Guía técnica - Diagnósticos y enfermedades de camarones

GUÍA TÉCNICA

PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
DE CAMARONES PENAEIDOS
PROGRAMA CYTED
ÁREA DE AGROALIMENTACIÓN
RED II-D: Red Vannamei
Editores:
Vielka Morales Q.
Jorge Cuéllar-Anjel
Autores:
María José Almanza Abud
Margherita Anna Barracco
Donald V. Lightner
Emiko Shinozaki Mendes
Alitiene Moura Lemos Pereira
María Soledad Morales Covarrubias
Carlos Pantoja
Luciane María Perazzolo
Rafael Diego Rosa
Agnés Saborio Coze
Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

La presentación y disposición en conjunto de:
GUÍA TÉCNICA - PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE
CAMARONES PENAEIDOS
son propiedad de los editores. Ninguna parte de esta obra
puede ser reproducida o transmitida, mediante ningún
sistema o método, electrónico o mecánico (incluyendo
fotocopiado, la grabación o cualquier sistema de recuperación
y almacenamiento de información), sin consentimiento por
escrito de los editores.
Derechos reservados:
© 2008 Vielka Morales Q. y Jorge Cuéllar-Anjel
(507) 6671-8936
(507) 6616-0756
email: vielkamorales2003@yahoo.com
email: jocuan@gmail.com
Panamá
Primera edición en español
Hecho en Panamá
ISBN: 978-9962-661-02-3
Esta obra se citará de la siguiente manera:
Todo el libro:
Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2008. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones
Penaeidos. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp.
Ejemplo para citar un capítulo:
Pantoja, C. y D.V. Lightner. 2008. Enfermedades virales pp. 55-114. En: Morales, V. y J. CuéllarAnjel (eds.). 2008. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa
CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp.

Diseño e impresión:
New Concept Publications, Inc.
(507) 226-7694
Panamá
Daniel Ho - Fotografías de portada, contraportada, páginas 1, 55, 117, 135, 159, 169, 225, 243 y 254

ii

AGRADECIMIENTOS

Los editores agradecen la colaboración de Reinaldo Morales y Hugo Pérez
Athanasiadis, por la traducción preliminar del portugués al español, de varios capítulos
del libro, así como a Roberto Chamorro (Licencia de intérprete público autorizado del
Ministerio de Gobierno y Justicia de Panamá, Resolución Nº 28, de 8 de marzo de 1984)
por la revisión y perfeccionamiento de los documentos traducidos.
De igual manera por la revisión y aportes de la Dra. Patricia Del Portillo (Métodos
Moleculares), Dra. Margherita Barracco (Parámetros Inmunológicos), Dr. Carlos Pantoja
y Kenneth W. Hasson (Parásitos en Camarones), Ing. Roberto Chamorro y Dra. María del
Pilar Moyano (Métodos de Diagnósticos) y Oscar Olivares (glosario y correcciones de
texto).

iii


IN MEMORIAM
ELPIDIO BELTRAME, el hombre incansable y luchador por la camaronicultura en
la región, hoy no se encuentra con nosotros, no obstante, su recuerdo permanecerá por
siempre en el corazón de todos los que tuvimos la suerte de trabajar a su lado.
El Grupo Técnico Asesor (GTA) de la Red Vannamei del CYTED y los autores de esta
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, deseamos dedicarla
a nuestro amigo, hermano y compañero, ELPIDIO. El fue uno de nuestros pilares en el
GTA de la Red Vannamei, con aportes de grandes ideas y colaboración desinteresada para
sino también en el resto de los países iberoamericanos que conforman esta importante
familia CYTED.
Gracias por tu contribución a una actividad que seguirá dando respuestas en la
generación de empleos y divisas a diferentes países de iberoamerica.

iv

PRÓLOGO

La camaronicultura tiene sus inicios en la década del ‘60 incrementándose
rápidamente en la del ‘70, surgiendo como una de las fuentes de mayores ingresos de
divisas por sus elevadas producciones. En la actualidad y según estudios de la FAO, aún
especies del género Penaeus (también llamado Litopenaeus).
a enfermedades que se reportaron desde la aparición del Taura en los años 93-94 y
el Síndrome de la Mancha blanca en los años 98-99, afectando grandemente las
producciones y dando como resultado el cierre de muchas empresas, pérdidas de
empleos y por ende de ingresos.
La industria ha tenido que ir implementando innovaciones tecnológicas y
mejoramiento en el manejo de los cultivos de camarón, observándose una lenta
recuperación en sus producciones y en la productividad.
Sin embargo, con la expansión territorial de esta actividad y el desarrollo de técnicas
situación actual en los temas de enfermedades, haya querido compartir sus conocimientos
y experiencias de muchos años, a través de esta importante Guía Técnica de Patología e
Inmunología de Camarones Penaeidos, diseñada para productores, técnicos, estudiantes
una herramienta útil y práctica en su actividad diaria.
Como regente de un sector que vela por el desarrollo de las actividades acuícolas
en la República de Panamá, nos sentimos honrados de poder expresar la importancia de
en Iberoamérica.

GUILLERMO A. SALAZAR N.

Ministro de Desarrollo Agropecuario
Panamá, 2008

v


vi

INTRODUCCIÓN

El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED)
ámbito iberoamericano y carácter horizontal.
En el marco del CYTED, hay una serie de acciones dentro de las cuales se encuentran
las Redes Temáticas, que son asociaciones de grupos de I+D pertenecientes a entidades
públicas o privadas de al menos seis países miembros del Programa y cuyas actividades
En este caso en particular, la Red denominada FORO PARA LA GESTIÓN DE
CONOCIMIENTOS Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍAS SOBRE EL CULTIVO DE
PENAEUS VANNAMEI: RED VANNAMEI
de la industria camaronera de los países iberoamericanos que se dedican a la actividad.
Entre los objetivos logrados por la Red, están las siguientes: constitución de un foro
regional de convergencia para los grupos de investigación, productores y sector estatal;
fomento de la investigación interdisciplinaria que coadyuva al desarrollo tecnológico
en temas relativos al L. vannamei; la promoción en el intercambio de información
el establecimiento de un sistema de información electrónico de divulgación periódica,
el cual facilitó la transferencia de conocimientos; organización de actividades de
de investigación; la ayuda a la consolidación de grupos de investigación y desarrollo, lo
mismo que la interacción con los diferentes grupos, a través de redes o foros nacionales
y miembros del sector productivo, quienes participaron en las actividades que coordinó
la red.
Entre los temas de mayor énfasis durante el desarrollo de las actividades de la
red, están los relacionados con la genética, buenas prácticas de manejo y, patología e
la red: www.mida.gob.pa/CYTEDVANNAMEI.
Como última actividad de la red, estuvo la realización de un curso teórico-práctico
internacional sobre la patología e inmunología del camarón L. vannamei, donde
para el cierre de la red, los facilitadotes del curso acordaron contribuir con el desarrollo
de cada capítulo a ellos asignados para la publicación de esta guía, la cual servirá de
herramienta básica para estudiantes, empresas y entidades estatales que se dedican a la
camaronicultura. Este compromiso desinteresado de parte de cada uno de ellos, es uno
de los mejores aportes que quedará plasmado en las acciones que vienen desarrollándose
la coordinación de la Red Vannamei. A los autores, amigos y compañeros les extendemos
un cordial agradecimiento por toda su colaboración.
VIELKA MORALES Q.
Coordinadora Red Vannamei

vii


viii

ÍNDICE DE CONTENIDO
Prólogo

v

Introducción

vii

Reseñas de los editores y autores

xi

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de
Cultivo (Jorge Cuéllar-Anjel)

