15q26.2 et le clone RP1-124O5 situé en 15q26.3. Figure 19. Profil du chromosome 15 en CGH array chez le sujet 38. Présence d’une image en miroir dans la région 15qter à partir du clone RP11-79C10 situé en 15q26.2 et jusqu’au clone RP1-124O5 situé en 15q26.3. Pour effectuer les vérifications en FISH, nous avons choisi d’utiliser les clones de ces deux régions qui n’étaient pas répertoriés comme variant dans les bases de données.
  59. 59. 59 -Confirmation par FISH La confirmation de ces deux anomalies a été effectuée sur des appositions de tissus provenant du thymus. Pour confirmer l’anomalie sur le chromosome 4, nous avons choisi le clone RP11-52G4, situé en 4q34.1, puisqu’il n’était pas répertorié comme variant dans les bases de données. Le clone RP11-52G4 a été marqué avec un fluorochrome vert, le FITC et la sonde contrôle RP11-373J21 située en 4q13 a été marquée avec un fluorochrome rouge dérivé de la rhodamine. L’hybridation montre la présence de 3 signaux verts et de 2 signaux rouges dans tous les noyaux analysés (Figure 20). Cette hybridation confirme la présence d’une duplication 4qter. Figure 20. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-52G4 chez le sujet 38 montrant la présence de 3 signaux verts (RP11-52G4) dans tous les noyaux examinés. [Les flèches blanches indiquent la présence de 3 signaux verts]. RP11-52G4 (4q34.1) RP11-373J21 (4q13)
  60. 60. 60 Pour confirmer la délétion 15qter, nous avons choisi d’utiliser le clone RP11-89K11, qui n’était pas répertorié comme variant dans les bases de données. Le clone RP11-89K11 a été marqué avec du FITC, en vert et une sonde contrôle située sur le chromosome 15, en 15q11 a été marquée avec la rhodamine, en rouge. L’hybridation montre la présence d’un seul signal vert correspondant au clone RP11-89K11, dans toutes les cellules examinées (Figure 21). Figure 21. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-89K11 chez le sujet 38 montrant la présence d’un seul signal vert (RP11-89K11) dans tous les noyaux examinés. [La flèche blanche indique la présence du seul signal vert]. Ces deux hybridations confirment la présence d’une duplication de la région 4qter et d’une délétion de la région 15qter couvrant la région du gène COUP-TFII incriminé dans la genèse de hernies diaphragmatiques. L’étude des parents à la recherche d’un remaniement de structure équilibré chez l’un d’eux n’a pu être réalisée. RP11-89K11 (15q26.3) RP11-131I21 (15q11)
  61. 61. 61 3. Sujet 49 a. Clinique Il s’agit d’un fœtus dont les parents ne sont pas apparentés. Le diagnostic de hernie de coupole a été fait pendant la grossesse lors de l’échographie réalisée au terme de 13 SA + 5 j. L’examen a mis en évidence un cœur dévié à droite avec un estomac qui paraissait intra- thoracique. La clarté nucale a été évaluée entre 5 et 7 mm avec la présence de cloisons. Il a également été retrouvé un soulèvement cutané au niveau du thorax et de l’abdomen. La présence de ces différentes anomalies a motivé la réalisation d’une amniocentèse. Le caryotype est masculin, sans anomalie décelée avec les techniques utilisées. Après conseil génétique, une IMG (Interruption Médicale de la Grossesse) a été effectuée au terme de 15 SA. L’examen embryo-fœtopathologique effectué avec le consentement des parents a montré la présence d’un excès de peau au niveau du cou. Il n’existait pas de dysmorphie faciale. Lors de l’examen interne, il a été mis en évidence la présence d’une hernie diaphragmatique avec une coupole diaphragmatique gauche incomplète postéro-latérale, et ascension dans l’hémithorax gauche du lobe hépatique gauche, de la rate, de l’estomac, de l’intestin grêle. Le volume pulmonaire était à la limite de l’hypoplasie. Les autres anomalies rapportées étaient la présence d’un rein en fer à cheval de faible poids et des surrénales peu volumineuses. L’examen histopathologique du cerveau n’a pas montré d’anomalie. b. Résultats cytogénétiques -CGH array La technique de CGH array a été réalisée en faisant appel à une puce de la société PerkinElmer. L’hybridation était d’assez bonne qualité puisque 99% des clones ont été analysés et la déviation standard des autosomes était de 0,102. L’analyse globale du génome a montré la présence de multiples anomalies et en particulier une amplification sur le bras court du chromosome 17 (Figure 22).
  62. 62. 62 Figure 22. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 49, mettant en évidence une anomalie sur le bras court du chromosome 17.
  63. 63. 63 Lorsqu’on observe le chromosome 17, on voit la présence d’une image en miroir sur la partie terminale du bras court du chromosome 17 entre le clone CTD-2326F1 situé en 17p13.3 et le clone RP11-648P8 situé en 17p13.1 (Figure 23). Cette anomalie est une duplication. Elle mesure environ 10,5 Mb. Figure 23. Profil du chromosome 17 en CGH array du sujet 49. Présence d’une image en miroir dans la région 17pter à partir du clone CTD-2326F1 situé en 17p13.3 et jusqu’au clone RP11-648P8 situé en 17p13.1.
  64. 64. 64 -Confirmation par FISH Nous avons effectué la vérification sur une apposition faite à partir de tissu cardiaque. Pour avoir une meilleure vision de la duplication, nous avons utilisé une association de plusieurs clones contigus de la région terminale du bras court du chromosome 17 (contig 17pter). Celui a été marqué avec le fluorochrome FITC donnant une fluorescence verte et une sonde contrôle située sur le chromosome 8 a été marquée avec le fluorochrome dérivé de la rhodamine donnant une fluorescence rouge. La sonde contrôle permet de vérifier que les cellules sont diploïdes. Le résultat de l’hybridation montre la présence de 3 signaux verts, correspondant au contig 17pter, dans toutes les cellules analysées et la présence de 2 signaux rouges (Figure 24). Figure 24. FISH interphasique réalisée avec le contig 17pter chez le sujet 49 montrant la présence de 3 signaux verts (contig 17pter) et de 2 signaux rouges (contig 8qter). L’analyse en FISH confirme la présence d’une duplication du bras court d’un chromosome 17. Le caractère de novo ou hérité n’a pu être vérifié. Contig 17pter Contig 8qter

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