Pretseille EmmanuelleMaster 1 MABSUE EM7BMGEM - Méthodesexpérimentales et publication scientifique              Interactio...
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Étude de la cassette « Saccharose »  État de lart     3356           3357                 3358                 3359       ...
Étude de la cassette « Saccharose »  État de lart     3356           3357                 3358                 3359       ...
Cassette « Saccharose »                                                                               1      Complémentati...
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Cassette « Saccharose »    - « Description » dune souche utilisée                          Xcc WT pl 750 prom 3358       X...
Cassette « Saccharose »    - « Description » dune souche utilisée                             Xcc WT pl 750 prom 3358     ...
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Plan de la présentation- Introduction- Objectifs des expérimentations- Étude de la cassette « Saccharose »          - Comp...
Discussions    Cassette « Saccharose »                                                         Utilisation du             ...
Discussions    Cassette « Saccharose »                                                          Utilisation du            ...
DiscussionsTransporteur  saccharose     (TBDR)  Interaction                                                               ...
Discussions    Locus Xcc0117-0122Bilan des expérimentations :    - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de ...
Discussions    Locus Xcc0117-0122Bilan des expérimentations :    - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de ...
Discussions    Gène Xcc3534Bilan des expérimentations :    - Construction dun mutant dinsertion dans Xcc3534 par conjugais...
Discussions    Gène Xcc3534Bilan des expérimentations :    - Construction dun mutant dinsertion dans Xcc3534 par conjugais...
Bilan   Caractérisation en cours de trois loci CUT probablesLocus sux           Locus pectine          Locus cellulose
Bilan    Caractérisation en cours de trois loci CUT probablesLocus sux            Locus pectine          Locus cellulose L...
Bilan    Caractérisation en cours de trois loci CUT probablesLocus sux                 Locus pectine             Locus cel...
Remerciements   Mes remerciements sadressent à :- lensemble des professeurs de cette unité denseignement, MartineLautier, ...
Références bibliographiquesBlanvillain S (2007) Etude des récepteurs TonB-dépendants et dun nouvel effecteur de type IIIde...
Références des illustrations                             (Classées selon leur ordre dapparition)- http://vegetablemdonline...
Pretseille EmmanuelleMaster 1 MABSUE EM7BMGEM - Méthodesexpérimentales et publication scientifique              Interactio...
Annexe 1 : Conjugaison triparentale  2 Transfert par conjugaison du promoteur du gène Xcc0119  3 Construction dun mutant d...
Conjugaison triparentale       Culture des souches                                   Culture sur milieu Moka (milieu riche...
3      Annexe 2 : PCR sur colonies chez Xanthomonas                                4Référence : Chez E. coli, suspension d...
http://www.sesep.uvsq.fr/formation/PCR4.jpg   PCR sur XccVitesse GoTaq :    1 min/ kb                  Schéma bilan de la ...
Annexe 3 : Analyse de gel délectrophorèse3 Electrophorèse sur gel dagarose des PCRs réalisées sur Xcc WT  pl750 et Xcc pl ...
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Oral Méthode Expérimentale Loci CUT

  1. 1. Pretseille EmmanuelleMaster 1 MABSUE EM7BMGEM - Méthodesexpérimentales et publication scientifique Interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoirpathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire, Xanthomonas campestris pv campestris
  2. 2. Plan de la présentation- Introduction- Objectifs des expérimentations- Étude de la cassette « Saccharose » - Complémentation de fonction dun mutant sur Xcc3359 - Test dactivité GUS de mutants sur les gènes du locus sux - Caractérisation dun régulateur, Xcc3356- Discussions- Bilan Les symboles suivants indiquent les TPs- Remerciements correspondant aux différentes parties présentées :- Références 1 2 3 4
  3. 3. Introduction Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène, Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) Xcc & facteurs de pathogénicité 1- Bacilles Gram -- Membres des γprotéobactéries- Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées- Bactérie à croissance lente 1 Colonies de Xcc sur milieu solide riche [Adapté de Blanvillain (2007)]
  4. 4. Introduction Pore de la feuille Phase de pénétration dans la feuille Vie à la surface des feuilles Dégradation de la paroi végétale Libération des composants de la paroi (pectine, cellulose …) et du saccharose (sucre majeur chez les végétaux). Cycle de vie de la bactérie Xcc [Adapté de Boulanger (2007)]
  5. 5. Introduction Sujet des Tps : Étude du pouvoir pathogène chez la bactérie phytopathogène, Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc) Xcc & facteurs de pathogénicité- Bacilles Gram -- Membres des γprotéobactéries- Responsable de la pourriture noire chez les Brassicacées- Bactérie à croissance lente- Étude des récepteurs TonB-dépendants (TBDR) → Colonies de Xcc clusters de gènes impliqués dans le transport et la sur milieu solide richedégradation de molécules végétales [Adapté de Blanvillain (2007)] Loci CUT (carbohydrate utilization containing TBDR)
  6. 6. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Test de croissance 1Construction de mutants 2 Étude dexpression Étude dun régulateur 4 Caractérisation dulocus Xcc3356-3359 Fonctionnement ?