1

1.1

Anamnesis

2

1.2

Examen clínico

2

1.3

Microscopía Directa

5

1.4

Montajes en Fresco (María Soledad Morales-Covarrubias)

8

1.5

Bacteriología

18

1.6

Histología

22

1.7

Pruebas con anticuerpos

29

1.8

Métodos moleculares

31

1.9

Capítulo 1

Parámetros inmunológicos

39

1.10

Microscopía electrónica de transmisión

45

1.11

Bioensayos

47

1.12
Capítulo 2

52
Enfermedades Virales (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner)

55

2.1

Principales enfermedades y métodos de diagnóstico

58

2.2

Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (Infectious
hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV)

62

2.3

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus,
WSSV)

70

2.4

Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV)

79

2.5

Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus,
YHV)

87

2.6

Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV)

92

2.7

Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los
cultivos de camarones brasileños (Alitiene Moura Lemos Pereira,
Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira)

96

2.8

Penaeus vannamei nodavirus (PvNV)

104

2.9
Capítulo 3

106
Enfermedades Bacterianas (María Soledad Morales-Covarrubias)

117

3.1

Vibriosis sistémica

120

3.2

Erosión bacteriana del caparazón

122

3.3

Síndrome de Zoea II

124

ix


3.4

Enfermedad de luminiscencia

126

3.5

(NHP-B) Necrosis del hepatopáncreas bacteriana

126

3.6
3.7

130
Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner)

3.8
Capítulo 4

131
134

Enfermedades por Parásitos (Jorge Cuéllar-Anjel)

135

4.1

Gregarinas

137

4.2

Microsporidios

142

4.3

Haplosporidios

147

4.4

Epicomensales

148

4.5

Metazoarios

154

4.6
Capítulo 5

156
Enfermedades causadas por hongos (Carlos R. Pantoja y Donald Lightner)

159

5.1

Micosis

161

5.2

Fusariosis

164

5.3
Capítulo 6

167
Inmunología del Camarón (Margherita Anna Barracco, Luciane María
Perazzolo y Rafael Diego Rosa)

169

6.1

Sistema Inmune de los Crustáceos

172

6.2

Inmunoestimulantes

202

6.3

Parametros hemato-inmunológicos como indicadores de salud

204

6.4

Conclusiones y Perspectivas

209

6.5
Capítulo 7

211
Buenas Prácticas De Manejo En La Camaronicultura (Agnés Saborío Coze
y María José Almanza)

225

7.1

Código de Conducta para una camaronicultura responsable

229

7.2

Objetivos de un Código de conducta

229

7.3

Buenas Prácticas de Manejo

230

7.4

Características de las Buenas Prácticas de Manejo

230

7.5

Buenas Prácticas de Manejo en Laboratorios de larvas

231

7.6

Buenas Prácticas de Manejo en granjas camaroneras

231

7.7

Buenas Prácticas de Manejo en plantas procesadoras

241

Glosario

243

7.8

x

242

RESEÑAS DE LOS EDITORES
VIELKA MORALES Q.
Coordinadora Red Vannamei-CYTED
vielkamorales2003@yahoo.com
Licenciada en Biología. Experiencia de 14 años en el tema de larvicultura, maduración,

técnica de la Organización del Sector Pesquero y Acuícola de Centroamérica. Consultora
para FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con 19 publicaciones (11 en temas de camarones). Ha
participado en otras redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos.

JORGE CUÉLLAR-ANJEL
Director del Departamento de Patología e Investigación
Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO)
Aguadulce, Coclé, República de Panamá
jocuan@usa.net
Médico Veterinario, Máster en Microbiología. Experiencia de 18 años en las áreas de cultivo
de camarón marino Litopenaeus vannamei; diseño y montaje de laboratorios de patología de
camarones (microbiología, histopatología y biología molecular); docencia universitaria en
pregrados y postgrados así como investigación aplicada en Producción, Patología, Inmunología
y Nutrición de camarones penaeidos; manejo sanitario de cultivos de camarón (larvicultura,
engorde y maduración) mediante clínica y pruebas de campo y de laboratorio (montajes en fresco,
microbiología, histopatología y biología molecular); conferencista en Congresos Internacionales;
miembro del Grupo Ad hoc de la OIE en crustáceos para las Américas. Ha tenido desempeño
laboral en Ecuador, Colombia y Panamá.

RESEÑA DE LOS AUTORES
MARÍA SOLEDAD MORALES COVARRUBIAS
Centro de Investigaciones en Alimentación y Desarrollo, A.C.
Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
México,
marisol@ciad.mx
Maestría y Doctorado en Patología de crustáceos, Licenciatura en Biología Pesquera
Investigadora en el área de acuicultura y manejo ambiental del CIAD. Sus principales trabajos
cursos en sanidad acuícola y colabora en un programa de transferencia tecnológica, capacitación
y consultoría en histopatología de crustáceos, con diferentes países de América Latina.

JORGE CUÉLLAR-ANJEL
Aguadulce, Coclé, República de Panamá
jocuan@usa.net
La reseña de este autor ha sido citada previamente en “Reseña de los Editores”
xi


AGNÉS SABORIO COZE
Universidad Centroamericana (UCA)
Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos
Managua, Nicaragua.
cideauca@gmail.com
la Global Alliance Aquaculture para plantas de proceso, granjas de acuicultura y laboratorios.

en temas relacionados a la zonas costeras. Elaboración y gestión de proyectos acuícolas.
Asistencia Técnica, capacitación y extensión a comunidades costeras. Docente universitaria.
Consultora. Relaciones de trabajo con cooperantes de USA, JICA, UE, Universidades y Centros
de Investigación como Universidad de Rhode Island, Universidad de Florida, Universidad de
como ACRA, GVC, OIKOS entre otras, las Naciones Unidas (FAO) y el Banco de Desarrollo
Interamericano. Coordinadora de Redes Internacionales. Directora de Acuicultura. Directora de
Centro de Investigación.

MARÍA JOSÉ ALMANZA ABUD
Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos
Universidad Centroamericana (UCA)
Managua, Nicaragua
almanzaabud@gmail.com
Máster en Ciencias Ambientales, Licenciada en Ecología y Recursos Naturales, curso de

la Universidad Hawai Hilo. Responsable del área de Físico-química de agua del Laboratorio
divulgación y Coordinador de Investigaciones del CIDEA.

