Pretseille EmmanuelleMaster MABS 2011-2012Diagnostic moléculaire des MODetermination of Escherichia coli O types by allele...
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IntroductionEscherichia coli et ses propriétés antigéniques                         Escherichia coli    - Bacille Gram - ,...
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Introduction       Sérotypage de lantigène O                                                         Limites              ...
Introduction         Sérotypage de lantigène O                                                           Limites          ...
Introduction         Sérotypage de lantigène O                                                           Limites          ...
Introduction       Sérotypage de lantigène O (suite)                     Opéron rfb (6 à 19 gènes)             JUMPstart g...
Introduction       Sérotypage de lantigène O (suite)                      Opéron rfb (6 à 19 gènes)            JUMPstart g...
Introduction       Sérotypage de lantigène O (suite)                      Opéron rfb (6 à 19 gènes)            JUMPstart g...
Objectif et démarche R&D           Objectif→ Mise au point dun méthode de sérotypage de lantigène Obasée sur une PCR multi...
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Sélection des sérotypes et des souches                    Détermination des groupes                         phylogénétique...
Mise au point de la méthode de sérotypage        Sélection des sérotypes et des souches→ Choix des 12 sérotypes les plus f...
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Sélection des sérotypes et des souches                   Détermination des groupes                        phylogénétiques ...
Méthode de sérotypage       Détermination des groupes phylogénétiques des souches     Analyses phylogénétiques            ...
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Méthode de sérotypage       Détermination des groupes phylogénétiques des souches       (suite)                           ...
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MLST                       Détermination du groupe phylogénétique par MLST       polB                trpA                 ...
Sélection des sérotypes et des souches                   Détermination des groupes                        phylogénétiques ...
Méthode de sérotypage       Design des amorces → 2 souches phylogénétiquement éloignées par sérotype                      ...
Méthode de sérotypage      Design des amorces (suite)  Amplification du      Séquençage de         Choix de lamorce    clu...
Méthode de sérotypage      Design des amorces (suite)  Amplification du          Séquençage de           Choix de lamorce ...
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Long Range PCR                    Le kit Expand Long Template PCR System (Roche) Extrait de Roche (2005)                  ...
Méthode de sérotypage       Design des amorces (suite)   Amplification du        Séquençage de         Choix de lamorce   ...
Principe du séquençage par électrophorèse capillaire :Séquençage                       étapes majeures (Applied Biosystems...
Méthode de sérotypage       Design des amorces (suite)   Amplification du        Séquençage de         Choix de lamorce   ...
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Critères doptimisation du design damorcesDesign damorces                                   Une bonne amorce PCR doit être ...
Méthode de sérotypage       Mise en place de lessai                           PCR multiplex - Milieu réactionnel          ...
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Méthode de sérotypage                             Mise en place de lessai (suite)                                         ...
Méthode de sérotypage       Mise en place de lessai (suite) - Résultats                                           Extrait ...
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Sélection des sérotypes et des souches                   Détermination des groupes                        phylogénétiques ...
Méthode de sérotypage      Validation de lessai    Reproductibilité          Sensibilité   Spécificité
Méthode de sérotypage       Validation de lessai     Reproductibilité             Sensibilité             Spécificité     ...
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Sélection des sérotypes et des souches                    Détermination des groupes                         phylogénétique...
Méthode de sérotypage      Résolution des discordances          → 12 souches montrant des discordances de sérotypes       ...
Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000)  rfb RFLP- Long-range PCR   gnd                      Opéron rfb            ...
Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000)    rfb RFLP - Long-range PCR      gnd                        Opéron rfb    ...
Méthode de sérotypage       Résolution des discordances            → 12 souches montrant des discordances de sérotypes    ...
Méthode de sérotypage        Résolution des discordances (suite) Produit PCR présentant un type 0 qui                     ...
Méthode de sérotypage        Résolution des discordances (suite) Produit PCR présentant un type 0 qui                     ...