  7. 7. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Pectine 2 Test de croissance 1 Conjugaison triparentaleConstruction de mutants 2 Étude dun promoteur 3 Étude dexpression 4 Étude dun régulateur 4 Caractérisation du Caractérisation dulocus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 Fonctionnement ? Induction de Xcc0119?
  8. 8. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Pectine Cellulose 2 Test de croissance 1 Conjugaison triparentale Construction de mutants 3Construction de mutants 2 Étude dun promoteur 3 Conjugaison triparentale 4 Étude dexpression 4 Étude dun régulateur 4 Caractérisation du Caractérisation du Caractérisationlocus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 du gène Xcc3534 Fonctionnement ? Induction de Xcc0119? Lien avec un locus CUT ?
  9. 9. Objectifs des expérimentations Différentes molécules végétales Saccharose Pectine Cellulose Test de croissance 1 Conjugaison triparentale Construction de mutantsConstruction de mutants 2 Étude dun promoteur Conjugaison triparentale Étude dexpression Étude dun régulateur 4 Caractérisation du Caractérisation du Caractérisationlocus Xcc3356-3359 locus Xcc0117-0122 du gène Xcc3534 Fonctionnement ? Induction de Xcc0119? Lien avec un locus CUT?
  10. 10. Plan de la présentation- Introduction- Objectifs des expérimentations- Étude de la cassette « Saccharose » - Complémentation de fonction dun mutant sur Xcc3359 - Test dactivité GUS de mutants sur les gènes du locus sux - Caractérisation dun régulateur, Xcc3356- Discussions- Bilan Les symboles suivants indiquent les TPs- Remerciements correspondants aux différentes parties présentées :- Références 1 2 3 4
  11. 11. Étude de la cassette « Saccharose » État de lart 3356 3357 3358 3359 Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)]- Xcc3356, régulateur de la famille LacI- Xcc3357, transporteur de la membrane interne- Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe)- Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase) Opéron
  12. 12. Étude de la cassette « Saccharose » État de lart 3356 3357 3358 3359 Cassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)]- Xcc3356, régulateur de la famille LacI- Xcc3357, transporteur de la membrane interne- Xcc3358, TBDR (transporteur de la membrane externe)- Xcc3359, amylosucrase (saccharose hydrolase) Opéron Fonctionnement ?
  13. 13. Cassette « Saccharose » 1 Complémentation de fonction dun mutant sur Xcc3359 Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant dinsertion sur 3359) et Xcc i3359 complémenté
  14. 14. Cassette « Saccharose » Xcc WT Double recombinaison Gène Xcc3359 uidA Gène rapporteur GUS AmpR Zone de recombinaison homologue oriT KanR Plasmide pVO155 Xcc i3359 BleoR Construction des souches mutantes de Xcc: exemple avec Xcc3359 [Extrait de Bottin & all (2011)]
  15. 15. Cassette « Saccharose » 1 Complémentation de fonction dun mutant sur Xcc3359 Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant dinsertion sur 3359) et Xcc i3359 complémenté Résultats : - Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose - Sur MME+saccharose, - Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale; - Xcc i3359 : aucune pousse.
  16. 16. Cassette « Saccharose » 1 Complémentation de fonction dun mutant sur Xcc3359 Principe : Tests de croissance de différentes souches sur boîte MME+glucose et MME+saccharose Souches utilisées : Xcc WT, Xcc i3359 (mutant dinsertion sur 3359) et Xcc i3359 complémenté Résultats : - Pousse identique des 3 souches sur MME+glucose - Sur MME+saccharose, - Xcc WT et Xcc i3359 complémenté : pousse normale; - Xcc i3359 : aucune pousse. Xcc3359 permet la pousse sur milieu saccharose. Xcc3359 → utilisation du saccharose [ locus sux ] Effet du saccharose sur les autres gènes du locus ?