CARLOS PANTOJA
Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología
Universidad de Arizona
Tucson, Estados Unidos
cpantoja@u.arizona.edu
Ingeniero Bioquímico en Explotación de Recursos Acuáticos (Tec de Monterrey, Campus
Guaymas, México). Maestría en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México).
Doctorado en Patobiología (The University of Arizona). Actualmente es profesor investigador
asociado en el laboratorio de patología acuícola de la Universidad de Arizona. Principales
áreas de trabajo son patología morfológica, caracterización de nuevas enfermedades y agentes
infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de métodos de detección de agentes infecciosos y
diagnóstico de enfermedades. Provee servicios de consultoría a la industria camaronícola en el
área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través
de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

xii

DONALD V. LIGHTNER
Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología
Universidad de Arizona
Tucson, Estados Unidos
dvl@u.arizona.edu
PhD en Patología y Biología Pesquera, Maestría en Biología Pesquera y su Licenciatura en
Biología Pesquera. Su experiencia está dirigida a la patología y enfermedades de los cultivos
de crustáceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedades
infecciosas, virología, histología, microscopio electrónico, desarrollo de métodos de diagnósticos,
nutrición de animales acuáticos y toxicología acuática. Provee servicios de consultoría a la industria
camaronicola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de
enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

MARGHERITA ANNA BARRACCO
Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC),
Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG),
Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA),
Florianópolis, SC, Brasil
barracco@mbox1.ufsc.br
Doctorado en Inmunologia de Invertebrados y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Profesora
Titular de Biología Celular, con participación en los programas de Postgrado en Acuicultura y
Biotecnología. Investigadora en el área de inmunología de crustáceos y moluscos de interés para
la acuicultura, con implicaciones en la sanidad y en el monitoreo ambiental. Sus principales
trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a infecciones,
el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de condiciones de salud y
el efecto de sustancias inmunoestimulantes en invertebrados acuáticos, con énfasis en camarones
y bivalvos marinos.

LUCIANE MARÍA PERAZZOLO
Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA),
luciane@ccb.ufsc.br
Maestría en Inmulogía de Crustáceos y Doctorado en Vitelogénesis de Peces. Profesora
Asociada de Biología Celular, con participación en el programa de Postgrado en Acuicultura.
Investigadora en el área de inmunologia de crustáceos de interés para la acuicultura, con
implicaciones en la sanidad. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el
estudio de la respuesta inmunológica a las infecciones, caracterización bioquímica y molecular de
proteínas inmunes efectoras y/o reguladoras, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos
para el monitoreo de las condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en
camarones.

xiii


RAFAEL DIEGO ROSA
Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAA),
rddr@gmail.com
Maestría en Biotecnología aplicada a la acuicultura y Licenciatura en Ciencias Biológicas.
Sus principales trabajos de investigación están enfocados en la inmunología de crustáceos y
moluscos bivalvos, en especial en los péptidos antimicrobianos producidos por estos animales.

ALITIENE MOURA LEMOS PEREIRA
Embrapa Meio-Norte,
Parnaíba, PI, Brasil,
alitiene@cpamn.embrapa.br
Tecnóloga en Acuicultura, con Maestría y Doctorado en Acuicultura. Investigadora de
la Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa). Coordinadora del Núcleo de
Investigación en Pesca y Acuicultura da Embrapa Meio-Norte. Responsable por el Laboratorio
de Patología de Organismos Acuáticos (LAPOAq). Participa de La Red de Investigación en
Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades. Responsable por proyectos en
patología, diagnóstico y monitoreo sanitario de camarones cultivados.

EMIKO SHINOZAKI MENDES
Universidade Fed. Rural de Pernambuco,
Recife, PE, Brasil
esmendes@dmv.ufrpe.br
Médica Veterinaria, con Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Doctorado en
enfermedades tropicales. Profesor Asociado del Departamento de Medicina Veterinária, y en
los programas de pós-grado en Veterinária y de los Recursos Pesqueros y Acuicultura, ambos
de la Universidad Federal Rural de Pernambuco. Responsable por el Laboratorio de la Salud
de los Animales Acuáticos (LASAq) y Coordinadora actual de la Red de la Investigación en
Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades, actuando principalmente en
el área de la microbiología.

TEREZA CRISTINA VASCONCELOS GESTEIRA
Universidade Fed. do Ceará,
LABOMAR, CE, Brasil
cgesteira@labomar.ufc.br
Bióloga con maestría en Zoología por la Universidad Federal de Rio de Janeiro y PhD
en Biología por la Universidad de New Brunswick – Canadá. Trabaja en el área de histología
y en histopatología de camarones peneídos. Realiza investigaciones en el área de patologías
de crustáceos marinos. Es responsable por la cátedra de Patología de Organismos Marinos y
Estuarinos y directora de postgrado a nivel de maestría en el Curso de Ciencias Marinas Tropicales.
Es miembro activo de la World Aquaculture Society (WAS) del Consejo Regional de Biología y de
la Asociación Brasileña de Patología de Organismos Acuáticos (ABRAPOA).Participa de la “Red
de Camarones Marinos del Nordeste” – RECARCINE, subred Enfermedades.

xiv

Capítulo 1

Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en
Camarones Marinos de Cultivo

Capítulo 1
Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones
Marinos de Cultivo
Coclé, Panamá
Introducción
Con base en las principales técnicas utilizadas en la actualidad para determinar
enfermedades en camarones, la siguiente lista presenta los pasos básicos y métodos
que sirven como herramienta para realizar diagnósticos y detectar agentes etiológicos
en estos crustáceos de gran importancia comercial en la economía mundial. Aunque
algunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores en
deben ser hechos por profesionales en sanidad acuícola o por Médicos Veterinarios
especialistas. Se debe recordar siempre que el diagnóstico no consiste en una prueba de
laboratorio como tal, sino en la interpretación que hace el especialista con base en sus
conocimientos y en la información recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio.
serán mencionadas a lo largo del texto para facilitar la lectura de los diferentes temas. A

Pasos para el diagnóstico:

oscuro, con montajes en fresco de tejidos teñidos o sin coloraciones, barridos o
montajes en fresco de tiras fecales)
sedimento y otros organismos acuáticos)

anticuerpos policlonales (PAbs por sus siglas en inglés) o anticuerpos monoclonales
(MAbs por sus siglas en inglés)
-

Sondas de ADN en pruebas de hibridación dot blot directamente con muestras
frescas de tejido o con ADN extraído
in situ con cortes


altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de la
presencia del patógeno

1.1

Anamnesis

diagnóstico de una enfermedad en una población de camarones, debe incluir una visita
Durante esta visita, el técnico debe recopilar la información histórica previa a
instalaciones, presencia de animales foráneos al sistema como perros, aves, roedores o
vacas, alteraciones en el régimen y tipo/calidad del alimento suministrado, cambios en
los procedimientos o tipos de fertilizantes, uso de productos químicos o biológicos en
el cultivo afectado, existencia de brotes similares con anterioridad en dicha empresa o
en otras conocidas y, toda aquella información pasada o presente relacionada directa o
indirectamente con la población en cuestión.
Debe llevarse un registro de esta información obtenida en la empresa, para estudios
de correlación con los hallazgos obtenidos en el examen clínico y en las pruebas de
laboratorio complementarias que se harán luego de la visita de campo.