Plan de la présentationIntroduction  - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques  - Sérotypage de lantigène OObjecti...
Conclusions       Une méthode robuste→ Méthode moléculaire de sérotypage de lantigène O dEscherichia coli     Méthode     ...
Sélection des sérotypes et des souches                   Détermination des groupes                        phylogénétiques ...
Conclusion      Des applications personnalisables – DIAGNOSTIC :       Sérotypage de routine en LABM en cas de septicémies...
Références bibliographiques- Applied Biosystems (2009) DNA sequencing by capillary electrophoresis- Biomérieux (2012)http:...
Références bibliographiques- Institut Pasteur (2006) Rapport dactivité du Centre national de référenceEscherichia coli et ...
Pretseille EmmanuelleRahabi Mouna ChirineMaster MABS 2011-2012Diagnostic moléculaire des MOPublication n°6Determination of...
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Oral Diagnostic moléculaire PCR Multiplex Sérotypage

  1. 1. Pretseille EmmanuelleMaster MABS 2011-2012Diagnostic moléculaire des MODetermination of Escherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction : application to the O types involved in human septicemia Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. N°57 (2007)
  2. 2. Plan de la présentationIntroduction - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques - Sérotypage de lantigène OObjectif et démarche R&DMise au point de la méthode de sérotypage - Sélection des sérotypes et des souches - Détermination des groupes phylogénétiques des souches - Design damorces et mise en place de lessai - Validation de lessai - Résolution des discordancesConclusions
  3. 3. IntroductionEscherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
  4. 4. Introduction Escherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%) - Aussi un agent pathogène ! Pathologies dues à E. coli Intestinales Diarrhées Turista TIA Dysenterie SHU Extraintestinales Infections urinaires (80%) (ExPEC) Septicémies (20%)E. coli est responsable de pathologies intestinales mais aussi extra-intestinales.
  5. 5. Introduction Escherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%) - Aussi un agent pathogène ! Capsule Antigène K Antigène OParoi Antigène H Flagelle Antigènes K, O et H dE. coli
  6. 6. Introduction Escherichia coli et ses propriétés antigéniques Escherichia coli - Bacille Gram - , ɣprotéobactérie - Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%) - Aussi un agent pathogène ! Capsule Antigène K Antigène O PouvoirParoi pathogène Antigène H Flagelle Antigènes K, O et H dE. coli
  7. 7. Introduction Sérotypage de lantigène O Limites Techniques de Sérogroupe sérotypage Coût Résultats Applications→ Diagnostic→ Épidémiologie Agglutination→ Vaccinologie ? avec des +++ + +++ antisérums (Biorad) Agglutination avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid) Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO phénotypique ++ +++ O157:H7 (Biomérieux) de lantigène O dE. coli
  8. 8. Introduction Sérotypage de lantigène O Limites Techniques de sérotypage Coût Résultats ApplicationsMéthode classique Agglutination avec des +++ + +++ antisérums (Biorad) AgglutinationTest dagglutination + avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid) Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO phénotypique ++ +++ O157:H7 (Biomérieux) de lantigène O dE. coli
  9. 9. Introduction Sérotypage de lantigène O Limites Techniques de sérotypage Coût Résultats Applications→ Nécessité dune Agglutinationnouvelle technologie : avec des- coûteuse, + fiable et +++ + +++ antisérums+ universelle (Biorad) Agglutination avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid) Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO ++ +++ O157:H7 phénotypique (Biomérieux) de lantigène O dE. coli
  10. 10. Introduction Sérotypage de lantigène O Limites Techniques de sérotypage Coût Résultats Applications→ Nécessité dune Agglutinationnouvelle technologie : avec des- coûteuse, + fiable et +++ + +++ antisérums+ universelle (Biorad) Agglutination avec des billes ++ +++ + de latex + Ac anti-O (Oxoid)Approche moléculaire Milieux chromogènes + ++ 0157:H7 (BD) La détermination Vidas ICE/ECO ++ +++ O157:H7 phénotypique (Biomérieux) de lantigène O dE. coli
  11. 11. Introduction Sérotypage de lantigène O (suite) Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart gnd galF Synthèse de lantigène O Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de lantigène O.
