1. Damir Vodenicarevic
Magistère 2 de Physique Fondamentale
du 22/04/2013 au 22/07/2013
Rapport de stage
Étude du rôle des filaments
intermédiaires dans la réponse
mécanique de cellules musculaires
soumises à des étirements cycliques
Laboratoire d'accueil :
Laboratoire de Physique des Solides (UMR8502)
Université Paris Sud, bât 510, 91405 Orsay
Responsable :
Dr Fatma Briki (LPS, équipe Fibres)

2. Résumé
Les filaments intermédiaires sont l'un des trois types de filaments du cytosquelette ; ce sont
également de loin les moins étudiés et donc les moins bien connus. Afin de mieux comprendre leur
rôle, j'ai procédé à des étirements cycliques de cellules produisant des FI sains, ainsi que de cellules
dont le réseau de FI a été préalablement perturbé. En comparant la réponse mécanique de ces cellules,
j'ai pu constater que les perturbations du réseau de FI entraînaient un perte en efficacité de la réponse
mécanique cellulaire se traduisant par un ralentissement et une atténuation du changement de forme des
cellules en réponse aux contraintes mécaniques. Ceci constitue un résultat suggérant que les FI ont un
rôle important dans la mécanique et la dynamique des cellules, et permet de mieux comprendre les
effets des myopathies liées à des dysfonctionnements du réseau de FI.
Abstract
Intermediate filaments (IFs) belong to one of the three filament types in the cytoskeleton but
they are also the least studied type of filament, and therefore the least known one. In order to
understand better the role of those filaments, I carried out an experiment involving cyclic stretching of
different cells. Some of the stretched cells had an unperturbed, wild type intermediate filament network
while others had their intermediate filament networks perturbed in different ways beforehand. By
comparing the mechanical responses of the cells, I was able to determine that IF perturbations reduced
the efficiency of the mechanical response of the cells, notably by slowing down and reducing their
ability to modify their shapes. The results suggest that IFs have an important rôle in cell mechanics and
dynamics, and provide a better understanding of myopathies caused by IF disorders.
Présentation du cadre
Ce stage s'est déroulé au Laboratoire de Physique des Solides (LPS) de l'Université Paris Sud, une unité
de recherche mixte du CNRS regroupant chercheurs, enseignants-chercheurs aussi bien
expérimentateurs que théoriciens, et disposant du soutien d'une soixantaine d'ingénieurs, techniciens et
administratifs. Le laboratoire suit trois grands axes de recherche : « nouveaux états électroniques de la
matière », « phénomènes physiques aux dimensions réduites », et « matière molle et interface
physique-biologie ». C'est au sein de ce dernier axe que mon équipe d'accueil nommée « Tissus et
fibres biologiques » travaille. Cette équipe, dirigée par ma responsable de stage Fatma Briki, étudie les
propriétés physiques des tissus et fibres biologiques.
I) Introduction et présentation du problème
Le comportement mécanique des cellules animales est principalement lié à leur cytosquelette,
un réseau de filaments assurant leur motilité, leur stabilité mécanique et le transport de protéines en
leur sein. Le moins étudié des trois types de filaments du cytosquelette, les filaments intermédiaires
(FI), semble cependant jouer un rôle important dans la mécanique cellulaire.
L'un des enjeux de cette étude est l'amélioration de notre compréhension des desminopathies,
qui sont des maladies musculaires (myopathies) liées à des dysfonctionnements des réseaux de FI au
sein des cellules musculaires.
Dans le but de mieux comprendre la fonction encore mal connue des FI, il a été décidé que
j'observerai la réponse mécanique de cellules soumises à des étirements cycliques. Afin d'isoler
l'influence des FI sur la mécanique, les réseaux de FI de certaines de ces cellules ont été préalablement
perturbés.

3. II) Notions essentielles de biologie et de mécanique cellulaire
A – La cellule eucaryote
Les cellules eucaryotes sont par définition des cellules contenant un noyau et des organites
(unités protéiques fonctionnelles) délimités par des membranes. Les cellules constituant les animaux,
les végétaux, et certaines bactéries sont eucaryotes. La cellule eucaryote moderne étant le résultat d'un
long processus évolutif, elle intègre un très grand nombre de mécanismes hautement corrélés et est
donc encore très mal comprise. Ceci en fait un système complexe au comportement difficilement
prévisible, mais la biologie a permis de comprendre un grand nombre de ses mécanismes.
Ainsi, la cellule eucaryote animale est constituée d'un cytoplasme délimité par une bicouche
lipidique : la membrane plasmique. C'est celle-ci qui isole la cellule du milieu extérieur, et abrite une
multitude de protéines membranaires aux fonctions diverses assurant par exemple le transport de
nutriments ou l'ancrage mécanique de la cellule à d'autres cellules ou à une matrice extracellulaire.
Le cytoplasme, quant à lui, abrite divers systèmes nécessaires au métabolisme et au
fonctionnement de la cellule. Il renferme également le noyau, délimité par la membrane nucléaire et
siège l'ADN, le support de l'information cellulaire.
Fig 1: Schéma général simplifié d'une cellule eucaryote
(T. Audesirk, G. Audesirk, Biology : Life on Earth, Fifth Edition, Prentice Hall College Div 1998)

