Ingestem first meting

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  • The ability to differentiate into almost all tissue types is the hallmark of human pluripotent stem cells (hPSCs). However, as we study the biology of hPSCs for future clinical applications – whether they be under the influence of growth factors ( 1 – 4 ), pro-survival cocktails ( 5 , 6 ), genetic modification ( 7 –10), or other manipulations (1) – pluripotency testing remains a fundamental component of every research design. Assays generally used to test such “stemness” include genomic profiling for relative quantification of pluripotency genes, immunocytochemistry to detect pluripotency markers, embryoid body formation to test 3-germ-layer differentiation capability in vitro or in vivo , and teratoma formation to test 3-germ-layer differentiation capability in vivo (Table 1). Notwithstanding the in vitro assays, teratoma formation in vivo is considered the most stringent of pluripotency assays because it provides more reliable and comprehensive confirmation than does testing cells on a simplified, artificial petri dish. This in vivo assay, coupled with noninvasive, longitudinal imaging, have proven to be invaluable not only in the visualization of stem cell survival and migration post-delivery, but also have been crucial in studying the safety and viability of future stem cell applications (11–13).
  • Ingestem first meting

    1. 1. Activité de la platformeOctobre 2012-Décembre 2013 :Journée porte ouverte à l’IRB afin de présenter le projet INGESTEM et les services offerts par laplateforme : Plus de 80 personnes présentesMise en place Administrative de la plateforme :-Ecriture d’une chartre de fonctionnement et de contrats de reprogrammation, (définie le cadrelégal de la prestation apportée)-Mise à disposition de la totalité du budget INGESTEM dédié à l’IRB-Montpellier via le CHU,-Signature d’un d’accord de transfert de technologie entre DNAvec (Invitrogen) pour produire levirus Sendai (OKSM facteurs) sur Montpellier (IRB) grâce aux infrastructures spécifiques de l’IRB(P2/P3).-Mise en place d’une collaboration technique avec Dr.Roux (Genève) spécialisés sur le virus sendaiafin d’exprimer de nouveaux facteurs (Lin28, …) et de conseils pour résoudre les potentielsproblèmes de production et d’expressionMise en place Technique : Ecriture des protocoles de routine et de reprogrammation à partir deFibroblastes : Feeders SNL, production virus (Lentivirus, rétrovirus non intégratifs, virus sendai…)Mise en place Pratique : Constitution de stock de feeders (SNL), plasmides, achats milieux, primers,etc …Mise en place Stratégique : Point de départ Lentivirus/Rétrovirus afin de qualifier le personnel et lesprotocoles et les control qualités pour évoluer ensuite sur une stratégie non intégratives.Mise en Place Organisationnelle : Réunion Comité de direction tous les semaines
    2. 2. Objectifs à court term (1-2 mois) : Objectifs-Qualification de la platforme-Détermination des meilleurs conditions de culture pour reprogrammer-Création de « custom chips » afin d’analyser l’expression et les changements deCNV/SNP :Sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS.-Demande de financement via le CHUObjectifs à moyen term (1 an) : Mise en place des méthodes de reprogrammation nonintégratives avec une maitrise totale des différents aspects de la production permettantune transition potentielle clinique plus probable :-Production du Virus Sendai (DNAvec) sur Montpellier et Production de beta-FGF surMontpellier: Permettant une diminution des coûts associes aux milieux -> plusd’utilisateurs-Production de proteines (oct4,KLF, Sox…)  pour faire des iPS-Optimisation des conditions de culture pour produires des iPS.-Création d’un blog/site web (plus de flexibilité) et/ou en utilisant un system déjàexistant (INGESTEM), permettant un partage plus fluide des protocols et publications,photo des cellules, questions associées à la culture des iPS….-Collaboration avec ReproCell afin de créer des ateliers ou période d’apprentissagesponsorise par ReproCell et Ozyme pour les milieux .Objectifs à long term (3 ans):- indépendance financière de la plateforme et identifications des facteurs
    3. 3. Contrôle de la qualitée des iPS :Test de pluripotence Qualité du contrôle Test de pluripotence But pour démontrer la pluripotence Vérifier que les iPS ont une morphologie similaire auMorphologie des colonies Faible hES Marquage de la pluripotence:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Immunostaining Moyen Tra-1-80, Nanog et SSEA Détecte le niveau et la qualité dexpression des RT-PCR Moyen-Bon genes :Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA Capacité à se différencier dans les trois feuillets Génération dEB embryonnaires (ecto,endo, mésoderme et disparition Moyen-Bon des marqueurs de la pluripotence) Microarray ou RNA-seq Comparaison avec hES Moyen-Bon Capacité à se différencier dans les trois feuillets Teratoma formation Bon embryonnaires (ecto,endo, mésoderme ) IN VIVO
    4. 4. Contrôle des Conditions de culture Xvivo configuration : -Incubateurs ne peuvent pas être contaminés par les manipulateurs ou l’air de la pièce. -Les cellules ne subissent AUCUN changements dans les paramètres de culture contrôlé par le Xvivo (atmosphère composition hypoxie, température,…) qui s’ils ne sont pas maitrisés participent à l’apparition d’abérration chromosomique.

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