  17. 17. Cassette « Saccharose » 2 Test dactivité GUS de mutants sur les gènes du locus sux Principe : Tester lactivité des promoteurs de différents gènes du locus sux chez des mutants dinsertion par dosage de lactivité GUS
  18. 18. Cassette « Saccharose » 2 - Mutant dinsertion et GUS Région promotrice Gène GUS Partie terminale de Xcc335* de Xcc335* Dosage GUS et évaluation de lactivité dun promoteur
  19. 19. Cassette « Saccharose » 2 - Mutant dinsertion et GUS Région promotrice Gène GUS Partie terminale de Xcc335* de Xcc335* - Réaction en jeu : H 2O PNPG + GUS Galactose + p-nitrophenol 37°C - Calcul de lactivité Activité GUS = (DO415nm – 1,75*DO550nm) / (DO600nm*0,001*Volume(mL)*tps de réaction) Dosage GUS et évaluation de lactivité dun promoteur
  20. 20. Cassette « Saccharose » 2 Test dactivité GUS de mutants sur les gènes du locus sux Principe : Tester lactivité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez des mutants dinsertion par dosage de lactivité GUS Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359. Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose Résultats :
  21. 21. Cassette « Saccharose » 2 16 Act. GUS (Sac)/Act. GUS(Glu) 14 * 14 12 10 8 6 4 2 * 2,2 ~1 ~1 0 i3356 i3357 i3358 i3359 Histogramme des rapports « activité GUS (Saccharose) / activité GUS (Glucose) » selon la souche mutante Xcc i335* considérée
  22. 22. Cassette « Saccharose » 2 Test dactivité GUS de mutants sur les gènes du locus Sux Principe : Tester lactivité du promoteur de différents gènes du locus Sux chez des mutants dinsertion par dosage de lactivité GUS Souches utilisées : Xcc i3356, Xcc i3357, Xcc i3358 et Xcc i3359. Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharose Résultats : - Xcc i3356 et Xcc i3357 avec activité similaire dans les 2 conditions. - Activité GUS +++ pour Xcc i3358 et Xcc i3359 en milieu saccharose. Lexpression de Xcc3358 et Xcc3359 est induite par le saccharose. Réponse à un signal végétal ? Opéron Xcc3358-59 → rôle majeur dans la pathogénicité Mécanisme de régulation ?
  23. 23. Cassette « Saccharose » 4 Caractérisation dun régulateur, Xcc3356Principe : Détermination de lactivité dun régulateur via dosage de lactivité bêta-galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats différents.Milieux de culture : MME+glucose & MME+saccharoseSouches utilisées: Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358
  24. 24. Cassette « Saccharose » - « Description » dune souche utilisée Xcc WT pl 750 prom 3358 Xcc sauvage Promoteur contrôlant Plasmide pCZ750 LacZ dans la avec le gène LacZ codant construction obtenue pour la βGal Dosage de la bêta galactosidase dans létude dexpression de gènes
  25. 25. Cassette « Saccharose » - « Description » dune souche utilisée Xcc WT pl 750 prom 3358 Xcc sauvage Promoteur contrôlant Plasmide pCZ750 LacZ dans la avec le gène LacZ codant construction obtenue pour la βGal - Réaction en jeu 4 H2O ONPG + βGal Galactose + ONP 28°C - Calcul de lactivitéActivité(Unité Miller) = [(DO420nm-1,75*DO550)*1000]/[DO600*temps (min)*vol(mL)] Dosage de la bêta galactosidase dans létude dexpression de gènes
  26. 26. Cassette « Saccharose » 4 Caractérisation dun régulateur, Xcc3356Principe : Détermination de lactivité dun régulateur via dosage de lactivité bêta- galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats différents..Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharoseSouches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358Résultats:
  27. 27. Cassette « Saccharose » 4 14000 ~ 11000 12000 Milieu Saccharose Activité βGal (en unité Miller) 10000 Milieu Glucose 8000 6000 4000 Histogramme des activités 2000 < 1000 βgalactosidase selon le milieu de culture et 0 la souche testée Xcc WT Xcc i3356
  28. 28. Cassette « Saccharose » 4 Caractérisation dun régulateur, Xcc3356Principe : Détermination de lactivité dun régulateur via dosage de lactivité bêta- galactosidase chez Xcc sauvage et Xcc mutant en présence de substrats différents.Milieux de culture : MME+glucose et MME+saccharoseSouches utilisées : Xcc WT pl750 prom3358 & Xcc mutant 3356 pl750 prom3358Résultats: - Activité βGal Xcc WT + en milieu Saccharose. - Activité βGal +++ pour Xcc i3356 quelque soit le milieu. Xcc3356 est un répresseur des gènes du locus sux. Rôle de Xcc3357 ? Régulation ? Tests de pathogénicité sur les mutants dinsertion ?