4. B – Le cytosquelette
Le cytosquelette, littéralement le «squelette cellulaire», représente un ensemble de protéines à
l’origine des comportements mécaniques de la cellule. Il assure en effet le maintien de l’intégrité et de
l’organisation spatiale de la cellule et de ses organites, tout en la protégeant de divers stress
mécaniques.
Il joue également un rôle fondamental dans la mécano-transduction, c’est-à-dire la conversion
d’un signal mécanique en un signal chimique interprétable par la machinerie cellulaire. Cela permet à
la cellule de détecter une contrainte mécanique extérieure, et d’obtenir des informations sur les
propriétés mécaniques du milieu sur lequel elle est fixée.
Le cytosquelette est composé de trois grandes familles de protéines s’organisant en réseaux.
Fig 2: Schéma du cytosquelette d'une cellule eucaryote (Herrmann 2007)
a) Les microtubules
Les microtubules sont les filaments les plus épais du cytosquelette avec un diamètre interne de
25nm et un creux de 15nm. Ils sont également les plus rigides, avec une longueur de persistance
voisine du millimètre.
Ils sont par ailleurs très dynamiques car il peuvent s'allonger par ajout de tubuline à l'une de
leurs extrémités ou se rétracter en libérant de la tubuline à l'autre extrémité.
Enfin, les microtubules sont organisés en réseaux rayonnant à partir d'un centre commun : le
centrosome situé près du noyau, et s'étendent jusqu'à la membrane plasmique.
Les microtubules remplissent ainsi un rôle de maintien mécanique de la forme de la cellule, tout
en servant de voies de transport pour diverses substances au sein du cytoplasme.

5. Cependant, ils n'ont qu'un rôle de renfort, et la principale origine des propriétés mécaniques et
de la motilité des cellules eucaryotes sont les microfilaments d'actine.
b) Les microfilaments d'actine
Les microfilaments d'actine sont les filaments les plus fins du cytosquelette avec un diamètre
d'environ 8nm. Leur longueur peut atteindre une cinquantaine de micromètres, et leur longueur de
persistance est comprise entre 8 et 17 µm. Leur rigidité est donc inférieure à celle des microtubules de
deux ordres de grandeur.
À l'instar des microtubules, les microfilaments d'actine sont très dynamiques et peuvent
s'allonger en se polymérisant ou se rétracter en se dépolymérisant.
Ces filaments sont notamment liés au niveau de la membrane plasmique où ils se retrouvent en
grandes quantités, mais quadrillent également le cytoplasme. Ils peuvent être organisés sous forme de
fibres de stress ou de gel, et servent aussi de support à la myosine au sein des muscles.
Les microfilaments d'actine jouent un rôle crucial dans la mécanique cellulaire. En effet, leur
capacité à s'allonger et à se rétracter de manière très dynamique permet une reconfiguration rapide des
propriétés mécaniques des cellules en réponse à une contrainte extérieure. Enfin, les microfilaments
sont des acteurs essentiels de la motilité cellulaire.
c) Les filaments intermédiaires
Les filaments intermédiaires (FI) ont, comme leur nom l'indique, un diamètre d'environ 10nm,
compris entre celui des microfilaments et celui des microtubules. Ce sont cependant les filaments les
moins rigides du cytosquelette avec une longueur de persistance de l'ordre du micromètre, soit un ordre
de grandeur en-dessous de celle des microfilaments, et trois ordres de grandeur en-dessous de celle des
microtubules.
Par ailleurs, les FI sont les filaments les moins dynamiques du cytosquelette : ils ne s'allongent
et ne se rétractent que très peu. En effet, leur structure diffère des autres filaments du cytosquelette car
ils sont constitués d'un assemblage de longues protéines. L'une des caractéristiques les plus
remarquables des FI est leur grande stabilité. Ils sont en effet capables de s'assembler spontanément in
vitro sans apport d'énergie (ATP ou GTP).
Le rôle principal des FI est le maintien de l'intégrité de la cellule, et la consolidation du noyau
en cas de forte déformation. Ils jouent également un rôle important dans divers systèmes soumis à de
fortes contraintes, tels que les jonctions entre cellules et le maintien de tissus tels que la peau ou les
muscles.
C – La mécanique cellulaire
Du point de vue mécanique, une cellule eucaryote peut exhiber divers comportements. Ces
comportements dépendent notamment du type de cellule. En effet, les cellules circulantes (comme les
cellules sanguines) n'adhèrent à aucun tissu et circulent librement dans l'organisme. D'autres cellules,
notamment au sein des tissus, peuvent -et pour certaines doivent- adhérer à des protéines qui les
entourent. C'est à ces cellules non-circulantes que je me suis intéressé durant ce stage.
Ainsi, une cellule peut s'attacher à une matrice extra-cellulaire ou à d'autres cellules auquel cas
elle peut former un tissu. Cette adhésion se fait grâce à des fibres traversant la membrane plasmique et
capables de se fixer grâce à des protéines d'adhésion présentes à leur extrémité. Ces fibres, appelées
points focaux d'adhésion, sont liés aux cytosquelette et permettent à la cellule de se fixer
mécaniquement dans son milieu, mais aussi d'en détecter les propriétés mécaniques.
Par ailleurs, ces points focaux peuvent se déployer et se rétracter dynamiquement, permettant

