BRANCHE Emilie Janvier 2009
Rapport bibliographique
Master 2 : Génétique fonctionnelle et pathologie cellulaire
(25 170 ca...
1
Sommaire
Abbréviations ……………………………………………………………………………..p.2
Introduction………………………………………………………………………………...p.3
Partie I : Sy...
2
Abbreviations
Ac: anticorps
AcN: anticorps neutralisants
CCR5: C-C chemokine receptor 5
CD4: cluster of differentiation ...
3
Introduction
Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un lentivirus de la
famille des rétrovirus. Il...
4
transmembranaire, et une gp120 de surface liée à la précédente de façon non
covalente, entoure l’ensemble (Figure 2).
Fi...
5
La GP est le seul composant viral exposé à la surface des virions et représente la cible
des AcN, 2G12, b12 et 447-53D d...
6
Partie I : Synthèse du complexe glycoprotéique
d’enveloppe
A-Synthèse du précurseur et modifications post-
traductionnel...
7
des O et des N-glycosylations ; mais on retrouve majoritairement des N-
glycosylations, dans la gp160, présentes sur un ...
8
B-Assemblage des sous-unités gp120 et gp41.
L’association entre les sous-unités gp120 et gp41 implique des interactions ...
9
délétion de cette région inhibe la fusion de la membrane du virus avec celle de la
cellule [13]. Dans les études précéde...
10
cytoplasmique dans l’incorporation est donc dépendant du type cellulaire, suggérant
ainsi que d’autres facteurs jouerai...
11
Partie II : Stabilisation de l’interface gp120-gp41 par
création de liaisons covalentes.
A-Nécessité de délétion des do...
12
B- Stratégie évolutive de stabilisation : modèle SOS.
L’instabilité entre les sous-unités gp120 et gp41 joue probableme...
13
de sous-type A (Ile 535 Met, Glu 543 Leu, Ser 553 Asp, Lys 567 Glu et Arg 588 Gly)
réduit l’hétérogénéité des formes ol...
14
C- Antigénicité et immunogénicité du complexe stabilisé.
La protéine gp140SOS est clivée et antigénétiquement similaire...
15
serait suffisant pour empêcher sa reconnaissance [27]. Et dans une deuxième étude,
ces AcN reconnaissent aussi bien cet...
16
Partie III : Cas des protéines de fusion gp120 + gp41 et
gp120+ ∆gp41
A-Stratégies de modification du site de clivage d...
17
B-Stabilité et incorporation dans un virion des protéines
de fusion gp160 ou gp140.
Une simple mutation dans le site de...
18
Mais cette protéine est également délétée du domaine transmembranaire, elle ne peut
donc ni s’ancrer dans une membrane ...
19
protéines pour l’élaboration d’un immunogène d’enveloppe susceptible d’induire
des AcN à large spectre.
20
Conclusions et perspectives
Deux types de modifications ont été développées afin de stabiliser le complexe
glycoprotéiq...
21
immunogénicité. Mais les plus prometteuses sont les mutations sur le manteau de
glycanes. Les recherches doivent donc ê...
22
References.
[1]Gilbert.PB, Peterson.ML, Follmann.D, Hudgens.MG, Francis.DP, Gurwith.M,
Heyward.WL, Jobes.DV, Popovic.V,...
23
the soluble, cleaved, trimeric form of the envelope glycoprotein complex of human
immunodeficiency virus type 1. J Viro...
24
[19] Gabuzda.DH, Lever.A, Terwilliger.E, SodroskiJ.1992. Effects of deletions in the
cytoplasmic domain on biological f...
25
[28] Center.RJ, Lebowitz.J, Leapman.RD, Moss.B. 2004. Promoting trimerisation of
soluble human immunodeficiency virus t...
Prochain SlideShare
Chargement dans…5
×

Branche- bibliographic report 1

125 vues

Publié le

0 commentaire
0 j’aime
Statistiques
Remarques
  • Soyez le premier à commenter

  • Soyez le premier à aimer ceci

Aucun téléchargement
Vues
Nombre de vues
125
Sur SlideShare
0
Issues des intégrations
0
Intégrations
4
Actions
Partages
0
Téléchargements
1
Commentaires
0
J’aime
0
Intégrations 0
Aucune incorporation

Aucune remarque pour cette diapositive

Branche- bibliographic report 1

  1. 1. BRANCHE Emilie Janvier 2009 Rapport bibliographique Master 2 : Génétique fonctionnelle et pathologie cellulaire (25 170 caractères) Formation du complexe glycoprotéique du VIH-1 en présence ou non de l’interface gp120/gp41 Institut de Biologie et Chimie des Protéines Unité Mixte de Recherche n° 5086 - CNRS / Université Lyon 1 7, Passage du Vercors - F-69367 Lyon Cedex 07 Responsable : Mr.VERRIER
  2. 2. 1 Sommaire Abbréviations ……………………………………………………………………………..p.2 Introduction………………………………………………………………………………...p.3 Partie I : Synthèse du complexe glycoprotéique d’enveloppe. A- Synthèse du précurseur et modifications post traductionnelles………….p.6 B- Assemblage des sous-unités gp120 et gp41…………………………………p.8 C- Importance des domaines transmembranaire et cytoplasmique de la gp41...……………………………………………………p.8 Partie II : Stabilisation de l’interface gp120-gp41 par création de liaisons covalentes. A- Nécessité de délétion du domaine transmembranaire et cytoplasmique de la gp41………………………………………………………………………….p.11 B- Stratégie évolutive de stabilisation : modèle SOS…………………………p.12 C- Antigénicité et immunogénicité du complexe stabilisé…………………...p.14 Partie III : Cas des protéines de fusion gp120/gp41 et gp120/∆gp41. A- Stratégies de modification du site de clivage dans un contexte gp160 ou gp140..………………………………………………………………………….p.16 B- Stabilité et incorporation dans un virion des protéines de fusion gp160 ou gp14. ………………………………………………………………………… . p.17 C- Antigénicité et immunogénicité des protéines de fusion, stabilisées……p.18 Conclusions et perspectives……………………………………………………………..p.20 Références…………………………………………………………………………………p.22
