1) O documento descreve o procedimento para contagem de células de levedura usando uma câmara de Neubauer, que consiste em uma lâmina dividida em quadrantes de medidas conhecidas. 2) As células são contadas nos diferentes quadrantes dependendo do tamanho, e o número total é usado para calcular a concentração de células por centímetro cúbico. 3) O texto fornece instruções detalhadas sobre como preparar a amostra, contar as células viáveis e não viáveis, e calcular a vi

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unesp
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO
Aula Prática 5: Contagem de células de leveduras em câmara de Neubauer
Uma das formas mais comuns de se determinar a viabilidade de células de levedura é através do uso
da câmara de Neubauer, também conhecida como hemacitômetro.
A câmara de Neubauer consiste de uma lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâmina
normal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se ao microscópio,
percebe-se que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, que juntos formam um
quadrado maior.
Pode-se notar que estes quadrantes têm sub-divisões diferentes, fazendo com que o critério para
escolha do quadrante onde serão contados as células, seja o tamanho dos células a serem
quantificados. Assim, usualmente, células muito pequenas são contados no quadrante C, as de
tamanho intermediário no quadrante B, enquanto células grandes são contados no quadrante A.
A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C)
são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamínula (especial para ser usada na câmara de
Neubauer) a distância da lamínula até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter
um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante.
A técnica de coloração consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra),
adequadamente diluída, e da solução corante (azul de metileno ou eritrosina). As células com alta
atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-ão
coloridas de azul (azul de metileno) ou rosa (eritrosina). A porcentagem ou o número de células
viáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a câmara de
Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1 mm 2 de área;

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a lâmina é coberta com uma lamínula,que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10 -4 cm3 ou
0,1 mm3 .
0.1 mm3 – 0.0001 cm3 – 0.0001 mL ou 10-4 mL
Procedimento
1- Transferir 1 mL para um tubo de ensaio e adicionar 1 mL da solução de eritrosina.
3- Agitar a mistura.
4- Colocar a lamínula na Câmara de Neubauer e com auxílio da pipeta Pasteur,coleta-se uma
pequena alíquota da suspensão preparada e deposita-se em um dos canais laterais ao campo central,
a amostra, até que todos os canais interligados estejam completos.
5- Levar ao microscópio óptico e com a objetiva de 40X, fazer a contagem das células nos campos :
6- Escolher o quadrante que irá contar as células.
6- Marcar o número de células viáveis (células que não se colorem com eritrosina) e células
inviáveis (rosa).
Como proceder a contagem:
Regras de contagem:
1) Conte as células usando o quadrado grande do centro.
2) Conte as células dos quadrados médios e as células que estiverem tocando as linhas
superiores e as linhas à direita.
3) Conte cerca de 200 à 250 células antes de determinar o número/cm3
No quadrante C - contar o número de células em 5 sub-quadrantes (c) de C, os 4 dos cantos e
o sub-quadrante central.
Exemplo: 210 células em 5 quadrados médios (cada um medindo 0,2 x 0,2 mm). Quantas células há
por cm3?
210/5 = 42 células/quadrado médio
42 x 25 = 1050 em 0,1 mm3
1050 x 104 = 10.500.000 ou 1,05 x 107 cels/cm3
% de viabilidade= (células vivas x 100)/ (células vivas + células mortas)
% de brotamento = (brotos x 100)/ (vivas+mortas)
% de viabilidade dos brotos = (brotos x 100)/ (brotos vivos + brotos mortos)