1.2

Examen clínico

Cuando se trate de un brote de una enfermedad, durante la visita a las instalaciones
deben evaluarse las unidades de producción (tanques o estanques) que presenten
problemas. Se deben realizar capturas de camarones in situ y hacer una revisión individual
de animales, para formarse una idea aproximada de la proporción del problema: qué
tanta población está afectada (prevalencia en %), grado de severidad de las afecciones
observadas en los organismos enfermos y qué tipo de enfermedad puede estar causando
el brote.
los camarones que sean revisados, los cuales no deben ser capturados al azar, sino
seleccionados por presentar alguna manifestación de enfermedad. Con base en los
hallazgos de esta valoración clínica, es factible en algunos casos hacer un diagnóstico

de enfermedades, está afectado por la habilidad de reconocer camarones enfermos
en exámenes generales, la naturaleza del problema presente y por la experiencia del
profesional especialista en sanidad acuícola. Cuando se eligen camarones que presenten
La captura o colección de camarones para realizar un examen que busca determinar
la presencia de enfermedad, debe realizarse procurando el mínimo de estrés durante la
manipulación de los animales.
2


Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

Si el examen clínico debe ser realizado en un lugar diferente al de la captura y los
camarones deben ser transportados hacia otra parte, la movilización debe hacerse en
recipientes con agua del mismo estanque, limpia (sin lodo ni trozos de vegetales), con
adecuada aireación y teniendo una densidad baja (para evitar el estrés). Si los camarones
van a permanecer un período de tiempo en el recipiente antes de ser examinados, deben
tener buena aireación y, en lo posible, se debe bajar la temperatura a 25-27ºC mediante
la adición de bolsas con hielo (selladas).
animales moribundos, descoloridos, con comportamiento anormal o que presenten
otras anormalidades macroscópicas con las cuales se sospeche de una enfermedad. Las
principales observaciones que se deben realizar en camarones enfermos durante una
valoración clínica, son las siguientes:

o estanques, las siguientes son observaciones frecuentes en camarones enfermos:

Cuando se realicen muestreos aleatorios intencionales para estimar la prevalencia
de una enfermedad en una población, los camarones deben ser tomados al azar (no
Pantoja.

3


MÉTODO DE EXAMEN CLÍNICO

de cultivo mediante el uso de una atarraya, para
ser sometidos a un examen clínico.

P. vannamei
sanos, enfermos y muertos observados en un
recipiente de fondo blanco, después de su
captura en un estanque de cultivo. Se observan
algunos camarones muertos sin apéndices
(pereiópodos o pleópodos), debido a que han
sido canibalizados por otros camarones.

P. vannamei que
están siendo observados luego de haber sido
capturados en un estanque de cultivo, durante
caso de estos 5 camarones, no se observan
manifestaciones clínicas de enfermedad.

4


1.3


Microscopía Directa (Análisis en fresco)

contenido gástrico.
Para una evaluación sanitaria con microscopía directa, deben examinarse las
muestras lo más pronto posible después del muestreo y después de la preparación del
montaje en un portaobjetos. Se deben utilizar organismos vivos siempre que sea posible,
o usar muertos frescos que han sido mantenidos en frío (refrigerados o enhielados), o
camarones vivos. Si se puede contar con un laboratorio de campo adecuado, debe usarse
para procesar y examinar las muestras lo más cerca del sitio de muestreo.
Una aplicación importante del método de microscopía, es el examen del contenido
al azar en una población determinada (estanque o tanque). Se extrae cuidadosamente el
estómago luego de hacer una disección del mismo utilizando tijeras y pinzas pequeñas.
Se realiza una incisión por la línea media con las tijeras y se extrae el equivalente a una
gota de contenido gástrico. Se ubica sobre una lámina portaobjetos y se añade una gota
de solución salina. Se coloca luego una lámina cubreobjetos y se hace presión con la
Se observa luego la muestra bajo el microscopio utilizando los objetivos de 4X
zooplancton, sedimento y otros componentes que se observen. Se promedian los
porcentajes estimados en los 10 camarones para cada una de estas observaciones y se
afectando el crecimiento, así como realizar correctivos en la dieta de los animales.
Los detalles relacionados con la técnica de montajes en fresco, son estudiados más

5


MÉTODO DE MICROSCOPÍA
(Montajes en fresco)

P. vannamei bajo
observación durante un examen clínico. Nótese
la presencia de una zona oscura en la parte
media del cefalotórax y superior de las branquias
abdominal puede deberse al tiempo que han
estado fuera del agua (estrés por hipoxia). No
se observan manifestaciones adicionales de
enfermedad.

P. vannamei en el
cual se está levantando la cutícula posterior
del cefalotórax, para extraer muestras del
hepatopáncreas, las branquias y heces del
intestino medio, a partir de las cuales se va a
preparar un montaje en fresco.

de un camarón P. vannamei en donde ya se
han colocado bajo el cubreobjetos muestras de
hepatopáncreas (izquierda) y branquias (centro).
Las heces están siendo extraídas del intestino
medio con la ayuda del borde de unas tijeras.

6



MÉTODOS DE MICROSCOPÍA
(Montajes en fresco)

camarón subadulto P. vannamei preparada
mediante un montaje en fresco. Se observa
gran cantidad de vacuolas lipídicas (reservas de
grasa) de colores amarillo y gris y con tamaños
proceso de melanización (color marrón) de un

una forma alargada siendo más ancho hacia la

P. vannamei preparada mediante un montaje
en fresco. Se observan 2 lamelas branquiales
bifurcadas en su extremo (superior), las cuales
presentan melanización de origen tóxico. Sin

una muestra de heces de un camarón subadulto
P. vannamei. Se observan dos trofozoitos de
gregarina Nematopsis sp., uno de ellos con el
células (centro), respectivamente. Se puede
diferenciar la célula anterior (protomerito) y
la célula posterior (deutomerito). Sin tinción.

