Dr. Romain Desprat
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Infrastructures nationales                               en biologie et santé                                PROJET INGEST...
Gouvernance et organisation                  Comité de Direction• Réseau INGESTEM est coordonné par le Prof. Annelise  Ben...
Objectifs de la plateforme de               reprogrammation cellulaire• Fournir un service de Reprogrammation, Amplificati...
Comité de direction :                     Bernard KLEIN (Porteur du projet)                     E-mail : bernard.klein@ins...
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Charte de fonctionnementLes trois types de collaborations comprennent :•La reprogrammation, lamplification et la qualifica...
Chartre de fonctionnementResponsabilitésIl est entendu entre la Plateforme et ses utilisateurs que celle-cinest soumise qu...
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iPS production application form 1.0 (part II)•Written and dated documentation that the cells are negative forbacteria.    ...
(part III)Freezing media composition:Protocol to thaw the cells:Dated karyotype of the cells. If not possible, this can be...
Méthodologies proposées                                            Transfert                                              ...
Virus SendaiInvitrogen: sialic acid                             MTA /Collaboration avec
SNL cellules nourricières pour la                                        génération et la culture d’iPS•Cellules souches e...
Plateforme de Vectorologie de Montpellier , Biocampus                                                     Montpellier - UM...
Distinct Regulatory Networks Control Transition versus Maintenance of                       Pluripotency, Cell stem cell, ...
Tests de pluripotence                                   possible                                                          ...
Morphologie des coloniesLes cellules au centre de la colonie ont un ratio élevé noyaux /cytoplasme avec desnucleoli proemi...
Chromostem : Analyse du Caryotype                                                                      (bande R et G sur m...
Les conditions de culture classiques des cellules ES humaines in vitropermettant le maintien de leur état indifférencié, i...
Immunocytochimie et facs                                     RT-PCR                               •Les Primers/amorces de ...
Alkaline Phosphatase (AP)              Marquage sur cellules vivantes                (sans perte des cellules)            ...
Futurs projets afin d’offrir aux utilisateurs de la plateforme    des protocoles pre-établis permettant une meilleure     ...
Instabilité génomique dans les iPS Cell Death and Differentiation (2011) 18, 745–753                                      ...
Matérials à venir prochainement :      X-Vivo Biospherix,….
Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr              Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.frProjets da...
Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr              Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.fr•Productio...
Trois contrats et tarifs  la plateforme doit                         s’autofinancer dans 3 ansUn contrat de collaboration...
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121210 INGESTEM

  1. 1. Dr. Romain Desprat
  2. 2. Sommaire• Projet INGESTEM• Gouvernance et organisation : Comité de direction et personnels• Objectifs de la plaforme de reprogrammation cellulaire• Comité de direction et Platforme• Type de collaboration et tarifs• Charte de fonctionnement : - Engagements de l’utilisateurs - Engagements de la platforme - Objectifs de la plateforme - Type de collaboration et tarifs• iPS production application form 1.0• Méthodologies proposées• SNL cellules nourricières pour la culture des iPS et génération d’iPS • Virus Sendai • Tests de pluripotence • Morphologie des colonies • Analyse des Caryotypes • RT-PCR Immunostaining et Teratoma • Instabilité genomique dans les iPS
  3. 3. Infrastructures nationales en biologie et santé PROJET INGESTEM 1 Le projet INGESTEM propose de constituer une biobanque unique de DESCRIPTION cellules souches à vocation thérapeutique et de structurer cette filière autour d’un pôle industriel. APPORTS POUR La disponibilité de cette base de données de cellules souches va LA SCIENCE permettre de réaliser des avancées significatives dans le domaine de la2 modélisation des maladies humaines et dans le domaine de la définition de nouveaux protocoles thérapeutiques. INGESTEM va permettre à la France de passer du stade de la recherche au stade industriel dans le domaine des thérapies cellulaires liées aux APPORTS cellules souches en développant une biobanque unique, en instaurant POUR LE SYSTEME DE des normes de production cliniques, des standardisations au niveau des RECHERCHE méthodes de reprogrammation, de modélisation de pathologies et de futurs protocoles de médecine régénératrice.3 Plateforme de reprogrammation cellulaire SAFE-IPS ("la Plateforme") est une structure interne du département HU de Biothérapie du CHRU de Montpellier
  4. 4. Gouvernance et organisation Comité de Direction• Réseau INGESTEM est coordonné par le Prof. Annelise Bennaceur-Griscelli.• Directeur de l’IRB (Prof. B.Klein), responsable et représentant de la Plateforme au niveau du réseau INGESTEM.• Deux responsables scientifiques désignés par le Directeur de lIRB sur la base de leurs compétences médicales et/ou scientifiques (Prof. J. De Vos et Dr JM. Lemaitre) dans le domaine des cellules souches pour la durée du projet INGESTEM.