  3. 3. 2 Abbreviations Ac: anticorps AcN: anticorps neutralisants CCR5: C-C chemokine receptor 5 CD4: cluster of differentiation 4 CD4i : CD4 induced (épitopes induits par la liaison du CD4) CHR : C-terminal heptad repeat C-terminal : extrémité carboxyterminale CT : domaine cytoplasmique CXCR-4:C-X-C chemokine receptor 4 env : enveloppe (gène) Env : enveloppe (protéine) GP: glycoprotéine gp41: glycoprotéine 41 gp120: glycoprotéine 120 gp140: glycoprotéine 140 (gp120/∆41) gp140unc: glycoprotéine 140 soluble non clivée gp140SOS : glycoprotéine 140 soluble stabilisée par des ponts disulfure gp160: glycoprotéine 160 (précurseur) LTR: long terminal repeat MPER : région externe de la gp41 proche de la membrane N-terminale : extrémité aminoterminale NHR : N-terminal heptad repeat PP : pseudo-particules PR : région polaire de la gp41 RE : réticulum endoplasmique SIDA: syndrome de l’immunodéficience acquise SP : peptide fusion de la gp120 TCLA : souche VIH de laboratoire (T-cell laboratory adapted) TM : domaine transmembranaire VIH : Virus de l’immunodéficience humaine VLP : virus-like particules
  4. 4. 3 Introduction Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un lentivirus de la famille des rétrovirus. Il a été isolé pour la première fois en 1983 et identifié comme l’agent causal du syndrôme de l’immunodéficience acquise (SIDA). Le VIH-1 a un génome à ARN positif simple brin composé de neuf gènes (Figure 1). Les trois principaux, gag pol et env, codent pour des protéines qui définissent en partie la structure et sont communs à tous les rétrovirus. Les six autres sont des gènes régulateurs (tat, rev et nef) et accessoires (vif, vpr et vpu). Figure 1 : A) Organisation génétique et protéique du VIH-1. Les gènes sont en italique. B) Le gène env code pour un précurseur protéique gp160 qui après maturation donne une sous-unité gp120 de surface et une gp41 transmembranaire. Ce génome est protégé par une nucléocapside, elle-même entourée par une capside composée de protéines p24. Puis, il y a la matrice protéique composée de protéines p17. Une enveloppe, composée de restes de la membrane des cellules infectées, dans laquelle sont ancrées les glycoprotéines (GP) d’enveloppe virale dont une gp41,
  5. 5. 4 transmembranaire, et une gp120 de surface liée à la précédente de façon non covalente, entoure l’ensemble (Figure 2). Figure 2 : Structure générale de la particule virale du VIH-1 Le SIDA reste un problème majeur de la santé publique à travers le monde : d’après ONUSIDA, le nombre de personnes vivant avec le VIH à la fin de l’année 2007 était estimé à 33,2 millions. De plus la situation s’aggrave de jours en jours avec l’émergence de nouveaux virus résistants aux médicaments et le nombre toujours élevé de néo-infections (2,7 millions en 2007 d’après ONUSIDA). Il y a donc un besoin urgent de trouver un vaccin anti-VIH efficace. Le principal problème dans les efforts effectués pour trouver ce vaccin est l’incapacité à faire un immunogène qui génère des anticorps neutralisants (AcN) à large spectre. Les AcN inhibent l’entrée du virus dans les cellules cibles, en empêchant par exemple la liaison de la GP d’enveloppe avec le récepteur (CD4) ou avec le co-récepteur (CCR5 ou CXCR4). Et les AcN à large spectre sont efficaces dans différents isolats primaires de VIH-1. Ces AcN ont été trouvés dans le sérum de quelques patients infectés par le VIH-1 et ils sont au nombre de six : 2G12, b12, 447-52D, 2F5, 4E10 et Z13. Cependant l’apparition de ces AcN à large spectre est tardive et rare chez les patients séropositifs. L’objectif d’un vaccin prophylactique pourrait être l’induction de ces AcN à large spectre.
  6. 6. 5 La GP est le seul composant viral exposé à la surface des virions et représente la cible des AcN, 2G12, b12 et 447-53D dirigés contre la gp120 et 2F5, 4E10 et Z13 contre la gp41. Ainsi la GP d’enveloppe du VIH-1 est un immunogène de choix pour l’induction des AcN. Les premiers immunogènes d’enveloppe produits ont dans un premier temps donné lieu à des résultats prometteurs. Ces immunogènes correspondaient à la gp120 monomérique, puisque exprimée seule, cette protéine est incapable de s’oligomériser [1]. Les Ac dirigés contre la gp120 permettaient de neutraliser l’infection des cellules en culture par des souches virales de laboratoire. Cependant, il est apparu très vite que si ce vaccin induisait des Ac capables de neutraliser l’infection des cellules par des souches de VIH-1 adaptées à la culture (TCLA), ces anticorps se révélaient incapables de neutraliser des virus primaires. La difficulté d’induction des réponses humorales neutralisantes dirigées contre des isolats primaires du VIH-1 avec cet immunogène [2] est sûrement due au fait que la structure antigénique de la protéine gp120 ne mime pas le trimère fonctionnel de la protéine d’enveloppe du VIH-1 [3]. En effet, des différences significatives ont été observées entre les propriétés antigéniques et immunogéniques d’une enveloppe native présente à la surface des virions et une protéine gp120 monomérique [4]. Les Ac induits après immunisation de souris avec le monomère gp120 reconnaissent moins efficacement la GP d’enveloppe trimérique fonctionnelle que le monomère gp120 [2], confirmant la différence structurale et conformationnelle entre le trimère d’enveloppe natif et le monomère gp120. Tout ceci nous montre bien la nécessité d’utiliser la forme trimérique du complexe d’enveloppe pour l’induction d’AcN à large spectre.