6. ainsi l'adhésion et le décollement dynamique de la cellule, ce qui, avec la polymérisation de l'actine,
participe à la motilité cellulaire.
Enfin, certaines cellules, telles que les cellules musculaires, disposent de systèmes
supplémentaires leur permettant de se contracter avec une force élevée.
Dans cette étude, je me suis intéressé à un mécanisme cellulaire particulier : la réorientation des
cellules soumises à des cycles d'étirement et de contraction périodiques. En effet, plusieurs études
d’étirements cycliques de cellules musculaires ont été menées1, 2
, et montrent une réorientation des
cellules au cours du temps, dans des directions proches de la perpendiculaire à l’étirement.
Ce processus de réorientation met en jeu de nombreux systèmes de la chaîne de réponse
mécanique de la cellule. Ainsi, la mécano-transduction permet la détection de la contrainte et
commande le décrochage de certains points focaux, la cellule se contracte alors et s’arrondit, et enfin,
un ré-étalement et accrochage dans la nouvelle direction est initié. Ce mécanisme a été observé
auparavant sur divers types de cellules, et son rôle présumé serait de permettre à la cellule de réduire
les contraintes mécaniques cycliques qu’elle subit en se réorientant perpendiculairement à celles-ci.
La réorientation cellulaire en présence de contraintes cycliques est influencée par une multitude
de paramètres mécaniques de la cellule, et le cytosquelette y joue un rôle central.
Durant ce stage, je me suis intéressé à l'influence des filaments intermédiaires sur ce
phénomène reproductible, ce qui m'a permis d'obtenir des informations sur le fonctionnement et le rôle
des FI.
D – Les FI et la mécanique
Malgré leur rôle important dans la mécanique cellulaire, les filaments intermédiaires n'ont été
que peu étudiés, ce qui offre un potentiel de recherche intéressant.
Fig 3: Déformation des différents éléments du cytosquelette étudiés in vitro en fonction de la contrainte appliquée.
(Janmey 1991)
Le graphique 3 représente les courbes de déformation en fonction de la contrainte des différents
types de filaments : les microtubules, un filament intermédiaire (en l’occurrence la vimentine) et les
micro-filaments d'actine. Ces mesures ont été effectuées in vitro.

7. On remarque que les microtubules se déforment fortement à faibles contraintes, et la structure
de leur réseau se rompt au-delà de 50 % de déformation, le transformant ainsi en gel visqueux qui ne
participe plus à l'élasticité cellulaire. Cette caractéristique confirme le simple rôle de soutien des
microtubules, qui ne contribuent pas notablement aux propriétés mécaniques de la cellule.
Les micro-filaments d'actine, quant à eux, exhibent une forte rigidité et ne se déforment que peu
sous la contrainte. Ce sont donc ces filaments qui présentent la contribution la plus importante à
l'élasticité cellulaire. Cependant, ce réseau se rompt à environ 20 % de déformation, perdant alors ses
propriétés élastiques, et se transformant en gel visqueux.
À faibles contraintes, les FI de vimentine exhibent un comportement élastique intermédiaire
entre les microtubules et les micro-filaments, ce qui traduit une contribution modérée à l'élasticité
cellulaire. Cependant, à forte contrainte, les FI suivent un comportement différent des autres filaments.
En effet, au-delà de 40 % de déformation, la raideur du réseau de FI augmente de plus en plus, sans
rupture constatée. Ainsi, les FI dominent la mécanique cellulaire à fortes contraintes et à fortes
déformations.
E – Les myopathies
Une autre source d'informations sur la fonction des FI provient de l'étude des maladies
musculaires (myopathies) liées à des altérations du réseau de FI dans les cellules musculaires. Ces
altérations proviennent souvent de mutations génétiques au niveau des gènes en lien avec les FI et se
traduisent par une grande variété de symptômes tels que la faiblesse voire l'atrophie musculaire, ou
encore une fragilité structurale des tissus musculaires. Afin d'étudier l'influence d'une mutation sur le
comportement des FI, j'ai pu utiliser des souches mutantes produisant des FI caractéristiques d'un type
de myopathie.
F – Effets de la température
Par ailleurs, plusieurs études ont montré que les filaments intermédiaires répondent de manière
particulièrement visible à un stress thermique. Les FI de desmine au sein de myoblastes (cellules
musculaires) ont tendance à former des agrégats après un stress thermique2
. En effet, il a été montré4
que les FI sont des protéines de stress thermique, c'est-à-dire des protéines dont la production augmente
notablement en cas de stress thermique sur la cellule, notamment dans le but de protéger celle-ci.
Durant ce stage, afin d'étudier indirectement cet aspect des FI, j'ai pu étudier l'influence d'un choc
thermique sur la réponse mécanique des cellules.
III – Approche méthodologique
A – Préparaiton des cellules
Pour mener à bien cette étude, il a tout d'abord fallu choisir et préparer les cellules à utiliser.
Cette étape a été faite par l'équipe peu après mon arrivée.
Les cellules choisies sont des myoblastes murins cancéreux immortalisés de lignée standard
C2C12. Les myoblastes sont des cellules souches à l'origine de la formation des muscles squelettiques,
elles ont dans notre cas été prélevées sur une souris. La lignée choisie provenant de cellules tumorales,
elle a l'avantage de se multiplier rapidement, permettant ainsi une culture rapide. De plus, ces cellules
C2C12 ont l'avantage d'être standardisées et déjà utilisées dans plusieurs études. Mais leur
caractéristique la plus importante est leur très faible production de filaments intermédiaires endogènes