  5. 5. Objectifs de la plateforme de reprogrammation cellulaire• Fournir un service de Reprogrammation, Amplification etqualification de cellules adultes en cellules souches induitespluripotentes iPS.• Développer un programme de recherche et développementpropre visant à rendre plus efficaces et plus sûres les techniques dereprogrammation cellulaires.
  6. 6. Comité de direction : Bernard KLEIN (Porteur du projet) E-mail : bernard.klein@inserm.fr Plateforme: Phone : 04 67 33 04 19 Romain DESPRAT, Ingénieur responsable opérationel, romain.desprat@inserm.fr John DE VOS (responsable scientifique) Fabienne BECKER, technicienne, E-mail : john.devos@inserm.fr fabienne.becker@inserm.fr Phone : 04 67 33 04 79 Lydiane PICHARD , ingénieur, lydiane.pichard@inserm.fr Jean-Marc LEMAITRE (responsable scientifique) E-mail : Jean-Marc.Lemaitre@igf.cnrs.fr Phone : 04 67 33 04 73-Le comité de Direction effectue une veille technologique prospective afin de faire évoluerla Plateforme et s’assure du financement de cette évolution.-Les responsables scientifiques assurent l’organisation de la Plateforme et lasupervision du personnel. http://irb.montp.inserm.fr/en/index.php?page=Plateau&IdEquipe=12
  7. 7. Mise en Place du Projet Signature du Contrat ET de la chartre de reprogrammation Mise en place d’un planning de reprogrammation en réunion avec le comité de direction Envois du formulaire “iPS production application form 1.0” disponible sur le site web SAFE iPS, à romain.desprat@inserm.fr Réception des cellules et vérification de la conformité des cellules comme décrit dans le formulaire “iPS production application form 1.0” 6 mois Production et Qualification des iPS1-Phénotype caractéristique en 3-Une capacité de différenciationmicroscopie optique in vivo attestée par la formation de tératomes dans la souris2-Facs et Immunostainning des NOD-scid IL2Rgammanull (NSG)marqueurs de la pluripotenceOCT4, NANOG, SSEA3, TRA-1-60 4-Caryotype de chacun clones Trois lignées indépendantes (trois clones) de cellules iPS
  8. 8. Charte de fonctionnementLes trois types de collaborations comprennent :•La reprogrammation, lamplification et la qualification de cellulesadultes en cellules souches pluripotentes.•La formation dun collaborateur du demandeur pendant une duréede 15 jours ETP.•La conservation de quatre ampoules congelées de chaque lignéepar la platforme.
  9. 9. Chartre de fonctionnementResponsabilitésIl est entendu entre la Plateforme et ses utilisateurs que celle-cinest soumise quà une obligation de moyens dans le cadre deses activités.La Plateforme nest pas responsable de lemploi fait par lesutilisateurs des résultats des prestations. Toute utilisationpartielle ou inappropriée ou toute interprétation dépassant lesrésultats des prestations réalisées par la Plateforme ne sauraitengager sa responsabilité.Si les cellules de départ proviennent patient  Consentementécrit du patient et Comité de Protection des Personnes
  10. 10. iPS production application form 1.0 General information (part I)Date of submission: Project Leader :Phone and e-mail:Institution:Other persons involved in the project :Name, phone an e-mail:……………………………………………………………………….……………………………………………………………………….……………………………………………………………………….………………………………..Cell informationName of person who will handle the iPS cell lines.Possible Conflicts of interest: NO/YESCell type:Method of isolation/Origin :Sample(s) name and description:……………………………………………………………………….……………………………………… Contact: Romain.desprat@inserm.fr
  11. 11. iPS production application form 1.0 (part II)•Written and dated documentation that the cells are negative forbacteria. If not possible, this can be•Written and dated documentation that the cells are negative for carried out bymycoplasm. facility as a service.•Written and dated documentation that the cells are negative for thefollowing viruses : HIV1, HIV2, HB, HCV. Passage number (pleasedescribe proliferation rate or doubling time):If frozen, number of viable cells frozen (>= 5 x 10E5 viable cells)Medium used to grow the cells (indicate the antibiotic andconcentration used in the media): Contact: Romain.desprat@inserm.fr
  12. 12. (part III)Freezing media composition:Protocol to thaw the cells:Dated karyotype of the cells. If not possible, this can be carried out by theChromostem facility as a service (please contact f-pellestor@chu-montpellier.fr).Mettre dans le site web le lien vers Franck.Preferred reprogramming method (check the box):  Sendai virus  Lentivirus  Retrovirus Contact: Romain.desprat@inserm.fr
  13. 13. Méthodologies proposées Transfert colonies iPS Rétrovirus/Lentivirus (integratifs) J -2 J 13 Colonies J 27 J 0 J 2 iPS J -2 J 0 Virus Sendai J 13 J 27 colonies iPS mRNA et Rétrovirus/Lentivirus non integratifs J -2 J 0 J 15 Colonies J 27 iPS Protéines à venir prochainementAdapted from: http://fr-fr.invitrogen.com/site/fr/fr/home/Products-and-Services/Applications/Stem-Cell-Research/Induced-Pluripotent-Stem-Cells/Sendai-Virus-Reprogramming/Easy-Reprogramming.html
  14. 14. Virus SendaiInvitrogen: sialic acid MTA /Collaboration avec
  15. 15. SNL cellules nourricières pour la génération et la culture d’iPS•Cellules souches embryonnaires ont besoin de “feeders”.•Lignée cellulaire immortalisée dérivée de fibroblastes murinsSTO transformée avec du LIF murin et les gènes de résistance à lanéomicine (établis par le Dr. Allan Bradley (1)) .• Utilisable pour la culture des iPS murins et humains.• Doivent être bloque dans le cycle() avant l’ajout des cellulessouches embryonnaires humaines.1. McMahon, A.P. and Bradley, A. (1990) Cell 62:1073–1085.