  7. 7. 6 Partie I : Synthèse du complexe glycoprotéique d’enveloppe A-Synthèse du précurseur et modifications post- traductionnelles. La GP d’enveloppe est codée par le gène env en un précurseur glycoprotéique, la gp160 qui est clivée par des endoprotéases cellulaires de la famille des furines au niveau d’un site Arg-Glu-Lys-Arg↓ pour former les deux sous-unités qui composent la GP d’enveloppe : la gp120, la sous-unité de surface liant la gp41, transmembranaire [5] (Figure 3). Figure 3 : Représentation schématique du précurseur gp160. A) Dans la gp120 : le peptide signal, les cinq régions constantes (C1, C2, C3, C4, C5) ainsi que les cinq boucles variables (V1, V2, V3, V4, V5). Dans la gp41 : le peptide fusion, la région polaire (PR), la N-terminal heptad repeat (NHR), la C- terminal heptad repeat (CHR), la région externe proche de la membrane (MPER), le domaine transmembranaire (TM) et la queue cytoplasmique (CT). B) Le peptide signal est indiqué en noir (SP). La glycoprotéine de surface gp120 est indiquée en bleu (les régions conservées en bleu foncé (C1-C5) et les boucles variables en bleu clair (V1-V5)). La glycoprotéine transmembranaire gp41 est représentée en gris et contient une boucle formée par un pont disulfure. Les sites de glycosylation sont représentés en noir. Les résidus cystéines sont numérotés et indiqués en rouge, ainsi que les ponts disulfure. Après la synthèse de la chaine polypeptidique, le précurseur gp160 est fortement glycosylé (1) durant le passage à travers le réticulum endoplasmique (RE) [5]. Il existe
  8. 8. 7 des O et des N-glycosylations ; mais on retrouve majoritairement des N- glycosylations, dans la gp160, présentes sur un site précis Asn-X-Ser/Thr (où X représente un acide aminé quelconque sauf une proline) [6]. Certaines N- glycosylations facilitent la génération de ponts disulfure (2) afin que le précurseur ait la bonne conformation et d’autres sont impliquées dans le masquage d’épitopes [7]. Dans le RE, le précurseur est aussi trimérisé via des interactions non covalentes entre les parties gp41 (3). Puis des endoprotéases de la famille des furines clivent ce précurseur gp160 en gp120 et gp41 dans le trans golgi (4). Le complexe d’enveloppe fonctionnel est un homotrimère d’hétérodimères contenant trois sous-unités gp120 et trois sous-unités gp41 associées par des liaisons non covalentes. Ces complexes d’enveloppe complètement maturés sont ensuite transportés à la surface cellulaire (5), grâce à la séquence signal se trouvant dans la région N-terminale de la gp120, où ils sont incorporés dans les virions bourgeonnants (6) (Figure 4). Figure 4 : Cinétique de maturation de la GP d’enveloppe du VIH-1
  9. 9. 8 B-Assemblage des sous-unités gp120 et gp41. L’association entre les sous-unités gp120 et gp41 implique des interactions non covalentes essentiellement entre des résidus de l’ectodomaine de la gp41 [8] et des résidus des structures discontinues de la gp120 comprenant notamment les extrémités N et C terminales [7, 9]. Deux études récentes confirment l’interaction entre l’ectodomaine de la gp41 et les régions C1 et C5 de la gp120 [10, 11]. Le complexe d’enveloppe joue un rôle important dans les étapes précoces de l’infection par le VIH-1 ; la gp120 se lie au récepteur des cellules cibles (CD4) puis au co-récepteur (CCR5 ou CXCR4), entraînant des changements de conformation de la GP, menant à l’exposition du peptide fusion de la gp41. Cette étape permet à la membrane du virion de fusionner avec la membrane de la cellule afin d’expulser la capside contenant le matériel génétique et les enzymes nécessaires à la réplication virale (transcriptase inverse, intégrase) [12]. L’importance de l’assemblage de la gp120 et de la gp41 est illustrée par les deux fonctions principales de la GP d’enveloppe. D’une part, la gp120 protège la gp41 des AcN lors des étapes précoces de l’infection. D’autre part, la labilité de cette interaction permet à la gp120 de se libérer très facilement des virions et ainsi de leurrer le système immunitaire. On remarque que si les gp41 des isolats primaires ont une grande capacité à retenir la gp120, un certain pourcentage est malgré tout libéré dans le milieu extracellulaire. Cette labilité pose un réel problème pour la conception d’immunogène stable utilisant un complexe gp120-gp41, c’est pour cela que différentes stratégies ont été mises en place afin de stabiliser cette interface. C- Importance des domaines transmembranaire et cytoplasmique de la gp41. Le domaine transmembranaire (TM) de la gp41 est composé de 22 acides aminés, hautement conservés dans les différents isolats du VIH-1, ancrés dans la bicouche lipidique. Cette région joue un rôle important dans la fusion puisque la
  10. 10. 9 délétion de cette région inhibe la fusion de la membrane du virus avec celle de la cellule [13]. Dans les études précédentes, la délétion du domaine transmembranaire s’accompagnait forcément de celle du domaine cytoplasmique, récemment le domaine transmembranaire a été substitué par celui du virus influenza, permettant ainsi de conserver le domaine cytoplasmique. Ceci a confirmé, que cette partie était directement impliquée dans la formation d’une protéine d’enveloppe compétente pour la fusion [14]. La partie adjacente au domaine transmembranaire, la région externe proche de la membrane (MPER) joue également un rôle dans le processus de fusion et par conséquent dans l’entrée virale. Elle se compose de 23 acides aminés dont la séquence est très conservée au sein des différents isolats du VIH-1. Cette région est importante pour la conception d’un immunogène vaccinal puisqu’elle est la cible de deux AcN, 4E10 et 2F5 (Figure 5). Ces deux AcN reconnaissent des épitopes linéaires, 2F5 en N-terminale et 4E10 en C-terminal de la MPER [15]. La queue cytoplasmique des protéines d’enveloppe des rétrovirus est significativement plus longue que celle des lentivirus, suggérant qu’elle joue un rôle important. Des études de mutagénèse de cette région ont montré qu’elle pouvait moduler le niveau de fusion, l’expression de la GP d’enveloppe à la surface et l’incorporation des protéines matures dans les particules virales [16]. En effet, le fait de tronquer cette région augmente la fusion et l’expression de la GP d’enveloppe à la surface cellulaire [17]. Une étude a clairement démontré que le domaine cytoplasmique via une interaction avec une protéine de la matrice jouait un rôle important dans l’incorporation de la GP dans les virions bourgeonnants dans certains types cellulaires. En effet, les résultats obtenus ont démontré que dans la majorité des lignées cellulaires T et dans les cellules primaires qui servent de cible naturelle à l’infection du VIH-1 in vivo, la queue cytoplasmique de la gp41 est essentielle pour l’incorporation efficace dans les virions, puisque la délétion de ce domaine diminue fortement l’incorporation de GP d’enveloppe [18]. Cette même étude a également constaté que dans quelques types cellulaires (Hela et MT-4), le fait de tronquer la gp41 n’a qu’un léger effet sur l’incorporation. Le rôle du domaine