8. (principalement constitués de desmine dans le cas des myoblastes). Cette production naturellement
négligeable permet de contrôler précisément la production de FI de desmine au sein de ces cellules
grâce à l'insertion d'un gène en produisant une quantité contrôlable.
C'est précisément cette méthode qui a été employée sur les deux versions de C2C12 qui m'ont
été fournies : les A29 et les C26.
Les cellules A29 sont des C2C12 modifiées dans lesquelles un gène produisant de la desmine
sauvage a été inséré. Cela permet à ces cellules de produire des FI de desmine en permanence, et en
quantités relativement constantes.
Les C26, quant à elles, sont des C2C12 ayant subi un traitement similaire mais c'est une version
mutée du gène de la desmine qui y a été insérée. La mutation en question, notée D399Y, est à l'origine
d'un type de myopathie se traduisant par la formation d'agrégats de desmine au sein des cellules des
muscles, ainsi que des faiblesses et des problèmes structuraux au niveau des leurs tissus. Ce lot de
cellules m'a permis d'étudier les effets de cette mutation, et les informations que cela révèle sur les FI.
Enfin, dans le but de pouvoir identifier cette desmine exogène au miscroscope, une séquence
codant pour le site Myc a été ajouté à la fin des gènes codant pour la desmine exogène des A29 et des
C26. Ce site est une petite séquence de peptides insérée à la fin des protéines de desmine, et qui ne
perturbe pas leur assemblage.
B – La sollicitation mécanique
Afin d'étudier l'influence des FI sur la mécanique cellulaire par l'intermédiaire du phénomène de
réorientation décrit précédemment, j'ai soumis des myoblastes A29 (desmine sauvage) et C26 (desmine
mutée) à des étirements cycliques. Afin de procéder à cette expérience, j’ai pu utiliser une machine
construite par le laboratoire et permettant l'étirement cyclique de plots élastiques de PDMS sur lesquels
ont été placés des myoblastes. Ces myoblastes adhèrent au PDMS par l'intermédiaire d'une couche de
fibronectin préalablement déposée sur celui-ci, et qui se comporte comme une matrice extra-cellulaire.
J'ai ainsi étiré simultanément des plots recouverts de A29 et des plots recouverts de C26 pendant
divers temps. La vitesse d'étirement était de 1.4mm/s et son amplitude fixée à 20% d'étirement. Ces
paramètres ont été optimisés grâce aux données recueillies par l'équipe sur ce type de manipulations.
C – Le stress thermique
D'autre part, afin d'étudier l'influence d'un stress thermique sur les FI, j'ai soumis certains
myoblastes A29 et C26 à un stress thermique avant de les étirer dans les mêmes conditions que les
autres échantillons. Pour cela, j'ai porté ces lots de cellules à 42°C pendant 30min afin de leur faire
subir un choc thermique. Ensuite, je les ai laissés reposer 24h afin que les cellules réagissent à ce choc
et réorganisent leurs FI.
D – Imagerie par fluorescence
Dans le but d'étudier la réorganisation cellulaire pendant l'étirement, il était nécessaire de
pouvoir visualiser et différencier plusieurs éléments de la cellule. Il a été choisi d'observer le noyau, les
microfilaments d'actine et les filaments intermédiaires de desmine.
Afin d'effectuer ces observation, nous avons eu recours à l'imagerie par fluorescence. Cette
technique nécessite l'utilisation de molécules fluorophores appelées «marqueurs». Les électrons au sein
d'un marqueur peuvent être excités par de la lumière d'une longueur d'onde spécifique au marqueur. En
se désexcitant, ces électrons émettent à leur tour des photons dans différentes longueurs d'onde
également propres au marqueur. Ainsi, au sein d'un échantillon comprenant plusieurs marqueurs