  12. 12. Introduction Sérotypage de lantigène O (suite) Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart gnd galF Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de lantigène O. Techniques de sérotypage Limites - Uniquement pour certains sérotypes PCR basées sur les SNP de rfb - Difficulté dapplication en diagnostic - Long « rfb-RFLP » - Difficulté dinterprétation des résultats La détermination génotypique de lantigène O dE. Coli
  13. 13. Introduction Sérotypage de lantigène O (suite) Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart gnd galF Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de lantigène O. Techniques de sérotypage Limites - Uniquement pour certains sérotypes PCR basées sur les SNP de rfb - Difficulté dapplication en diagnostic - Long « rfb-RFLP » - Difficulté dinterprétation des résultats La détermination génotypique de lantigène O dE. Coli
  14. 14. Objectif et démarche R&D Objectif→ Mise au point dun méthode de sérotypage de lantigène Obasée sur une PCR multiplexe allèle spécifique de la portion 5 dulocus rfb : application aux Escherichia coli impliquées dans lessepticémies humainesHémocultures(Biomérieux) E.coli Réplicons LPS etUne approche antigène Omoléculaire pour le ADNsérotypage Thermocycleur (Eppendorf)
  15. 15. Objectif et R&D Sélection des sérotypes et des souches Démarche R&D Détermination des groupes Légende phylogénétiques des souches Pré-requis Mise au point Design des amorces Non Mise en place de lessai Devenir Résolution des discordances Oui Validation Non de lessai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  16. 16. Plan de la présentationIntroduction - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques - Sérotypage de lantigène OObjectif et démarche R&DMise au point de la méthode de sérotypage - Sélection des sérotypes et des souches - Détermination des groupes phylogénétiques des souches - Design damorces et mise en place de lessai - Validation de lessai - Résolution des discordancesConclusions
  17. 17. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de lessaiRésolution des discordances Oui Validation Non de lessai Oui ApplicationsÉtapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  18. 18. Mise au point de la méthode de sérotypage Sélection des sérotypes et des souches→ Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine Sérotypes étudiés O1 O7 O18 O2 O12 O25 O4 O15 O75 O6 O16 O157 Une sélection ciblée sur les sérotypes majeurs en bactériologie sanguine
  19. 19. Mise au point de la méthode de sérotypage Sélection des sérotypes et des souches→ Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine→ Un panel de 370 Escherichia coli aux caractères variés Souches pathogènes : Souches non Collections de - urosepsis, pathogènes, souches - infections commensales Ex : ECOR urinaires chez Ex : Nissle 1917 vétérans, - ExPEC
  20. 20. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de lessaiRésolution des discordances Oui Validation Non de lessai Oui ApplicationsÉtapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  21. 21. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches Analyses phylogénétiques 4 groupes dE.coli Groupe Type dE. coli phylogénétique A Commensales B1 NR B2 ExPEC D ExPEC La pathogénicité dE.coli semble liée à son groupe phylogénique.
  22. 22. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches Analyses phylogénétiques 4 groupes dE.coli Groupe Type dE. coli phylogénétique A Commensales B1 NR B2 ExPEC D ExPEC La pathogénicité dE.coli semble liée à son groupe phylogénique. Comment le déterminer ?