  11. 11. 10 cytoplasmique dans l’incorporation est donc dépendant du type cellulaire, suggérant ainsi que d’autres facteurs joueraient un rôle dans les processus d’incorporation. Le domaine transmembranaire et la queue cytoplasmique jouent également un rôle sur la stabilité de la GP d’enveloppe, puisque la délétion d’une partie du domaine transmembranaire et du domaine cytoplasmique résulte en une diminution de la stabilité de cette protéine [19]. Figure 5 : Modèle structurale de la GP d’enveloppe du VIH-1 et localisation des épitopes reconnus par les principaux AcN à larges spectre dont 2F5 et 4E10 dans la MPER de la gp41.
  12. 12. 11 Partie II : Stabilisation de l’interface gp120-gp41 par création de liaisons covalentes. A-Nécessité de délétion des domaines transmembranaire et cytoplasmique de la gp41. Dans le but de produire des grandes quantités de GP d’enveloppe pour produire un vaccin sous-unitaire, le complexe d’enveloppe a été exprimé dans différentes lignées cellulaires, malheureusement ce complexe étant transmembranaire il est insoluble et délicat à sur-exprimer. Les données précédentes indiquent l’importance des domaines transmembranaire et cytoplasmique, et on pourrait facilement en déduire que la délétion de ces deux domaines permettrait d’obtenir une GP d’enveloppe stable et soluble. Néanmoins, la conception de cette gp140 (c'est-à-dire gp120/∆gp41) n’a pas été simple puisque la délétion a du être faite à un acide aminé près. En effet, nous avons vu précédemment que l’épitope de l’AcN 4E10 se trouvait dans la partie C-terminale de la région MPER, juste en amont du domaine transmembranaire. Pour l’élaboration d’un immonogène susceptible d’induire une réponse anticorps neutralisante, il est impensable d’éliminer un épitope reconnu par un AcN. Après différents essais, la GP gp120/gp41 délétée précisément du domaine transmembranaire et cytoplasmique a été créée et a été nommée gp140. Cette protéine soluble possède la capacité de s’oligomériser. Les oligomères trimériques gp140 peuvent induire des AcN mais en faible quantité. Cette faible induction pourrait être dûe au caractère labile de l’association entre gp120 et ∆gp41, résultant en de multiples formes d’oligomères dans les préparations de gp140 [20]. C’est pour augmenter la stabilité de ce complexe que deux stratégies de stabilisation ont été développées. L’une utilisant l’ajout de ponts disulfures entre les différentes sous-unités du complexe d’enveloppe et l’autre éliminant le site de clivage.
  13. 13. 12 B- Stratégie évolutive de stabilisation : modèle SOS. L’instabilité entre les sous-unités gp120 et gp41 joue probablement un rôle essentiel dans les changements de conformation déclenchés par la liaison de la gp120 avec le récepteur CD4. Mais cette instabilité pose des problèmes pour l’expression du complexe d’enveloppe, notamment lorsqu’il s’agit d’exprimer des mutants démasquant des épitopes. De plus la dissociation de gp120 mène à l’exposition d’épitopes non neutralisants [21, 22], alors que c’est l’exposition des épitopes neutralisants ou inhibiteurs qui est recherchée pour la création d’un immunogène. Cette labilité a nécessité la mise au point de stratégies stabilisantes, comme l’introduction de ponts disulfure artificiels entre les deux sous-unités afin de créer la protéine gp140SOS. La gp140SOS est la première construction qui utilise une stratégie de stabilisation. Cette protéine recombinante contient des ponts disulfure reliant les deux sous-unités formant la GP d’enveloppe [7]. L’étude de ces protéines a montré qu’un positionnement approprié des ponts disulfure est essentiel. En effet, parmi différents mutants évalués, seule la protéine double mutante ayant des Cystéines aux positions 501 dans la gp120 et 605 dans la gp41 donne un complexe protéique gp120-gp41 stable, correctement replié, ayant des propriétés antigéniques favorables [22]. L’introduction de Cystéines en d’autres positions peut avoir un effet négatif sur le bon repliement de la protéine ou sur l’efficacité de formation des ponts disulfure [7]. Malgré une réussite dans la stabilisation de l’interface gp120-gp41, la gp140SOS présente un manque de stabilité au niveau des interactions entre les sous-unités gp41 d’un trimère, puisqu’elle se présente exclusivement sous forme monomérique. Afin de résoudre ce problème, la substitution d’une Pro par une Ile en position 559 (en N- terminale de la gp41) en plus de la mutation SOS a permis de créer un complexe protéique plus stable au sein duquel l’interaction gp41-gp41 est solidifiée [9, 23,1]. Cette nouvelle protéine, appelée gp140SOSIP, est majoritairement exprimée sous forme trimérique. Une étude récente a observé que la substitution de 5 résidus présents dans les gp140SOS ou gp140SOSIP d’un isolat de sous-type B du VIH-1 par ceux d’un isolat
  14. 14. 13 de sous-type A (Ile 535 Met, Glu 543 Leu, Ser 553 Asp, Lys 567 Glu et Arg 588 Gly) réduit l’hétérogénéité des formes oligomériques dans les surnageants de culture [24]. Cette dernière, nommée gp140SOSIP KNH1144, est trimérisée plus efficacement que la gp140SOSIP. En effet, on observe une réduction importante de la quantité de GP dimériques et tétramériques à la surface cellulaire alors que la quantité de trimères reste inchangée [25]. L’évolution des constructions de gp140 stabilisées par des ponts disulfure est représentée en Figure 6. Figure 6 : Schéma des différentes constructions de gp140 recombinantes, SOS, stabilisées par des ponts disulfure. Les ponts disulfure sont représentés en rouge, la mutation qui a permis la conception de la gp140SOSIP en vert et celles ajoutées dans la GP140SOSIP KNH1144 en bleu.