9. différents, il est possible d'observer sélectivement un marqueur donné en éclairant l'échantillon avec la
longueur d'onde d'excitation propre au marqueur, et en observant la lumière émise par celui-ci à travers
un filtre ne laissant passer que ses longueurs d'onde de réémission propres.
Pour observer le noyau des cellules, j'ai utilisé un marqueur se fixant sur l'ADN : le DAPI. Afin
d'observer sélectivement la desmine exogène, j'ai utilisé un marqueur fluorescent capable de se fixer
spécifiquement sur le site Myc de celle-ci. Enfin, l'observation de l'actine a été possible grâce à
l'utilisation de palloïdine fluorescente se fixant sur les filaments d'actine.
Le principal désavantage de cette méthode est qu'elle nécessite la fixation et donc la mort des
cellules, qui ne peuvent donc pas être observées durant l'expérience. Il m'a donc fallu retirer différents
plots de l'expérience et en fixer les cellules pour chaque temps à observer. J'ai également préparé des
plots témoins, qui n'ont pas été étirés durant l'expérience.
Afin d'étudier l'évolution des cellules au cours de l'étirement, j'ai observé des échantillons fixés
et marqués à différents moments de l'expérience à l'aide d'un microscope à fluorescence grossissant 64
fois. Le microscope utilisé étant contrôlé par ordinateur, j'ai pu prendre des images sous forme de
mosaïques de 5 par 5 clichés. Pour chaque plot observé, j'ai enregistré entre quinze et trente mosaïques,
selon la quantité de cellules visibles par image, tout en prenant ces mosaïques à des positions aléatoires
sur le plot.
Fig 4: Exemple d'image en fausses couleurs obtenue par fluorescence :
– le bleu marque l'ADN
– le rouge marque l'actine
– le vert marque la desmine (un filament intermédiaire)

10. E – Analyse d'images
Une fois toutes les images enregistrées au format TIFF, j'ai pu procéder à l'analyse de celles-ci.
Dans le cadre de ce stage, je me suis intéressé à l'évolution de la surface, de la forme et de l'angle
d'extension des cellules relativement à l'axe d'étirement.
Pour déterminer ces paramètres, j'ai utilisé le logiciel open source ImageJ.
La première étape de l'analyse consistait à isoler uniquement l'actine dans les clichés car celle-ci
définit le mieux le contour des cellules grâce à sa forte présence au niveau de la membrane plasmique.
Pour cela j'ai écrit une macro ImageJ permettant d'extraire les calques d'actine de toutes les images
contenues dans un dossier, et d'enregistrer ceux-ci sous la forme de nouvelles image TIFF dans un autre
dossier.
La seconde étape visait à seuiller l'image. En effet, afin de pouvoir analyser les cellules
individuellement, ImageJ nécessite l'utilisation d'images binaires où le noir représente la présence d'une
cellule, et le blanc l'absence de cellules. Pour obtenir ces images, j'ai seuillé les images de l'actine en
niveaux de gris à l'aide du logiciel open source Gimp. Devant la forte disparité de luminosité dans les
clichés, je n'ai pas pu automatiser cette étape, que j'ai donc effectuée manuellement.
La troisième étape d'analyse a été la séparation des cellules adjascentes par une fine ligne
blanche afin de permettre à imageJ d'identifier chaque cellule indépendemment en définissant le
contour de chaque zone noire. J'ai également procédé à ce découpage manuellement en utilisant Gimp.
Enfin, la dernière étape consistait à lancer les algorithmes d'analyse d'ImageJ sur chacune des
images d'actine seuillées et découpées dans le but d'obtenir les propriétés de chaque cellule. J'ai pu
automatiser cette étape en écrivant une macro ImageJ qui traitait toutes les images contenues dans un
dossier donné, et enregistrait un fichier texte contenant un tableau avec les différents paramètres
obtenus pour chaque cellule.
En fournissant à imageJ la surface en µm² correspondant à chaque pixel, j'ai pu obtenir la
surface de chaque cellule. De plus, ImageJ permet l'ajustement automatique d'une ellpise sur chaque
cellule, et fournit le rapport de forme de cette ellipse (rapport de la longueur du petit axe sur la
longueur du grand axe) ainsi que l'angle du grand axe. Ces informations m'ont donc permis de
caractériser la forme de chaque cellule, ainsi que son orientation par rapport à la direction d'étirement.