7


MÉTODO DE MICROSCOPÍA DIRECTA

partir de heces de una postlarva (pl-10) de P.
vannamei, en la que se observan trofozoitos de
la gregarina Paraophioidina sp. (probablemente
P. scolecoides). Cada trofozoito está compuesto
parásito tiene la particularidad de formar grupos
en los cuales varios organismos se adhieren a

1.4

Montajes en fresco (María Soledad Morales-Covarrubias)

Introducción

de la enfermedad.
Con el diagnóstico aumenta la probabilidad de un control efectivo cuando se
determina la causa exacta y se relaciona con sus factores contribuyentes efectivos. Sin
embargo, debemos aceptar que el conocimiento de la salud y la enfermedad varía en
diferentes animales acuáticos, incluidos los camarones y que en las granjas camaroneras
y laboratorios aparecen nuevas enfermedades. Por tanto, en una situación particular, la
precisión esperada y la calidad de un diagnóstico pueden ser directamente afectadas por
el conocimiento disponible respecto a enfermedades de camarones, por el entrenamiento
y experiencia de la persona encargada de realizar el diagnóstico, así como por las
prácticas de manejo en los sistemas de cultivo.
Uno de los objetivos principales en el diagnóstico de una enfermedad de un animal
etiológicos de la enfermedad se realiza (o debería realizarse) mediante la aplicación de
de camarones (para buscar bacterias, hongos, protozoarios, metazoarios e inclusiones
de rickettsias y virus) a través de microscopía de luz e histopatología (respuesta del
etiológicos, los cuales conllevan a determinar la causa de enfermedades en camarones.
Los agentes patógenos se encuentran en el ambiente en forma natural y el medio
acuático no es la excepción. Muchos de ellos son oportunistas; es decir que mientras
los camarones se encuentren sanos y las condiciones de los parámetros de cultivo no

8



organismos se encuentren enfermos. La gravedad dependerá del nivel de incidencia, de
la prevalencia, tipo de patógeno, de su virulencia, de su patogenicidad, de la especie
cultivada, de la genética de la misma (ciclo cerrado o silvestres) y el nivel de estrés de los
camarones al momento de estar expuestos al patógeno.

donde no existían y que en algunos casos se diseminan a las poblaciones silvestres.
Análisis en fresco
los organismos y realizar diagnósticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en la
disección del camarón en todos sus estadios, para observar las alteraciones y patógenos
que presenten sus órganos y tejidos. La capacitación para este tipo de análisis consta de
un corto entrenamiento básico que profesionales (biólogos, ingenieros en acuicultura,
médicos veterinarios etc.) pueden recibir en una granja o laboratorio.
Para realizar el diagnóstico del estado de salud de una población se requiere de la
selección y toma adecuada de la muestra, la cual es elegida de acuerdo al estado de salud
de los organismos o a la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo
información, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad de
organismos sembrados en el cultivo. Por lo tanto para una buena selección se tiene que
tomar en cuenta lo siguiente:
Muestreo aleatorio. Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o para
buscar la prevalencia de patógenos, se toman los organismos y estanques al azar, lo cual

que de existir una infección, ésta se incluirá en la muestra y para la prevalencia su
aireación, procurando crearles el menor estrés posible y se trasladan de inmediato al
laboratorio para su posterior análisis.
Muestreo no aleatorio
muestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia en el estanque, de alguna
enfermedad o síndrome. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presenten
señales clínicas tales como: decoloración, melanización y necrosis en la cutícula, así
como anorexia (falta de apetito), letargia (reducción de la actividad normal), coloración
rojiza de los pleópodos y telson o cualquier otra alteración que se observe en ellos. Los
organismos con estas características generalmente se encuentran en la compuerta de
Las muestras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo al procedimiento o
procedimientos que se hayan elegido para la detección del agente causal de la enfermedad.
Los organismos deben ser enviados vivos a los laboratorios de diagnóstico.

9


donde se observan las cuatro áreas diferentes
para la toma de organismos en muestreo al
azar.

donde se observa la compuerta de salida para la
toma de organismos en muestreo no aleatorio.

Tabla 1. Selección del tamaño de muestra y cálculo del porcentaje de prevalencia de un patógeno

la población

2%

5%

50

50

100

75

45

250

110

50

10%

500

20

20%
10
11

25

7

50%

5

2

7
7

10

55

10

7

1,000

140

55

27

10

1,500

140

55

27

10

2,000

145

27

10

4,000

145

27

10

10,000

145

27

10

>/= 10,000

10

40%

150

10



Para la realización del análisis en fresco, se requiere contar con espacio limpio en
donde se tenga el siguiente material:
Portaobjetos
Cubreobjetos
Navajas de disección
Pinzas de disección
Cajas de petri
Pizetas
Guantes

Xileno
Contenedores para muestras
Manuales
Desarrollo de la técnica:
Los organismos se miden y pesan para obtener el peso y tamaño promedio.
y en el sexto segmento abdominal, como cutícula delgada (o suave), epicomensales,
decoloración, coloración rojiza, melanización, ampollas y necrosis de cutícula

porciones se colocan individualmente en portaobjetos limpios (no mezclar porciones),
se les adiciona unas gotas de agua de mar estéril y se pone el cubreobjetos; debe
procurarse que en la muestra no se formen burbujas que puedan interferir (para ello
hay que realizar una leve presión sobre el cubreobjetos con la pinza de disección).
Las muestras que se tomarán son:
Branquias:
Se toma una pequeña porción y se coloca en el portaobjetos para buscar: cambios
Zoothamnium
Epistylis sp, Acineta, Ascophris, Bodo
Leucothrix mucor y
Flexibacter sp), detritus del fondo de los estanques, restos de microalgas, hongos,
bacterias, melanizaciones y deformaciones. Para detectar cuerpos de inclusión viral en

11


Hepatopáncreas: se elimina todo el exoesqueleto del cefalotórax para descubrir el
(aumento de tamaño) del órgano. Con unas pinzas, se retira la membrana que cubre

lista para ser analizada.

Zoothamnium sp.

12



el hepatopáncreas y con un bisturí se parte por la mitad para observar la coloración
se coloca en un portaobjetos para buscar: Baculovirus penaei, Monodon baculovirus,
gregarinas (trofozoitos y sicigias), bacterias, deformación tubular, nódulos hemocíticos,

Intestino: el abdomen, se separa del cefalotórax, del telson y de los urópodos para
facilitar la extracción del intestino. Por la parte posterior se localiza el intestino (que
coloca en el portaobjetos, procurando extenderlo. Luego se vierten unas gotas de agua

cuerpos de oclusión de Baculovirus penaei y Monodon baculovirus.
Músculo y gónadas:
(especialmente, aquel tejido que muestre opacidad de tipo lechoso). Se coloca en un
estos órganos y tejidos fueron parasitados se deben observar masas de esporas de tamaño
y forma uniformes.
Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio, iniciando con el objetivo
primera muestra que se analiza es la del hepatopáncreas; después se estudia la muestra

creas expuesto para tomar pequeña porción
para su análisis.

13


adheridas al epitelio y en el lumen del intestino.

observan las cápsulas de Ameson nelsoni.

14



Tabla 2. Formato de reporte para el análisis en fresco.
No ________________________
Procedecia. ____________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_______________

______________________________

No. de muertos._____________

No. de examinados. ________________________________

______________

Peso promedio. __________

________

Actividad de los camarones
Contenido del intestino
Presencia de heces en forma de
cadena o discontinua

coloración

Presencia de epibiontes, bacterias y hongos en el camarón
Deformidades en el rostrum,
antenas abdomen, telson,
urópodos y pleópodos
Apéndices rotos
Melanización (color café claro)

Presencia de gregarinas en
todos sus estadíos

Coloración anormal
Características de la cutícula

Presencia de masa de bacterias y cantidad de lípidos

Coloración

Presencia de gregarinas en
todos sus estadíos.