  23. 23. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches (suite) 2 méthodes utilisées PCR triplex MLST→ Existence de séquences ADNspécifiques aux groupesphylogénétiques chuA, yjaA et TspE4C2 Mise en évidence par : PCR triplex et Southern blot
  24. 24. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches (suite) 2 méthodes utilisées PCR triplex MLSTExtrait de Clermont et al. (2000) Détermination du groupe phylogénétique par PCR triplex
  25. 25. Méthode de sérotypage Détermination des groupes phylogénétiques des souches (suite) 2 méthodes utilisées PCR triplex MLST→ Existence de séquences ADN Multilocus sequence typingspécifiques aux groupesphylogénétiques chuA, yjaA et TspE4C2 Détermination de profils alléliques Mise en évidence par : PCR triplex et Southern blot
  26. 26. MLST Détermination du groupe phylogénétique par MLST polB trpA Amplification Chromosome icd E. coli trpB par PCR Séquençage des (fragment ~450nt) fragments obtenus pabB putPSélection de 6 gènes de ménage Identification des allèles de chaque locus Obtention des Arbre profils alléliquesphylogénétique (ou sequence type) Compilation des données
  27. 27. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de lessaiRésolution des discordances Oui Validation Non de lessai Oui ApplicationsÉtapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  28. 28. Méthode de sérotypage Design des amorces → 2 souches phylogénétiquement éloignées par sérotype Extrait de Clermont et al. (2007) Une sélection de souches pour des résultats discriminants
  29. 29. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de lamorce cluster rfb lextrémité 5 de rfb reverse O spécifique
  30. 30. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de lamorce cluster rfb lextrémité 5 de rfb reverse O spécifique Amplification du cluster rfb par Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
  31. 31. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de lamorce cluster rfb lextrémité 5 de rfb reverse O spécifique Amplification du cluster rfb par Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Fragment correspondant à rfb ( ~5000-17000 pb) Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
  32. 32. Long Range PCR Le kit Expand Long Template PCR System (Roche) Extrait de Roche (2005) Mix de 2 ADN polymérases Enzyme Origine Activité Caractéristiques Thermostable Thermus Taq Polymérase 53 Spécifique aquaticus Sensible Thermococcus Polymérase 53 Thermostable Tgo gorgonarius Exonucléase 35 Fidèle Un mix de polymérase « idéal » pour la Long-range PCR
  33. 33. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de lamorce cluster rfb lextrémité 5 de rfb reverse O spécifique Séquençage de lextrémité 5 de rfb Séquençage par électrophorèse capillaire des fragments PCR obtenus
  34. 34. Principe du séquençage par électrophorèse capillaire :Séquençage étapes majeures (Applied Biosystems) - Cycle de séquençage par technologie BigDye terminator Extrait de Applied Biosystems (2009) - Electrophorèse capillaire → Séparation des fragments selon leur taille (charge) via un polymère dénaturant POP & détection de la fluroscence du Extrait de Applied Biosystems (2009) ddNTP terminal Résultats de lélectrophorèse capillaire
  35. 35. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de lamorce cluster rfb lextrémité 5 de rfb reverse O spécifique Séquençage de lextrémité 5 de rfb Séquençage par électrophorèse capillaire des fragments PCR obtenus Séquences nucléotidiques interprétables d~300-800 pb pour le design damorces O spécifiques
  36. 36. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de lamorce cluster rfb lextrémité 5 de rfb reverse O spécifique Choix de lamorce reverse O spécifique → Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de celles obtenues par de novo sequençage
  37. 37. Méthode de sérotypage Design des amorces (suite) Amplification du Séquençage de Choix de lamorce cluster rfb lextrémité 5 de rfb reverse O spécifique Choix de lamorce reverse O spécifique → Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de celles obtenues par de novo sequençage Design des amorces reverse O spécifiques (fragments de 200 à 700 pb après PCR) Exemples : rfbO16.r 5-GGATCATTTATGCTGGTACG-3 (450pb) rfbO7.r 5-CGAAGATCATCCACGATCCG-3 (722pb)
  38. 38. Critères doptimisation du design damorcesDesign damorces Une bonne amorce PCR doit être ... - Absence dhybridation secondaire Spécifique ! - Minimum de 18 bases de long - Tm > 45°C - GC% ~50% - Aucun dimère de nuclétotides Stable ! - Aucun palindrome (structures secondaires) - Attention GC% en 3 Et attention 1 - Tm proches à la compatibilité !