  29. 29. Plan de la présentation- Introduction- Objectifs des expérimentations- Étude de la cassette « Saccharose » - Complémentation de fonction dun mutant sur Xcc3359 - Test dactivité GUS de mutants sur les gènes du locus sux - Caractérisation dun régulateur, Xcc3356- Discussions- Bilan- Remerciements- Références
  30. 30. Discussions Cassette « Saccharose » Utilisation du Répresseur saccharose par Xcc 3356 3357 3358 3359 InductionCassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)] Saccharose
  31. 31. Discussions Cassette « Saccharose » Utilisation du Répresseur saccharose par Xcc 3356 3357 3358 3359 InductionCassette fonctionnelle dite cassette « Saccharose » [Adapté de Bottin & all (2011)] Saccharose- Perspectives : - Tests de pathogénicité sur plantes - Etude du transport du saccharose par Xcc3357 et Xcc3358 - Phylogénie : origine ? avantage évolutif ? adaptation à lenvironnement ?
  32. 32. DiscussionsTransporteur saccharose (TBDR) Interaction Saccharose =saccharose- substrat de répresseur lenzyme→ induction des gènes Modèle du locus CUT fonctionnel basé sur le locus sux de Xcc [Adapté de Blanvillain & all (2007)]
  33. 33. Discussions Locus Xcc0117-0122Bilan des expérimentations : - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119 - Étude de ce promoteur par dosage de lactivité βGal du mutant et du WT en milieu Glucose et PGA Activité +++ en présence de PGA Induction de lexpression de Xcc0119 en milieu PGA.
  34. 34. Discussions Locus Xcc0117-0122Bilan des expérimentations : - Transfert par conjugaison triparentale du promoteur de Xcc0119 - Étude de ce promoteur par dosage de lactivité βGal du mutant et du WT en milieu Glucose et PGA Activité +++ en présence de PGA Induction de lexpression de Xcc0119 en milieu PGA. 0118 0119 0120 0121 0122 Deoxygluconate TBDR TBDR Pectin Methyl Pectate kinase Esterase Lyase Induction Locus CUT putativement impliqué dans le métabolisme de la pectine chez Xcc PGA [Adapté de Bottin & all (2011)]
  35. 35. Discussions Gène Xcc3534Bilan des expérimentations : - Construction dun mutant dinsertion dans Xcc3534 par conjugaison triparentale et vérification par PCR/ gel délectrophorèse Obtention de mutants.
  36. 36. Discussions Gène Xcc3534Bilan des expérimentations : - Construction dun mutant dinsertion dans Xcc3534 par conjugaison triparentale et vérification par PCR/ gel délectrophorèse Obtention de mutants.Suite des investigations: - Tests de croissance sur milieu Glucose et Cellulose du mutant dinsertion dans Xcc3534 - Analyse fonctionnelle des gènes voisins de Xcc3534 CorA cycA 3354 3355 (hyp) pheC Transporteurs Transporteur de Enzymes du catabolisme membranaires la membrane de la cellulose externe Gènes voisins de Xcc3354 : un locus hypothétique dédié à la cellulose
  37. 37. Bilan Caractérisation en cours de trois loci CUT probablesLocus sux Locus pectine Locus cellulose
  38. 38. Bilan Caractérisation en cours de trois loci CUT probablesLocus sux Locus pectine Locus cellulose Lien entre TBDRs et lutilisation des molécules végétales par Xcc
  39. 39. Bilan Caractérisation en cours de trois loci CUT probablesLocus sux Locus pectine Locus cellulose Lien entre TBDRs et lutilisation des molécules végétales par Xcc - Meilleure compréhension de ladaptation plantes/MO - Moyen de lutte contre les bactéries phytopathogènes - Applications industrielles (clarification des jus de fruits, biocarburant ...)
  40. 40. Remerciements Mes remerciements sadressent à :- lensemble des professeurs de cette unité denseignement, MartineLautier, Arnaud Bottin, Christophe Jacquet et Elisabeth Crosnier ;- à mes camarades du parcours alternatif en particulier à ma binôme,Anne-Laure Brasset;- aux préparateurs/préparatrices des salles où nos travaux pratiquesont eu lieu.