Presencia de epibiontes

Masas melanizadas de
hemocitos

Nódulos de bacterias en las
lámelas branquiales
Micosis (hifas, conidios)

MÚSCULO

Cuerpos de inclusión de WSSV
Materia orgánica

Color

Presencia de melanización y
necrosis

Microsporidios
Síndrome del
encalambramiento

15


Tabla 3. Guía general para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad
a la infección, infestación y síndrome (Lightner, 1996).
GRADO DE SEVERIDAD

SIGNOS CLÍNICOS

0

No presentan signos de infección por el agente patógeno, parásito
o epicomensal. No presentan lesiones características de síndromes.

1

2

encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas
lesiones características del síndrome.
Se observa la presencia baja y moderada del patógeno, parásito o
epicomensal. Se observan lesiones ligeras o moderadas, características del síndrome. Incremento en la mortalidad si no se
aplica tratamiento (cuando existe tratamiento).
Se observa la presencia moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones moderadas a severas, características
del síndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento
(cuando existe tratamiento).

4

Se observa gran cantidad del patógeno, parásito o epicomensal.
Se observan severas lesiones características del síndrome. Muy
letal con altas mortalidades.

Tabla 4. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la
deformación tubular en hepatopáncreas con análisis en fresco (Morales-Covarrubias,
2004).
GRADO DE SEVERIDAD

SIGNOS CLÍNICOS

0

No presentan signos de deformación tubular (0). No presentan
lesiones características de síndromes.

1

Presencia muy baja de deformación tubular (1-5/campo/organismo). Se observan muy poco desprendimiento celular.

2

campo/organismo). Presencia de hemocitos y formación de nódulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.
Se observa la presencia alta de deformación tubular (11-20/
campo/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas,
formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se
aplica tratamiento.
organismo). Se observan severas lesiones como melanización,

4
hemolíticos y presencia de granulomas. Muy letal con altas mortalidades.

16



infestación por gregarinas utilizando análisis en fresco.
GRADO DE SEVERIDAD
0

1

2

SIGNOS CLÍNICOS
No presentan signos de infección por el parásito (0). No presentan lesiones causadas por el parasitismo.
Presencia muy baja del parásito (1-15/intestino/organismo). Se
observan muy pocas lesiones causadas por el parasitismo como
ganismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas por
los hemocítico Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.
Se observa la presencia alta del parásito (51-100/intestino/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por
mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento.

4

Se observa gran cantidad del parásito (mas de 100/intestino/organismo). Se observan severas lesiones causadas por el parasitismo
Muy letal con altas mortalidades.

Tabla 6. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la
infestación por epicomensales en lamelas branquiales.
GRADO DE SEVERIDAD

SIGNOS CLÍNICOS

0

No presentan signos de infección por protozoario (0). No presentan lesiones causadas por epicomensales.

1

Presencia muy baja de protozoarios (1-5/lámela/organismo). Se
observan muy pocas lesiones causadas por los epicomensales,

organismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas
2
de n’odulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se toman las
medidas de corrección.
Se observa la presencia alta de protozoarios (10-20/lámela/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por los
mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se toman medidas de corrección

4

Se observa gran cantidad del parásito (mas de 20). Se observan
tración hemocítica, melanización multifocal y necrosis. Muy letal
con altas mortalidades.

17


Objetivo.
tipo de las bacterias presentes en la hemolinfa, otros tejidos o larvas y postlarvas, así
como en agua para / de cultivo.
Descripción. La bacteriología es un conjunto de métodos que se utiliza como apoyo en
el diagnóstico de enfermedades en camarones, cuando se sospecha que la causa de la
enfermedad está relacionada con presencia de bacterias patógenas en el agua de cultivo
o dentro del organismo de los animales. Consiste en la siembra de muestras en diferentes
medios de cultivo, para determinar si hay crecimiento o no de bacterias potencialmente
patógenas.
Metodología.
dependerá de si la captura es aleatoria o, de si se escogen sólo animales enfermos para
de muestreo). Los camarones que se van a someter a pruebas de bacteriología, deben
estar siempre vivos; no debe realizarse ninguna prueba bacteriológica con camarones
muertos, debido a que los resultados estarán sesgados por los cambios autolíticos (postmortem), con los cuales se alteran las poblaciones bacterianas presentes en los tejidos,
así como su crecimiento.
Antes de iniciar cualquier procedimiento bacteriológico, se deben tener previamente

15 libras de presión (121°C) durante quince minutos. Las asas de platino se esterilizan

hipoclorito de sodio concentrado por 5 minutos. Posteriormente se lava con agua estéril
hasta que desaparezca el olor producido por el hipoclorito.
La toma de muestra para análisis bacteriológico tanto de agua de transporte de
nauplios como de los mismos nauplios, se debe realizar, si es posible, en el momento
de recibir los animales y directamente en las bolsas o cajas de transporte. La toma de
muestra de agua en tanques de larvicultura, se debe realizar al menos en 2 puntos: la
entrada del tanque y en el centro del mismo.

colador pequeño de cocina, previamente desinfectado con yodo, formalina o etanol
70%. Las muestras deben ser luego maceradas en un recipiente esterilizado y agregando
una cantidad conocida (en mL) de agua de mar estéril o solución salina estéril para la
dilución del macerado.
desinfectar el área de punción (seno cardíaco –dorsal– o seno hemolinfático –ventral–)
con trozos de algodón impregnado con etanol 70%. Con una aguja de insulina (1 mL)
nueva y estéril que tenga aguja hipodérmica (muy delgada), se extraen al menos 100 μL
18



de la jeringa se debe considerar antes de emitir los resultados de los conteos bacterianos

(anticoagulada o no) o agua de cuerpos de agua en estudio, se deben sembrar 100
selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (género
Vibrio), aunque también crecen especies bacterianas de los géneros Pseudomonas,
Plesiomonas, Aeromonas, Flavobacterium y enterobacterias, entre otras. Para cultivos
tripticasa soya) y Agar Marino.
Una vez se inoculan los 100 μL de muestra sobre el agar elegido y en condiciones
extiende circularmente mediante el uso de un asa de Drigalski (varilla de vidrio tipo
Seguidamente se invierte la caja de Petri y se incuba de esta manera a una temperatura
o
se realiza un extendido de una colonia representativa sobre una lámina portaobjetos,
habiéndola diluido antes en solución salina estéril hasta obtener un grado de 0.5 en la
del género Vibrio se observarán como bacilos Gram negativos bipolares.
cual existen métodos de observación directa (a trasluz) o utilizando un equipo especial

Si las bacterias aisladas sugieren ser la causa de una enfermedad en los camarones
(bacteriosis), se realizan pruebas de sensibilidad a antibióticos (antibiogramas), para
establecer qué productos antibacterianos comerciales son capaces de eliminar dichas
bacterias aisladas. Una vez determinado el antibiótico más efectivo, se puede realizar
una prueba para medir la concentración mínima inhibitoria (MIC) de dicho antibiótico,
referencia para la medicación de la población afectada de camarones.