  15. 15. 14 C- Antigénicité et immunogénicité du complexe stabilisé. La protéine gp140SOS est clivée et antigénétiquement similaire à la protéine d’enveloppe native. En effet, les épitopes neutralisants qui sont exposés et les non- neutralisants qui sont cachés dans la GP d’enveloppe native, le sont également dans la protéine gp140SOS [7, 22]. La réalisation de différentes immunoprécipitations a mis en évidence que cette gp140SOS était bien reconnue pas les AcN 2G12, b12, 2F5 et 4E10 mais pas par les Ac non-neutralisants (comme 23A, 2.2B) [26]. Le masquage des épitopes non-neutralisants peut être la conséquence de la formation de ponts disulfure, mais ceci est encore discuté. La préservation des épitopes neutralisants dans les protéines gp140SOS (b12 et 2G12 dans la gp120 et 2F5 et 4E10 dans la gp41) combinée avec l’élimination des épitopes non-neutralisants est intéressant pour la mise au point d’un immunogène. Toujours est-il que cette protéine est exprimée sous forme monomérique. Par conséquent sa structure reste éloignée de celle d’une GP native. C’est pourquoi des études ont optimisé cette stratégie en créant la gp140SOSIP [9,23]. Cette protéine présente des propriétés de trimérisation améliorées [9, 12], et les AcN, b12, 2G12 et 2F5 ont une plus grande affinité pour les formes trimériques que monomériques [7]. La réactivité de cette protéine a été étudiée, et il a été observé que la mutation ajoutée dans cette gp140SOSIP n’affectait pas l’antigénicité par rapport à la gp140SOS. En effet, les épitopes neutralisants comme 2G12, b12, 2F5 et 4E10 sont toujours bien exposés [9]. Des tests d’immunisations ont été réalisés sur des lapins et il a été observé que cette gp140SOSIP était capable d’induire une activité neutralisante contre certaines souches du VIH-1, comme SF162 ou NL4/3 ou MN ou encore JR-FL. Cependant cette activité neutralisante varie entre les lapins immunisés et il est difficile d’induire une réponse neutralisante efficace dans tous les isolats primaires hétérologues du VIH-1 [12]. Différentes immunoprécipitations ont été réalisées afin d’analyser l’antigénicité de la gp140SOSIP KNH1144. Les résultats diffèrent sur la capacité de reconnaissance de cette protéine par les AcN 2F5 et 4E10. Dans une première étude, ces AcN ne sont pas capable de se lier à la protéine, concernant 2F5, il est expliqué que la séquence de cette GP recombinante contient un polymorphisme au niveau de cet épitope qui
  16. 16. 15 serait suffisant pour empêcher sa reconnaissance [27]. Et dans une deuxième étude, ces AcN reconnaissent aussi bien cette protéine gp140SOSIP KNH1144 que la GP140SOS [24]. En revanche, aucune ambigüité n’est observée sur les AcN dirigés contre la gp120. En effet les épitopes 2g12 et b12 sont parfaitement exposés dans ces deux protéines. Ce concept de stabilisation par ponts disulfure est en constante évolution, afin d’être affiné et amélioré. Par conséquent, la protéine possédant les propriétés antigénique et immunogénique les plus favorables pour un vaccin sous unitaire est la gp140SOSIP KNH1144.
  17. 17. 16 Partie III : Cas des protéines de fusion gp120 + gp41 et gp120+ ∆gp41 A-Stratégies de modification du site de clivage dans un contexte gp160 ou gp140. Pour augmenter la stabilité du complexe trimérique d’enveloppe, une autre stratégie est également décrite. Elle consiste en une modification dans le site de clivage protéolytique afin de fusionner soit la gp120 et gp41 pour obtenir une gp160 non clivée (gp160unc) soit la gp120 et la ∆gp41(délété du domaine transmembranaire et cytoplasmique) et ainsi obtenir une gp140 non clivée (gp 140unc). Le site de clivage des endoprotéases de la famille des furines se trouve dans les précurseurs gp160 au niveau d’acides aminés spécifiques Arg-Glu-Lys-Arg↓. Différentes constructions de GP non clivées ont été décrites. Par exemple la substitution de la séquence lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Val (la partie c-terminale de la gp120 et les deux premiers résidus de la gp41) par un motif hexamérique Leu-Arg [7], ou la substitution de la deuxième ou des deux Arg par des Ser [21, 3], ou encore la substitution de la première Arg par une Ile et de la Lys par un Gly [26]. Quoi qu’il en soit, toutes ces constructions permettent d’obtenir des gp160unc ou des gp140unc où les sous-unités de la GP sont fusionnées afin d’avoir des protéines d’enveloppe stables (Figure 7). Figure 7 : Evolution des GP non clivées.