  39. 39. Méthode de sérotypage Mise en place de lessai PCR multiplex - Milieu réactionnel Lysat bactérien dATP dGTP, dTTP et dCTP 1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie)
  40. 40. Méthode de sérotypage Mise en place de lessai PCR multiplex - Milieu réactionnel Lysat bactérien dATP dGTP, dTTP et dCTP 1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie) rfbO1.r , rfbO2.r , rfbO18.r , rfbO4.r , rfbO12.r , rfbO75.r , rfbO16.r , rfbO6a.r & rfbO7.r rfbO25a.r , rfbO15.r & rfbO157.r Primer set 1 Primer set 2
  41. 41. Méthode de sérotypage Mise en place de lessai (suite) PCR multiplex - Programme PCR 100 95 90 Eppendorf MastercyclerTempérature (en °C°) (Eppendorf) 85 Dénaturation 80 (4 min, 94°C) 75 70 Extension finale 65 (5 min, 72°C) 60 55 30 cycles 50 5s, 94°C 10s, 59°C Temps (en seconde) Évolution de la température dans le thermocycleur
  42. 42. Méthode de sérotypage Mise en place de lessai (suite) - Résultats Extrait de Clermont et al. (2007) Primer set 1 Primer set 2 Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex (gel dagarose et BET révélé aux UV)
  43. 43. Méthode de sérotypage Mise en place de lessai (suite) - Résultats Extrait de Clermont et al. (2007) Primer set 1 Primer set 2 Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex (gel dagarose et BET révélé aux UV) Profils électrophorétiques identiques pour un même sérotype (fragment PCR de même taille)
  44. 44. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de lessaiRésolution des discordances Oui Validation Non de lessai Oui ApplicationsÉtapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  45. 45. Méthode de sérotypage Validation de lessai Reproductibilité Sensibilité Spécificité
  46. 46. Méthode de sérotypage Validation de lessai Reproductibilité Sensibilité Spécificité Reproductibilité (répétabilité) Testée inter-laboratoires. Tests réalisés : - PCR multiplex avec amorces spécifiques x12 - Typage de 24 souches dites communes Méthode reproductible et précise (Résultats identiques mais quelques optimisations)
  47. 47. Méthode de sérotypage Validation de lessai Reproductibilité Sensibilité Spécificité SensibilitéTest sur 153 souches → Sensibilité ~ 93%Problèmes rencontrés :- Absence de produit PCR,- Fragment de PCR correspondantà un autre sérotype que celuiattendu Sensibilité et spécificité de la PCR multiplex
  48. 48. Méthode de sérotypage Validation de lessai Reproductibilité Sensibilité Spécificité SpécificitéTest sur 167 souches représentant61 sérotype O non ciblés→ Aucune fausse amplificationProblème rencontré : Faux positifs pour 6 souches auxsérotypes O ciblés maisapparaissant faussement dun autresérotype Sensibilité et spécificité de la PCR multiplex
  49. 49. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de lessaiRésolution des discordances Oui Validation Non de lessai Oui Applications Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  50. 50. Méthode de sérotypage Résolution des discordances → 12 souches montrant des discordances de sérotypes rfb RFLP et séquençage
  51. 51. Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000) rfb RFLP- Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Fragment correspondant à rfb Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
  52. 52. Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000) rfb RFLP - Long-range PCR gnd Opéron rfb JUMPstart gnd.f JUMPstart.r Fragment correspondant à rfb Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR - RFLP (Restriction Length Fragment Polymorphism) 5 GAAGANNNNNNNN / 3 3 CTTCTNNNNNNN / N 5Site de coupure de lendonucléase MboII
  53. 53. Méthode de sérotypage Résolution des discordances → 12 souches montrant des discordances de sérotypes rfb RFLP et séquençage Rappel des problèmes rencontrés : - Échec de lamplification malgré les amorces spécifiques - Produit PCR présentant un type 0 qui nest pas le sien