19


MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA

utilizada durante la siembra de muestras de camarones, agua o sedimento
en medios de cultivo, para evitar la
contaminación con bacterias presentes
tos equipos están dotados con entradas
de agua, gas y sistemas de vacío, así
como luz blanca y luz ultravioleta.

utilizado para esterilizar elementos,
materiales y reactivos que se utilizan
presión producida por vapor de agua,
lo que eleva la temperatura a 121ºC, a
la cual se exponen los materiales por
15 minutos.

20



MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA

anticoagulada de un camarón P. vannamei en
alcohol cerca del medio de cultivo, para procurar
tener un ambiente estéril alrededor de la zona
una micropipeta graduada volumétricamente,
será esparcido por todo el medio utilizando una

el cual se observa crecimiento de bacterias
Sucrosa positiva (colonias amarillas). La
muestra pertenece a hemolinfa de un camarón
P. vannamei y fue incubada durante 24 horas a

de las bacterias predominantes.

colonias en los platos Petri donde se presentan
crecimientos bacterianos. Cada colonia procede
de una bacteria, la cual constituye una unidad

21


1.6

Histología

Objetivo

cambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos físicos
bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivo
reproductores.
Descripción
de la enfermedad de la población de camarones bajo estudio; se logra generalmente
hacer el diagnóstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por
nemátodos, enteritis hemocítica y necrosis muscular idiopática, entre otras enfermedades.
Para esto, se requiere que las láminas histológicas sean perfectamente preparadas y
examinadas bajo el microscopio por el ojo de un patólogo entrenado.
La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustáceos
extremadamente rápido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas y
componentes celulares, pérdida de la arquitectura de los tejidos y destrucción de los
y por la inmersión en el mismo, el cual debe ofrecer una rápida penetración en los
la solución debe penetrar el órgano rápidamente o los cambios post-mortem conducirán
a la pérdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para el
diagnóstico.
Si existe interés en estudiar problemas de morfología externa en camarones como
es el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales)
adheridos a las branquias, también se obtienen buenos resultados si los animales son
Metodología
para los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camarones

22



Para la realización de un estudio histológico en camarones, se requiere de un

obtener láminas de óptima calidad, las cuales permitan nitidez óptica en la organización
celular de los tejidos, cuando sean estudiados bajo el microscopio.
Fijación. Corresponde a la preservación de los tejidos en las mismas condiciones
estructurales y morfológicas del momento de la muerte del camarón, lo cual como ya se

ser sustituido completamente por etanol 70%, el cual deberá reemplazarse a los 15 días
Consiste en eliminar la mayor parte del agua
12 recipientes estando 1 hora en cada uno, los cuales contienen etanol 70% (2), etanol

Bloqueo.

bloque. Los moldes plásticos disponibles para bloqueo, permiten además servir como
base para el montaje de los tejidos en la unidad de corte (micrótomo).
Corte.
de tejido con un espesor de 1 a 15 micras. Luego de ajustar el grosor deseado en este
equipo, se realizan los cortes mediante giros de una manivela y cada vez que se le da

Recuperación del corte.
agua moderadamente caliente con temperatura controlada (40-50ºC aprox.), la cual
puede contener una pequeña concentración de gelatina neutra. Las tiras se expanden
al entrar en contacto con el agua caliente y así se elige la que presente una estructura
más completa del tejido en cuestión. Separada de los segmentos no deseados mediante
el uso de un pincel delgado, la porción seleccionada es recuperada con una lámina

23


portaobjetos, en la cual quedará adherida de manera permanente y sobre la cual se hará
Tinción.
y medio de montaje. Una vez teñidas las láminas histológicas, se sellan utilizando una
gota de medio de montaje sobre el tejido y un cubreobjetos para proteger la muestra
permanentemente. Los tiempos para cada paso pueden ser consultados en Lightner,
Los colorantes (o tinciones) son sustancias químicas complejas, a menudo de

cuando la propiedad de tinción está en el radical ácido de la sal neutra; tal es el caso
del citoplasma y en este caso las estructuras teñidas con colorante ácido son llamadas

de las membranas por efecto de la hematoxilina y, el citoplasma de color rosado por
efecto de la eosina. Los tejidos se tiñen para aumentar el contraste natural y hacer más
evidentes los diversos componentes celulares, tisulares y material extrínseco. Además de
los órganos o tejidos, ofreciendo una buena diferenciación.
celulares, como el ácido periódico de Shiff (PAS) que resalta de rojo magenta el citoplasma
utiliza la tinción de Groccott ya que contienen sales de plata. Aunque las tinciones para
hongos suelen tener sales de plata, también se utilizan para detectar bacterias como
espiroquetas (Levaditi) y bacilos ácido-alcohol resistentes (Zihel-Neelsen). Otras tinciones
(rickettsias), Kinyoun (bacterias ácido-alcohol resistentes), McManus´PAS (glicógeno y
Montaje.
se deshidrata el corte con alcoholes a concentraciones crecientes, pasando después de
alcohol absoluto a una solución de agente aclarante. Posteriormente, se coloca una gota
de bálsamo de Canadá (medio de montaje) y se cubre con el cubreobjetos dejándose
ser observado a través de un microscopio óptico.
Lectura e interpretación. Una adecuada interpretación de un corte observado al
microscopio óptico, depende de factores como el plano del corte, la tinción utilizada y
tridimensional de células, tejidos y órganos a partir de cortes bidimensionales. La
tinción es también fundamental ya que debe ser elegida correctamente con base en

24



funcional, es importante establecer las correlaciones entre estructura y función de lo
observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estáticas del corte en
histopatológicos, que la observación sea hecha por un ojo entrenado en patología y, en
tener láminas preparadas con gran acierto y que ofrecen excelente calidad óptica bajo el
microscopio, si quien las examina no tienen habilidad para diferenciar tejidos sanos de
órganos o tejidos con lesiones.
Durante la preparación de los cortes histológicos, pueden presentarse alteraciones
conservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en el empleo de sustancias
en la preparación del tejido, defectos en la cuchilla que se traducen en muescas en la
preparación, contaminación de los colorantes o, errores de montaje como pliegues.

MÉTODO DE HISTOLOGÍA

P.
vannamei. La solución que se está inyectando
el cambio de color del hepatopáncreas que pasó
de amarillo (normal) a anaranjado, por efecto
observa el uso indispensable de guantes para la

utilizada para la manipulación de muestras que
Se observa un vidrio de seguridad en el frente,
a través del cual se pueden ver las muestras
que se manipulan y el cual protege la cara de
cuenta con fuente de agua para lavado de
elementos o partes del cuerpo en donde haya

25



donde se hace la deshidratación de los tejidos y se
(2 vasos con termostatos, de color blanco ubicados a
tejido y permite realizar cortes con el micrótomo sin
que se deformen por el paso de la cuchilla.

es ubicado en un cassette plástico y cubierto con

cassette (blanco) con un corte de cefalotórax (anaranjado)
siendo montado en la base móvil de un micrótomo, antes

26




se han obtenido con el micrótomo, son puestas
expande con el calor y se elige el mejor corte,
capturándolo con una lámina portaobjetos y
ubicándolo sobre esta en la posición en la cual

y eosina, en la cual se agregan los colorantes
a los tejidos para obtener el contraste entre las
diferentes células y entre las distintas partes de
utilizados para la tinción de rutina, donde se
puede apreciar la canasta con láminas siendo
inmersa en eosina.

histológicos de un camarón juvenil P. vannamei,
un corte longitudinal de cefalotórax (C), uno
transversal de abdomen (A) y uno longitudinal

27



corazón de un camarón subadulto P. vannamei.
Se observa la válvula aórtica de un animal sano

de un camarón subadulto P. vannamei. Se
diferentes tipos de células y con un lumen
en el centro. No hay evidencia de lesiones
que sugieran presencia de una enfermedad

de un camarón juvenil P. vannamei, con
Los principales hallazgos histopatológicos son
pérdida de la arquitectura de la zona afectada.