  18. 18. 17 B-Stabilité et incorporation dans un virion des protéines de fusion gp160 ou gp140. Une simple mutation dans le site de clivage est nécessaire et suffisante pour permettre la formation d’oligomères stables. La trimérisation du précurseur gp160 se produit avant le clivage, ainsi la modification du site de clivage n’empêche pas l’oligomérisation de la protéine (Figure 4). La gp140unc est exprimée sous formes trimérique, monomérique et tétramérique [28]. Bien que la théorie ait longtemps indiqué que seules les protéines d’enveloppe clivées étaient incorporées dans les virions, des protéines d’enveloppe non clivées sont capables de former des spicules dans l’enveloppe virale [14, 29]. Les protéines gp160 non clivées sont donc transportées à la surface cellulaire et incorporées dans les virions bourgeonnants. Toutefois ces virions seront essentiellement non infectieux [29]. Les stratégies alternatives pour exposer la GP d’enveloppe du VIH-1 sont en évolution permanente, la plus récente est l’incorporation de cette GP dans des pseudo-particules virales comme les virus-like particles (VLP). Ce sont des particules hautement organisées qui s’auto-assemblent à partir d’un antigène structural dérivé de virus, comme le précurseur Gag dans le cas des VLP du VIH-1. En effet, il code principalement pour les protéines de structure de la matrice, de la capside et de la nucléocapside et est capable de s’auto-assembler en VLP. Dans le but d’induire une réponse humorale efficace dirigée contre la GP d’enveloppe du VIH-1, Env est associée à Gag. Ce procédé permet de présenter l’antigène dans une conformation proche de la conformation native. De plus, la forme particulaire facilite la prise en charge de ces VLP par les cellules présentatrices de l’antigène. Ces VLP ont donc un avenir très prometteur dans la recherche d’un vaccin contre le VIH-1. Concernant la gp140unc, nous avons vu précédemment que la queue cytoplasmique permettait une incorporation efficace de la GP d’enveloppe dans les virions bourgeonnants, par conséquent cette GP est assez faiblement incorporée.
  19. 19. 18 Mais cette protéine est également délétée du domaine transmembranaire, elle ne peut donc ni s’ancrer dans une membrane ni être incorporée dans les virions. Ces protéines étant solubles, elles ne sont pas utilisées dans les VLP ou dans les PP. C-Antigénicité et immunogénicité des protéines de fusion stabilisé. À l’exception de l’anticorps 2G12, les AcN b12, 17b et 2F5 reconnaissent la GP d’enveloppe non clivée plus efficacement que la GP d’enveloppe clivée [20]. Ce n’est pas simplement dû à la diminution de la dissociation de la gp120 qui est associée aux molécules défectueuses pour le clivage. En effet, il semblerait que le clivage protéolytique entraînerait une conformation de la GP où les différents épitopes seraient plus efficacement masqués [21]. Cet avantage immunogénique n’est décrit que dans une publication et est couramment contesté. Il s’avèrerait plutôt que la protéine 140unc est antigénétiquement et structuralement différente des protéines clivées [14]. Il y a des épitopes exposés sur la protéine gp140unc qui ne sont pas exposés sur les virions natifs [7]. De plus les AcN anti-gp120 se lient plus fortement et plus rapidement aux gp140SOSIP qu’aux gp140unc alors que l’inverse est observé pour les anticorps non-neutralisants [9, 26]. Deux possibilités peuvent être à l’origine de ces différences : les épitopes de neutralisation seraient générés seulement après le clivage protéolytique du précurseur gp160 et/ou l’élimination du site de clivage perturberait la structure de la protéine d’enveloppe et donc les épitopes neutralisants. Il apparaîtrait que la suppression du site de clivage altèrerait la conformation des sous-unités gp120 [7], car la maturation protéolytique permet un subtil mais néanmoins important ajustement de la conformation de la GP d’enveloppe [21]. Bien que ces protéines gp140unc soient oligomériques et stable du fait de l’élimination de l’interface entre gp120 et gp41, on peut se demander si elles miment vraiment le complexe glycoprotéique d’enveloppe natif et si elles sont de bonnes
  20. 20. 19 protéines pour l’élaboration d’un immunogène d’enveloppe susceptible d’induire des AcN à large spectre.