11. Fig 5: De gauche à droite et de haut en bas, les étapes successives de l'analyse :
– L'obtention de l'image TIFF initiale
– L'extraction de l'actine
– Le seuillage et découpage manuels
– L'ajustement d'ellipses par imageJ
F – Traitement des données
Une fois les valeurs caractéristiques de chaque cellule des différents échantillons obtenues, il est
nécessaire de les traiter pour en tirer des informations statistiques sur le comportement mécanique des
cellules.
Les plots étant orientés manuellement sur la lamelle, la première étape consiste à soustraire
l'angle du bord du plot observé au microscope aux angles d'orientation des cellules fournis par imageJ.
L'angle obtenu est nommé θ. Le paramètre d'orientation S=<cos(2θ)> est ensuite calculé, et vaut +1
lorsque les cellules sont orientées parallèlement à la direction d'étirement, 0 si elles sont orientées
aléatoirement, et -1 si elles sont orientées perpendiculairement à l'étirement.
Ensuite, pour chaque échantillon et pour chaque propriété (angle, aire et rapport de forme), il a
été convenu de tracer un histogramme afin de visualiser d'éventuelles évolutions. Par ailleurs, l'angle
des cellules très rondes (rapport de forme proche de 1) n'étant pas significatif, il a fallu ignorer ces
cellules en effectuant une sélection par seuil avant le cacul des orientations moyennes ainsi que des

12. histrogrammes.
Enfin, dans le but de visualiser l'évolution dans le temps des différents paramètres, j'ai dû
représenter les orientations, aires et rapports de forme moyens sous forme de courbes, en fonction du
temps d'étirement.
Cette procédure étant fastidieuse, j'ai décidé de programmer une macro excel permettant de
calculer toutes les valeurs nécessaires puis de tracer tous les histogrammes et toutes les courbes
automatiquement, et ce pour tous les échantillons simultanément.
IV – Résultats et analyse
À la sortie de mon grapheur automatique, les résultats de l'expérience sont représentés sous
forme d'histogrammes et de courbes d'évolution. Un code couleur est également présent : le orange
clair représente les cellules A29 non stressées thermiquement, tandis que le rouge foncé représente les
A29 stressées thermiquement. De même le bleu clair représente les C26 non stressées thermiquement
alors que le bleu foncé représente les C26 stressées thermiquement.
Les graphes témoin proviennent d'échantillons cellulaires qui ont subi les mêmes traitements
que les autres cellules mais qui n'ont pas été étirés. Ces témoins constituent également le point à 0h
d'étirement dans les graphes d'évolution.

13. Fig 6: Histogrammes des angles, rapports d'aspect et aires cellulaires à différents temps d'étirement.
(N est le nombre de cellules prises en compte)