  16. 16. Plateforme de Vectorologie de Montpellier , Biocampus Montpellier - UMS3426 Courriel : vectorologie@biocampus.cnrs.fr  Test de non replicativite et dosage p24. Production Virale optionelFaster generation of hiPSCs by coupling high-titer lentivirus and column-based positive selection, Emily Dick, Elena Matsa, Lorraine E Young, David Darling &Chris Denning, nature protocols | VOL.6 NO.6 | 2011 | 701
  17. 17. Distinct Regulatory Networks Control Transition versus Maintenance of Pluripotency, Cell stem cell, Volume 11, Issue 6, 7 December 2012, Pages 769–782“A color gradient (yellow-orange-red) depictsthe three phases of reprogramming, with thematuration-to-stabilization transition upontransgene withdrawal marked as a dotted line.Genes that enhance and suppress transitiononly (yellow), maintenance only (brown), orboth processes (orange) are displayed asnodes. Associations (gray edges) wereobtained using GeneMANIA, with edge weight(thickness and darkness) reflecting confidence,as indicated.” •-OKSM Transgenes Suppress the Stabilization Phase •-Successful Transition of Reprogramming Cells to Stabilization Requires late Maturation Phase ->RNA profiling and down-regulation of OKSM is a key aspect
  18. 18. Tests de pluripotence possible Qualité du contrôle Test de pluripotence But pour démontrer la pluripotence Vérifier que les iPS ont une morphologie similaire auMorphologie des colonies Faible hES Marquage de la pluripotence:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra- Immunostaining Moyen 1-80, Nanog et SSEA Détecte le niveau et la qualité dexpression des genes RT-PCR Moyen-Bon :Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA Capacité à se différencier dans les trois feuillets Génération dEB embryonnaires (ecto,endo, mésoderme et disparition Moyen-Bon des marqueurs de la pluripotence) Microarray ou RNA-seq Comparaison avec hES Moyen-Bon Capacité à se différencier dans les trois feuillets Teratoma formation Bon embryonnaires (ecto,endo, mésoderme ) IN VIVO
  19. 19. Morphologie des coloniesLes cellules au centre de la colonie ont un ratio élevé noyaux /cytoplasme avec desnucleoli proeminent , elles sont rondes et trés dense .En comparaison avec les cellules au centre la colonie les cellules en peripherie montreune morphologie plus mesenchymateuse et par consequant un ratio noyaux/cytoplasme faible.