  21. 21. 20 Conclusions et perspectives Deux types de modifications ont été développées afin de stabiliser le complexe glycoprotéique d’enveloppe du VIH-1. D’une part, des ponts disulfure ont été introduits entre les sous-unités gp120 et gp41 formant le complexe. Dans cette stratégie, différents degrés de stabilisation ont été établis. D’autre part, ces sous- unités ont été fusionnées par mutation dans le site de clivage. Ces GP recombinantes, d’un point de vue antigénique et immunogénique, ont des propriétés intéressantes puisqu’elles sont reconnues efficacement par des AcN (comme 2G12, b12, 2F5 et 4E10) et qu’elles sont capables d’induire ces AcN après administration dans des modèles animaux. Néanmoins, cette induction n’est pas suffisante pour l’élaboration d’un candidat vaccin anti-VIH. C’est pourquoi ces modifications stabilisantes sont aujourd’hui combinées avec d’autres, afin d’exposer au mieux les épitopes des AcN pour induire fortement ces Ac. Les plus étudiées sont les délétions de boucles variables ou les déglycosylations de certains sites de N-glycosylation. En effet, certaines boucles variables de la gp120 et certains sucres masquent des épitopes qui peuvent avoir un rôle important pour la neutralisation. La délétion de boucles variable la plus étudiée est celle de la boucle variable V2 puisqu’elle peut augmenter l’immunogénicité de la GP d’enveloppe du VIH-1 [3, 29]. Concernant les mutations des sites de glycosylations, une étude récente a observé que des macaques immunisés avec un immunogène d’enveloppe délété de cinq glycanes montraient clairement une meilleur réponse humorale neutralisante que les animaux immunisés avec la protéine sauvage [30]. Une autre étude a été réalisée sur une GP d’enveloppe mutée sur quatre sites de glycosylation et délétée de la boucle V2. On constate que les AcN à large spectre 447- 52D, 2F5 et b12 se lient fortement à ces mutants [31]. On peut donc penser que les boucles variables et les glycanes interagissent fortement, modifiant ainsi les propriétés d’antigénicité. Le complexe glycoprotéique d’enveloppe du VIH-1 offre tout un panel de mutations possibles qui permettent d’augmenter son antigénicité mais surtout son
  22. 22. 21 immunogénicité. Mais les plus prometteuses sont les mutations sur le manteau de glycanes. Les recherches doivent donc être poursuivies afin de trouver quelle(s) mutation(s) ou quelle(s) combinaison(s) de mutations seraient les plus appropriées pour la conception d’un immunogène capable de neutraliser différents isolats du VIH. Mon rapport technique aura justement pour objectifs d’étudier l’influence de certaines mutations de sites de glycosylation dans un contexte gp140unc.
  23. 23. 22 References. [1]Gilbert.PB, Peterson.ML, Follmann.D, Hudgens.MG, Francis.DP, Gurwith.M, Heyward.WL, Jobes.DV, Popovic.V, Self.SG, Sinangil.F, Burke.D, Bermann.PW. 2005. Correlation between immunologic responses to a recombinant glycoprotein 120 vaccine and incidence of HIV-1 infection in a phase 3 HIV-1 preventive vaccine trial. J Infect Dis. Vol 191: 666-677. [2] Yuan.W, Craig.S, Yang.X, Sodroski.J. 2005. Inter-subunit disulfide bonds in soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers. Virology. Vol 332: 369-383. [3] Srivastava.IK, Stamatatos.L, Kan.E, Vajdy.M, Lian.Y, Hilt.S, Martin.L, Vita.C, Zhu.P, Roux.KH, Vojtech.L, Montefiori.D, Donnelly.J, Ulmer.JB, Barnett.SW. 2003. Purification, characterization, and immunogenicity of a soluble trimeric envelope protein containing a partial deletion of the V2 loop derived from SF162, an R5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolate. J Virol. Vol 77: 11244-11259. [4] Jeffs.SA, Goriup.S, Kebble.B, Crane.D, Bolgiano.B, Sattentau.Q, Jones.S, Holmes.H. 2004. Expression and characterization of recombinant oligomeric envelope glycoproteins derived from primary isolates of HIV-1. Vaccine. Vol 22: 1032-1046. [5] Moulard.M, Chaloin.L, Canarelli.S, Mabrouk.K, Darbon.H. 1998. Retroviral envelope glycoprotein processing: structural investigation of the cleavage site. Biochemistry. Vol 37: 4510-4517. [6] Willey.RL, Bonifacino.JS, Potts.BJ, Martin.MA, Klausner.RD.1988. Boisynthesis, cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc Natl Acad Sci USA. Vol 85: 9580-9584. [7] Binley.JM, Sanders.RW, Clas.B, Schuelke.N, Master.A, Guo.Y, Kajumo.F, Anselma.DJ, Maddon.PJ, Olson.WC, Moore.JP. 2000. A recombinant human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein complex stabilized by an intermolecular disulfide bond between the gp120 and gp41 subunits is an antigenic mimic of the trimeric virion-associated structure. J Virol. Vol 74: 627-643. [8] Cao.J, Bergeron.L, Helseth.E, Thali.M, Repke.H, Sodroski.J. 1993. Effects of amino acid changes in the extracellular domain of the human immunodeficiency virus type 1 gp41 envelope glycoprotein. J Virol. Vol 67: 2747-2755 [9] Sanders.RW, Vesanen.M, Schuelke.N, Master.A, Schiffner.L, Kalyanaraman.R, Paluch.M, Berkhout.B, Maddon.PJ, Olson.WC, Lu.M, Moore.JP. 2002. Stabilization of
  24. 24. 23 the soluble, cleaved, trimeric form of the envelope glycoprotein complex of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. Vol 76: 8875-8889. [10] Sen.J, Jacobs.A, Caffrey.M. 2008. Role of the HIV gp120 conserved domain 5 in processing and viral entry. Biochemistry. Vol 47: 7788-7795. [11] Wang.J, Sen.J, Rong.L, Caffrey.M. 2008. Role of the HIV gp120 conserved domain 1 in processing and viral entry. J Biol Chem. Vol 283: 32644–32649. [12]Beddows.S, Franti.M, Dey.AK, Kirschner.M, Iyer.SP, Fisch.DC, Ketas.T, Yuste.E, Desrosiers.RC, Klasse.PJ, Maddon.PJ, Olson.WC, Moore.JP. 2007. A comparative immunogenicity study in rabbits of disulfide-stabilized, proteolytically cleaved, soluble trimeric human immunodeficiency virus type 1 gp140, trimeric cleavage- defective gp140 and monomeric gp120. Virology. Vol 360: 329-340. [13] Lin.X, Derdeyn.CA, Blumenthal.R, West.J, Hunter.E. 2003. Progressive truncations C terminal to the membrane-spanning domain of simian immunodeficiency virus Env reduce fusogenicity and increase concentration dependence of Env for fusion. J Virol. Vol 77: 7067-7077. [14] Welman.M, Lemay.G, Cohen.EA. 2007. Role of envelope processing and gp41 membrane spanning domain in the formation of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) fusion-competent envelope glycoprotein complex. Virus Res. Vol 124: 103-112. [15] Zwick.MB, Jensen.R, Church.S, Wang.M, Stiegler.G, Kunert.R, Katinger.H, Burton.DR. 2005. Anti-human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) antibodies 2F5 and 4E10 require surprisingly few crucial residues in the membrane-proximal external region of glycoprotein gp41 to neutralize HIV-1. J Virol. Vol 79: 1252-1261. [16] Piller.SC, Dubay.JW, Derdeyn.CA, Hunter.E. 2000. Mutational analysis of conserved domains within the cytoplasmic tail of gp41 from human immunodeficiency virus type 1: effects on glycoprotein incorporation and infectivity. J Virol. Vol 74: 11717-11723. [17] Wyss.S, Dimitrov.AS, Baribaud.F, Edwards.TG, Blumenthal.R, Hoxie.JA. 2005. Regulation of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein fusion by a membrane-interactive domain in the gp41 cytoplasmic tail. J Virol. Vol 79: 12231-12241. [18] Murakami.T, Freed.E. 2000. The long cytoplasmic tail of gp41 is required in a cell type dependant maner for HIV-1 envelope glycoprotein incorporation into virions. Proc Natl Acad Sci USA. Vol 97: 343-348.