14. Fig 7 : Courbes d'évolution des différents paramètres cellulaires moyennés

15. A – Les effets de la sollicitation cyclique
Tout d'abord, les histogrammes (fig 6) des angles montrent bien une accumulation au fil du
temps des orientations proches de la perpendiculaire à la direction d'étirement. Le plot témoin, qui n'a
pas subi d'étirements, exhibe un histogramme globalement plat. C'est également le cas du plot étiré 1h,
sur lequel on n'observe aucune évolution notable. Au bout de 3h en revanche, l'orientation
perpendiculaire commence à être visible, notamment au niveau du pourcentage de cellules orientées à
plus de 50° par rapport à l'axe d'étirement : 60% pour l'échantillon A29 non stressé thermiquement
(A29 NS), sachant que cette valeur serait de 44% si les cellules étaient orientées aléatoirement. Ce
phénomène s'accentue au cours de l'expérience, et après 8h d'étirement, cette valeur atteint 65% pour
les A29 NS. Cetta valeur exhibe un ralentissement de son évolution traduisant un plateau de saturation
de l'angle après environ 8h d'étirements. Les courbes des orientations moyennes (fig 7) confirment cette
tendance, malgré une forte variabilité : le paramètre d'orientation passe globalement de S(0h)=0 à
S(8h)=-0.3 environ. Ces observations montrent que l'on retrouve ici le phénomène de réorientation dans
la direction perpendiculaire à l'étirement, comme décrit précédemment.
Par ailleurs, l'évolution des rapports de forme est la plus visible sur la courbe d'évolution en
fonction du temps de traction. Au début de l'étirement, les rapports de forme sont d'environ 0.45 pour
tous les échantillons. Au bout de 3h d'expérience, les cellules de tous les échantillons s'arrondissent
rapidement, avec un rapport de forme s'approchant de 0.53, avant d'entamer une décroîssance lente
jusqu'à environ 0.42 au bout de 8h. Cette tendance est confirmée par les histogrammes, plus
quantitativement, si l'on suit le pourcentage de cellules fortement allongées (rapport de forme inférieur
à 0.5) pour A29 NS, on constate l'évolution suivante : 70% après 1h, 45% au bout de 3h, et enfin un
retour à 71% après 8h d'expérience. Ainsi peut-on observer, dans un premier temps (jusqu'à environ
3h), un arrondissement des cellules qui correspond à leur décrochage du plot suivi d'une rétractation.
Dans un second temps, les cellules s'accrochent progressivement et s'étirent dans leurs nouvelles
directions.
Enfin, les résultats recueillis sur l'évolution des aires des cellules ne sont malheureusement pas
très précis à cause des variabilités liées au seuillage, et au découpage manuels notamment. Cependant,
sur la courbe d'évolution des aires, on observe globalement une chute de l'aire cellulaire moyenne entre
1h et 3h d'étirements, suivie d'un retour aux ordres de grandeur initiaux de l'aire après 6h d'étirements
environ. Cette observation est certainement liée aux réorganisations des cellules soumises aux
étirements cycliques. Ces dernières commencent en effet par se décrocher, et se réduisent. Dans un
second temps, les myoblastes s'étalent à nouveau dans la nouvelle direction qu'ils ont adoptée, ce qui
entraîne un retour à la 'normale' de l'aire cellulaire moyenne.
On retrouve donc bien le comportement de réorientation des myoblastes soumis à des
étirements cycliques.
B – Les effets de la mutation
On observe une différence de comportement entre les myoblastes A29 exprimant de la desmine
exogène sauvage et les C26 exprimant de la desmine exogène mutée.
En effet, les histogrammes des angles d'orientation montrent une dynamique de réorientation
différente pour les A29 et les C26. Cette divergence devient notable après 3h d'étirements, où le
pourcentage de cellules orientées à plus de 50° par rapport à l'axe d'étirement vaut 56% pour les C26
NS, contre 60% pour les A29 NS, sachant que ces valeurs seraient de 44% pour une orientation
aléatoire uniforme des cellules. La différence reste notable mais se réduit après 8h d'étirements : 63%
pour les C26 NS, contre 65% pour les A29 NS. À la lumière de ces données, on constate que les C26

16. tendent à se réorienter moins vite et moins efficacement que les A29.
Par ailleurs, l'évolution du rapport d'aspect est également différente entre les A29 et les C26. En
effet, les myoblastes C26 sont globalement plus rondes que les A29. Ainsi, le pourcentage de cellules
notablement allongées (rapport d'aspect inférieur à 0.5) vaut : 66% pour les C26 NS contre 70% pour
les A29 à 1h, 42% contre 45% après 3h, et enfin 66% contre 71% après 8h d'expérience. Les courbes
d'évolution des moyennes des rapports d'aspect montrent également que les C26 NS sont en tout point
plus rondes que les A29 NS.
En résumé, le mécanisme de réorientation est ralenti par la présence de la mutation dans la
desmine, ce qui traduit une possible réduction de l'éfficacité de réorganisation du cytosquelette à cause
du comportement anormal des FI mutés. De plus, les cellules à desmine mutée sont plus rondes que les
cellules à desmine sauvage. Ces résultats sont à mettre en parallèle avec ceux obtenus par Catherine
Even, également chercheuse dans l'équipe fibres du LPS, et qui a effectué des mesures de rigidité sur
cellules uniques au microscope à force atomique.
Fig 8: rigidités des cellules A29, C26 et C2C12 mesurées par AFM (Catherine Even, résultats non publiés)
Ces mesures à l'AFM (fig 8) montrent en effet que les cellules exprimant de la desmine mutée
(C26) sont plus rigides que les cellules à desmine sauvage (A29), ce qui expliquerait la difficulté des
C26 à s'allonger autant que les A29, ainsi que le ralentissement de leur dynamique.
Toutes ces constatations tendent à confirmer l'importance des FI de desmine dans la mécanique
des myoblastes.
C – Les effets du stress thermique
Enfin, il est intéressant de noter que les cellules ayant subi un choc thermique avant l'étirement