  20. 20. Chromostem : Analyse du Caryotype (bande R et G sur metaphases) f-pellestor@chu-montpellier.fr Pour tout contrôle de la formule chromosomique (anomalie du nombre et de la structure, le pouvoir résolutif de cette technique ne permet cependant de détecter que les réarrangements chromosomiques de taille supérieure ou égale à STEM CELLS Volume 27, Issue 11, 20 AUG 2009 5 à 10 mégabases (Mb):Préparation Anomalie Non Délai de rendu Coût -Avant et après laBiologique Anomalie Détectable requise Détectable des résultats (TTC) reprogrammation cellulaire -Lors de la dérivation et/ou Anomalies chromosomique de nombre et mosaïque >10%, Anomalies Mosaïque faible (<10%),Anomalies amplification, Culot chromosomiques de structure de taille >cellulaire fixé 10 Mb (translocation, chromosomique de structure de taille 3 semaines 350 euros -Avant le stockage des lignées inversion,délétions,duplications anneaux, <10Mb marqueurs chromosomiques
  21. 21. Les conditions de culture classiques des cellules ES humaines in vitropermettant le maintien de leur état indifférencié, induisent de façonnon négligeable des trisomies des chromosomes 12, 17 ou X [1,2].L’hypothèse qui prévaut actuellement pour expliquer ce phénomèneest que l’amplification de certains gènes portés par ces chromosomesconfère un avantage sélectif aux cellules souches indifférenciées.1.Baker DE, Harrison NJ, Maltby E, et al. Adaptation to culture of human embryonic stemcells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol 2007 ; 25 : 207-15.2. Draper JS, Smith K, Gokhale P, et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 incultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2004 ; 22 : 2253-4. Améliorations des conditions de culture et de reprogrammation X-Vivo Biospherix ( culture des cellules en milieux athmospherique controler 100% du temps)
  22. 22. Immunocytochimie et facs RT-PCR •Les Primers/amorces de RT-PCR seront choisis afin de mesurer les niveaux d’expression des genes sur-exprimes utilises lors de la reprogrammation et de leurs niveaux endogenes. Efficient induction of transgene-free humain iPS using a vector based on sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome By Noemi FUSAKI, Hiroshi BAN, Akiyo NISHIYAMA, Koichi SAEKI and Mamoru HASEGAWA, Efficient induction of transgene-free humain iPS using a vector based on sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome
  23. 23. Alkaline Phosphatase (AP) Marquage sur cellules vivantes (sans perte des cellules) Alkaline Phosphatase (AP) Marquage classique après fixation“Gold standard”  Teratoma
  24. 24. Futurs projets afin d’offrir aux utilisateurs de la plateforme des protocoles pre-établis permettant une meilleure caratérisation de leurs iPS-Création d’un test permettant de définir une signatureprotéomique.(Potentielle collaboration avec la Plate-forme Régionale de Protéomique Clinique,Pr. S. Lehmann).-Création d’une “custome chip” d’analyse d’expression(coding et non coding) et CNV/SNP.(Chip affymetrix sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. En collaborationavec la Plateforme Régionale de Puces ADN très haute densité,IRB, V Pantesco).
  25. 25. Instabilité génomique dans les iPS Cell Death and Differentiation (2011) 18, 745–753 Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency, 3 MARCH 2011 , VOL 471 , NATURE , 59Création d’un “custom chips” d’analyse d’expression et CNV/SNP (Affymetrix sur les genesdéfinissant l’état fibroblastique et iPS. En Collaboration avec la Plateforme Régionale de PucesADN très haute densité, V Pantesco)
  26. 26. Matérials à venir prochainement : X-Vivo Biospherix,….
  27. 27. Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.frProjets dans à mettre en place :•Production de beta-FGF sur Montpellier:Permettant une diminution des coûts associes aux milieux -> plus d’utilisateurs•Production de proteines (oct4,KLF, Sox…)  pour faire des iPS :Permettant d’avoir des iPS sans integration genomique des vecteurs d’expressionpermettant des potentielles applications cliniques futures•Création de « custom chips » afin d’analyser l’expression et leschangements de CNV/SNP :Sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. En collaboration avec la PlateformeRégionale de Puces ADN très haute densité, Pr B.Klein
  28. 28. Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.fr•Production de 6 virus sendai permettant l’expression transitoiredes six facteurs :Oct4, Klf, Sox2, Myc, Lin28 Nanog, (La Plateforme de Vectorologie de Montpellier )•Création d’un blog/site web (plus de flexibilité) et/ou enutilisant un system déjà existant (INGESTEM), permettant unpartage plus fluide des protocols et publications, photo descellules, questions associées à la culture des iPS….•Collaboration avec ReproCell afin de créer des ateliers oupériode d’apprentissage sponsorise par ReproCell et Ozyme pourles milieux
  29. 29. Trois contrats et tarifs  la plateforme doit s’autofinancer dans 3 ansUn contrat de collaboration académique: Le coût représente la moitié desdépenses engendrées par la prestation. Coût national INGESTEM. Le partenaireacadémique utilise les cellules comme il le souhaite sur un plan académique, mais siil engage un partenariat privé, la plateforme Safe-iPS sera associée dans lavalorisation.Un contrat de collaboration avec compagnie privée : la plateforme Safe-iPS sera co-propriétaire des lignées obtenues.Un contrat avec prestation complète pour compagnie privée. les lignées iPSobtenues sont la propriété exclusive de lutilisateur. Service Tarif Collaboration académique 20 000 € TTC Collaboration privée 40 000 € TTC Collaboration privée complète 140 000 € TTC Ces collaborations peuvent être mises en place lors de l’écriture des demandes de financement : ERC, ANR, INCA, ARC, Ligue …

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