  25. 25. 24 [19] Gabuzda.DH, Lever.A, Terwilliger.E, SodroskiJ.1992. Effects of deletions in the cytoplasmic domain on biological functions of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteins. J Virol. Vol 66: 3306-3315. [20] Kim.M, Qiao.ZS, Montefiori.DC, Haynes.BF, Reinherz.EL, Liao.HX. 2005. Comparison of HIV type 1 ADA gp120 monomers versus gp140 trimers as immunogens for the induction of neutralizing antibodies. AIDS Res Hum Retroviruses. Vol 21: 58-67. [21] Zhihai.SI, Phan.N, Kiprilov.E, Sodroski.J. 2003. Effects of HIV type 1 envelope glycoprotein proteolytic processing on antigeninity. AIDS Res Hum Retroviruses. Vol 19: 217-226. [22] Sanders.RW, Dankers.MM, Busser.E, Caffrey.M, Moore.JP, Berkhout.B. 2004. Evolution of the HIV-1 envelope glycoproteins with a disulfide bond between gp120 and gp41. Retrovirology. [23] Beddows.S, Schülke.N, Kirschner.M, Barnes.K, Franti.M, Michael.E, Ketas.T, Sanders.RW, Maddon.PJ, Olson.WC, Moore.JP. 2005. Evaluating the immunogenicity of a disulfide-stabilized, cleaved, trimeric form of the envelope glycoprotein complex of human immunodeficiency virus type1. J Virol. Vol 79: 8812-8827. [24] Dey.AK, David.KB, Klasse.PJ, Moore.JP. 2007. Specific amino acids in the N- terminus of the gp41 ectodomain contribute to the stabilization of a soluble, cleaved gp140 envelope glycoprotein from human immunodeficiency virus type 1. Virology. Vol 360: 199-208. [25] Dey.AK, David.KB, Ray.N, Ketas.TJ, Klasse.PJ, Doms.RW, Moore.JP. 2008. N- terminal substitutions in HIV-1 gp41 reduce the expression of non-trimeric envelope glycoproteins on the virus. Virology. Vol 372: 187-200. [26] Schülke.N, Vesanen.MS, Sanders.RW, Zhu.P, Lu.M, Anselma.DJ, Villa.AR, Parren. PW, Binley.JM, Roux.KH, Maddon.PJ, Moore.JP, Olson.WC. 2002. Oligomeric and conformational properties of a proteolytically mature, disulfide-stabilized human immunodeficiency virus type 1 gp140 envelope glycoprotein. J Virol. Vol 76: 7760-7776. [27] Beddows.S, Kirschner.M, Campbell-Gardener.L, Franti.M, Dey.AK, Iyer.SP, Maddon.PJ, Paluch.M, Master.A, Overbaugh.J, VanCott.T, Olson.WC, Moore.JP. 2006. Construction and characterization of soluble, cleaved, and stabilized trimeric Env proteins based on HIV type 1 Env subtype A. AIDS Res Hum Retroviruses. Vol 22: 596-579.
  26. 26. 25 [28] Center.RJ, Lebowitz.J, Leapman.RD, Moss.B. 2004. Promoting trimerisation of soluble human immunodeficiency virus type1 (HIV-1) Env through the use of HIV- 1/simian immunodeficiency virus chimeras. J Virol. Vol 78: 2265-2276. [29] Srivastava.IK, VanDorsten.K, Vojtech.L, Barnett.SW, Stamatatos.L. 2003b. Changes in the immunogenic properties of soluble gp140 human immunodeficiency virus envelope constructs upon partial deletion of the second hypervariable region. J Virol. Vol 77: 2310-2320. [30] Sugimoto.C, Nakayama.EE, Shioda.T, Villinger.F, Ansari.AA, Yamamoto.N, Suzuki.Y, Nagai.Y, Mori.K. 2008. Impact of glycosylation on antigenicity of simian immunodeficiency virus SIV239: induction of rapid V1/V2-specific non neutralizing antibody and delayed neutralizing antibody following infection with an attenuated deglycosylated mutant. J Gen Virol. Vol 89: 554-566. [31] Auwerx.J, François.KO, Covens.K,Van Laethem.K, Balzarini.J. 2008. Glycan deletions in the HIV-1 gp120 V1/V2 domain compromise viral infectivity, sensitize the mutant virus strains to carbohydrate-binding agents and represent a specific target for therapeutic intervention. Virology. Vol 382: 10-19.

×