17. exhibent également un comportement mécanique altéré. De plus, il est intéressant de noter que, d'après
les résultats d'AFM sur cellule unique, les myoblastes ayant subi un choc thermique (ST) sont plus
rigides que ceux n'en ayant pas subi (NS).
Les histogrammes d'orientation illustrent bien cette différence de comportement. En effet, en
observant le pourcentage de cellules orientées à plus de 50°, on remarque qu'après 3h d'étirement, cette
valeur décroît de 6% pour les A29 ST par rapport aux A29 NS (54% contre 60%), de la même manière,
pour les C26, celle-ci décroît de 2%. De plus, les courbes d'évolution du paramètre d'orientation
moyen ont tendance à montrer que pour la plupart des temps longs étudiés, les myoblastes stressés
thermiquement sont moins nettement orientés que les myoblastes du même type n'ayant pas subi de
choc thermique. Les données mesurées pour les échantillons à 6h d'étirement ne sont cependant pas
cohérentes avec cette hypothèse. Ceci peut être dû au fait que les mesures à 6h et 8h proviennent d'une
expérience différente de celle ayant fourni les échantillons à 1h et 3h et ayant connue plusieurs
problèles d'arrêts intempestifs. Il peut également s'agir d'une fluctuation statistique due à une statistique
insuffisante.
Les histogrammes de rapport d'aspect sont plus éloquents. En s 'intéressant au pourcentage de
cellules allongées (rapport d'aspect inférieur à 0.5), nous pouvons constater une tendance globale à
l'arrondissement des cellules ayant subi un choc thermique. En effet, le choc thermique fait chuter ce
pourcentage de 7% pour les A29 étirées 1h, de 12% pour les C26 étirées 1h, de 6% pour les C26 étirées
3h, de 4% pour les A29 étirées 8h et de 4% pour les C26 étirées 8h. Cette diffférence n'est cependant
pas appréciable pour les A29 étirées 3h. Ces résultats montrent bien que la présence d'un choc
thermique entraîne un arrondissement des cellules, et restreint les capacités de déformation de celles-ci.
À l'instar de la mutation, le choc thermique a donc tendance à rigidifier les myoblastes, et à
réduire leurs capacités de réorientation et de déformation. Les FI étant des protéines de stress
thermique, et l'effet observé étant similaire à celui dû à la mutation de la desmine, il est raisonnable de
supposer que cette expérience a bien affecté le réseau de FI et que la perturbation de celui-ci a entraîné
un chute de l'efficacité de la machinerie mécanique des cellules, appuyant ainsi nos hypothèses sur
l'importance des FI dans la dynamique cellulaire.
V – Conclusions et perspectives
Cette étude a permis de mieux comprendre le rôle des filaments intermédiaires. En effet, j'ai pu
constater que les effets de deux types de perturbations du réseau de FI (choc thermique et mutation à
l'origine d'une myopathie) étaient similaires et se traduisaient notamment par une réduction de
l'efficacité d'un ou plusieurs des mécanismes impliqués dans la réorientation cellulaire. De fait, ces
perturbations entraînaient une baisse d'efficacité dans la réorganisation du cytosquelette, ce qui ralentit
et limite les modifications de forme et de surface de la cellule. Le principal apport des expériences
réalisées dans le cadre de ce stage a été de fournir de nouveaux indices sur le rôle encore mal connu des
FI. Ainsi, les données recueillies suggèrent que les FI jouent un rôle important dans la mécanique et la
dynamique cellulaires.
Cependant, les résultats que j'ai obtenus sont statistiquement limités (une seule expérience,
environ 300 cellules par plot) du fait de la courte durée du stage, et sont à interpréter avec prudence
jusqu'à ce que l'expérience soit répétée au moins trois fois, et à plus grande échelle. Une autre
limitation majeure de la méthode présentée est que l'expérience d'étirement ne pouvait être suivie en
temps réel à cause de la méthode de marquage par fluorescence choisie. Une expérience d'étirement
pouvant être observée par microscopie en temps réel permettrait de visualiser précisément la
dynamique de réorientation des cellules, et même de suivre le comportement de cellules individuelles,
ce qui apporterait beaucoup d'informations encore indisponibles à ce jour.

18. Références :
1 : Biomechanical characterization of a desminopathy in primary human myoblasts
Navid Bonakdar et al., Biochemical and biophysical research communication, 2012
2 : Développement de nouvelles approches pour l’étude des myopathies myofibrillaires : de la
réponse mécanique des cellules à l’architecture des filaments intermédiaires
Thèsde d'Émilie Leccia (LPS), Université Paris XI, 2010
3 : Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells
Marie Versaevel et al., Nature Communications, 2011
4 : Intermediate filaments take the heat as stress proteins
D.M Toivola et al., Trends in Cell Biology, 2010
5 : Dynamics of cell orientation
Rumi De et al., Nature Physics, 2007
6 : Two Characteristic Regimes in Frequency-Dependent Dynamic Reorientation of Fibroblasts on
Cyclically Stretched Substrates
Simon Jungbauer et .al, Biophysical Journal , 2008
Remerciements : Je tiens à remercier l'équipe Fibres du LPS de m'avoir accueilli durant ce stage. Plus
spécialement, je tiens à remercier ma responsable de stage Fatma Briki pour sa sympathie et le temps
qu'elle m'a consacré, ainsi que Virginie Bailleux qui m'a initié et suivi tout au long de mes expériences.
Je remercie également Catherine Even pour sa gentillesse, et ses données AFM, sans oublier tous les
autres chercheurs et stagiaires de l'équipe.