  41. 41. Références bibliographiquesBlanvillain S (2007) Etude des récepteurs TonB-dépendants et dun nouvel effecteur de type IIIde la bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris pv. campestris. Doctorat demicrobiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse.Blanvillain S, Meyer D, Boulanger A, Lautier M, Guynet C, Denancé N, Vasse J, Lauber E &Arlat M (2007) Plant Carbohydrate Scavenging through TonB-Dependent Receptors: AFeature Shared by Phytopathogenic and Aquatic Bacteria. PLoS One. 2(2):e244.Bottin A, Lautier M & Jacquet C (2011) Méthodes expérimentales et publication scientifique :interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène, régulation transcriptionnelle. MasterMABS - UE EM7BMGEM. Université Paul Sabatier. Toulouse.Boulanger A (2007) Analyse dun nouveau système CUT impliqué dans lacquisition etlutilisation du N-acétylglucosamine par Xanthomonas campestris pathovar campestris.Doctorat de microbiologie. Université Paul Sabatier. Toulouse.Brasset AL (2011) Analysis of the pathogenicity and transcriptional regulation of the pathogenXanthomonas campestris pv. campestris. Master MABS. Université Paul Sabatier. Toulouse.NCBI (2011) Fiche Gene XCC3534 1,4-beta-cellobiosidase (ID: 1000107)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1000107
  42. 42. Références des illustrations (Classées selon leur ordre dapparition)- http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Crucifers/BlackRot_Cruc/BR_CrucFS4.jpg- http://www.omafra.gov.on.ca/IPM/images/brassica/diseases/black-rot-cabbage_zoom.jpg
  43. 43. Pretseille EmmanuelleMaster 1 MABSUE EM7BMGEM - Méthodesexpérimentales et publication scientifique Interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoirpathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire, Xanthomonas campestris pv campestris
  44. 44. Annexe 1 : Conjugaison triparentale 2 Transfert par conjugaison du promoteur du gène Xcc0119 3 Construction dun mutant dinsertion dans le gène Xcc3534 Présentation des souches Bactérie donneuse Bactérie cible E. coli avec pVO 155 + 300b de Xcc 3534 Xcc WT (Kan R) (Rif R) Souche « helper »Plasmide vecteur E. coli avec Bactérie PRK 600 non transformable (Spectinomycine R)Plasmide « helper »
  45. 45. Conjugaison triparentale Culture des souches Culture sur milieu Moka (milieu riche) Transfert du vecteur « helper » dans la souche donneuse puis Culture sur milieu Moka et ATB : conjugaison vers Xcc Rifampicine et Kanamycine Xcc avec pVO 155 + 300b de Xcc3534 (Rif R et Kan R) Sélection des clones Rif R et Kan R Xcc i3534
  46. 46. 3 Annexe 2 : PCR sur colonies chez Xanthomonas 4Référence : Chez E. coli, suspension dune colonie dans de leau stérile puis ajout du mix PCR. Non applicable chez Xanthomonas ! Adaptation du protocole - Mise en suspension dune colonie dans le leau stérile - Lyse des bactéries ! Tampon de lyse au PEG Obtention dun « jus Xcc » (ADN) - Mix PCR (eau, tampon vert, dNTPs, Taq pol, oligo 1 et oligo 2) - Cycle/Programme PCR - Révélation taille du fragment obtenu → électrophorèse sur gel
  47. 47. http://www.sesep.uvsq.fr/formation/PCR4.jpg PCR sur XccVitesse GoTaq : 1 min/ kb Schéma bilan de la PCR
  48. 48. Annexe 3 : Analyse de gel délectrophorèse3 Electrophorèse sur gel dagarose des PCRs réalisées sur Xcc WT pl750 et Xcc pl 750 + prom 1194 Electrophorèse sur gel dagarose des PCRs réalisées sur Xcc WT pVO155 et Xcc pVO155 + Xcc3534 (= mutant dinsertion) DNA Clones testés ladder (en pb) 10000 8000 6000 Fragment dintérêt à 1kb 5000 4000 3000 2500 PCR ayant amplifiée le promoteur du 2000 gène Xcc0119 de 1kb 1500 → taille correspondante 1000 750 500 Validation des clones obtenus
  49. 49. Pretseille EmmanuelleMaster 1 MABSUE EM7BMGEM - Méthodesexpérimentales et publication scientifique Interactions plantes-microorganismes, pouvoir pathogène et régulation transcriptionnelle Caractérisation de loci CUT impliqués dans le pouvoirpathogène de la bactérie responsable de la pourriture noire, Xanthomonas campestris pv campestris

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