  54. 54. Méthode de sérotypage Résolution des discordances (suite) Produit PCR présentant un type 0 qui Adapté de Clermont et al. (2007) nest pas le sien → O1 et O6 / O18 Réarrangement du locus rfb et présence dune séquence typique de O18 Profil électrophorétique après rfb RFLP
  55. 55. Méthode de sérotypage Résolution des discordances (suite) Produit PCR présentant un type 0 qui Adapté de Clermont et al. (2007) nest pas le sien → O12/O16 Les souches appartiennent bien au sérotype O16. (portion 5 de rfb typique de ce sérotype) Profil électrophorétique après rfb RFLP
  56. 56. Plan de la présentationIntroduction - Escherichia coli et ses propriétés antigéniques - Sérotypage de lantigène OObjectif et démarche R&DMise au point de la méthode de sérotypage - Sélection des sérotypes et des souches - Détermination des groupes phylogénétiques des souches - Design damorces et mise en place de lessai - Validation de lessai - Résolution des discordancesConclusions
  57. 57. Conclusions Une méthode robuste→ Méthode moléculaire de sérotypage de lantigène O dEscherichia coli Méthode Qualités Limites Rapide Simple Sérotypage incorrect si : PCR multiple Peu coûteuse - voies de synthèse de lAg allèle Appareillage simple O variables spécifique Typage de souches - dégénérescence du locus « rough » et « non rfb agglutinantes » Bilan de lessai de Clermont et al. (2007)
  58. 58. Sélection des sérotypes et des souches Détermination des groupes phylogénétiques des souches Design des amorces Non Mise en place de lessaiRésolution des discordances Oui Validation Non de lessai Oui ApplicationsÉtapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)
  59. 59. Conclusion Des applications personnalisables – DIAGNOSTIC : Sérotypage de routine en LABM en cas de septicémies à E. coli – EPIDEMIOLOGIE: Création de kits épidémies spécifiques selon une région géographique et/ou une pathologie Exemple : Sérotype O45 et méningite du nouveau-né en France
  60. 60. Références bibliographiques- Applied Biosystems (2009) DNA sequencing by capillary electrophoresis- Biomérieux (2012)http://www.biomerieux.fr/servlet/srt/bio/france/dynPage?open=FRN_IND_FDA_PRD&do- Clermont O., Bonacorsi S. & Bingen E. (2000) Rapid and simple determination ofthe Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Microbiol 66:639-654- Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. (2007) Determination ofEscherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction: application tothe O types involved in human septicemia. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease 57:129-136- Escobar-Paramo P., Clermont O., Blanc-Potard AB, Bui H, Le Bouguenec C &Denamur E. (2004) A specific genetic background is required for acquisition andexpression of virulencde factors in Escherichia coli. Mol Biol Evol 21:1085-1094- Genscript (2012)http://www.genscript.com/cgi-bin/products/enzyme.cgi?op=all_ez&name=MboII
  61. 61. Références bibliographiques- Institut Pasteur (2006) Rapport dactivité du Centre national de référenceEscherichia coli et Shigella- Oxoid (2012)http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=DR0120&org=72&c=UK&- Roche (2005) Expand Long Template PCR system- Szalo I.M., Taminiau B. & Mainil J. (2006) La lipopolysacharide dEscherichia coli :structure, biosynthèse et rôles. Ann Méd Vét 150:108-124
  62. 62. Pretseille EmmanuelleRahabi Mouna ChirineMaster MABS 2011-2012Diagnostic moléculaire des MOPublication n°6Determination of Escherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction : application to the O types involved in human septicemia Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. N°57 (2007)

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