28


1.7


Pruebas con anticuerpos

Objetivo.
enzyme linked immunosorbant assay) es una prueba
rápida de laboratorio, en la cual un anticuerpo conocido se une a un antígeno (viral o

Descripción.

rápida (en algunos casos sólo tarda 1 hora), de buena sensibilidad y adaptable a un gran
o monoclonales.
Metodología.
sensibilidad de pruebas enzimáticas simples, usando anticuerpos o antígenos acoplados

que son reconocidos por un anticuerpo o para detectar anticuerpos que reconocen un
antígeno.
1) cobertura de los pozos de la microplaca con el antígeno; 2) bloqueo de todos los
anticuerpos a los pozos de la microplaca; 4) adición de anticuerpos conjugados con una
enzima; 5) reacción de un substrato con la enzima para producir un producto coloreado,
sandwich

los pozos con 100 μL del antígeno diluido. Se incuba toda la noche a 4ºC y se lava el
antígeno no adherido en la microplaca mediante golpes suaves. Luego se llenan los
pozos con agua destilada y se vacían de nuevo con un golpe suave; se repite esto 2 veces

mencionó anteriormente y se agregan 100 μL de las muestras diluidas en los respectivos
y negativo y, si es necesario, una curva estándar. Se incuba por 1 hora a temperatura
ambiente y se repite luego el paso del lavado.
Luego se prepara la dilución apropiada del segundo paso del anticuerpo conjugado
con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano (los anticuerpos deben ser titulados
para buscar obtener una dilución óptima).
Se deben agregar luego 100 μL del anticuerpo del segundo paso a los pozos y se

29


del substrato y se agregan 100 μL a los pozos, incubando luego a temperatura ambiente

MÉTODO DE PRUEBAS CON ANTICUERPOS Y PARÁMETROS
INMUNOLÓGICOS
(ESPECTROFOTOMETRÍA)

y se agrega el antígeno complementario.
anticuerpo contra el mismo antígeno, marcado
substrato, produce color cuya intensidad es
proporcional a la cantidad de antígeno presente

anticuerpos y en mediciones de parámetros
inmunológicos de camarones. Son montadas en
la cantidad existente de un antígeno de interés.

independiente o conectado a un computador
para almacenar 100 ensayos y 20 microplacas

30



La hibridación es una de las principales metodologías que se utiliza actualmente en los

nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es análogo a la reacción antígenoanticuerpo, pero con la diferencia de que en la hibridación en lugar de anticuerpos se emplean
in vitro y que se

la detección de agentes patógenos en muestras de animales afectados, son: dot blot, hibridación
in situ
en investigación más que en diagnóstico. De éstas, las que presentan mayor sensibilidad y

Dot blot
Objetivo. Detección de patógenos (ej.: virus) en una muestra de tejido de camarón, mediante
el reconocimiento de la presencia de su ADN a través de un proceso de lisis (ruptura) celular,
extracción del ADN, hibridación y revelado.

Descripción. dot blot es una técnica de hibridación en la cual el ADN se ubica directamente
sobre una membrana de nylon o de nitrocelulosa. Su nombre se debe a que sobre la membrana
involucra sondas genéticas en su procedimiento, las cuales son pequeños fragmentos de ADN
(oligonucleótidos), que son complementarios de regiones que nos interesan en el ADN que
se está buscando en una muestra (ej.: virus). De esta manera, si en una muestra problema se
produce la hibridación entre la sonda y el ADN viral, se puede concluir que el virus en cuestión
se encuentra presente.
Las sondas genéticas para camarones son marcadas utilizando moléculas como la biotina
o la digoxigenina, las cuales son luego detectadas mediante enzimas como la fosfatasa alcalina,
produciendo una reacción colorimétrica y de esta manera detectable por el ojo humano. Las

Metodología.
dot blot en camarones, inicia con una muestra de hemolinfa
o de otro tipo de tejido de un animal sospechoso de una enfermedad (ej.: virus WSSV). Cabe
que se va a buscar.
La muestra es macerada mecánicamente con un tampón (buffer) de lisis, con lo cual
se busca romper las células y permitir la salida de las moléculas de ADN hacia la solución
del macerado. Luego, una cantidad de macerado (inferior a una gota) es puesta sobre una

31


cadenas de la doble hebra y luego se coloca la sonda previamente calentada. Dicha sonda ha
Se incuban las muestras con la sonda y si esta encuentra regiones del ADN viral que
y C-G), se produce anillado o hibridación (unión entre la sonda y el ADN viral), que es una
molécula estable de ADN híbrida de doble cadena.
Luego de incubar, se realiza un lavado y se agregan anticuerpos anti-digoxigenina, que
han sido previamente marcados con la enzima fosfatasa alcalina. Si la sonda está presente
fosfatasa alcalina y produce una reacción colorimétrica. La intensidad del color morado que se
produce, es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra (partículas
virales de WSSV en el caso de este ejemplo).

Hibridación in situ (HIS)
Objetivo.

Los patógenos o enfermedades en camarones que pueden ser detectados en la actualidad
Descripción.
manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Al igual que en el
caso de la hibridación dot blot
dentro de una muestra de tejido.
A diferencia que el dot blot
igual que en la histología) sobre una lámina portaobjetos, pero en este caso la lámina debe
la aplicación de la sonda y los demás componentes para la detección genómica de un agente
Metodología.

in situ en camarones, se inicia a partir de un

positivamente.

formaldehído y se lava con un buffer. Se aplica entonces la solución de hibridación y se incuba
en la muestra, en este momento se realiza el anillado o hibridación que como ya se explicó en
32



la técnica de dot blot, es una unión entre la sonda y fragmentos del genoma viral o bacteriano,
que forma así una molécula estable.

calentamiento previo de la muestra para desnaturalizar el ADN baculoviral de doble cadena

Posteriormente las muestras deben ser sometidas a varios lavados con buffers distintos
y luego se aplican los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina. Se
incuban y posteriormente se hacen nuevos lavados con soluciones buffer.
Se aplica la solución de desarrollo y se frena luego la reacción cuando sea ya necesario
de acuerdo con criterios colorimétricos, lavando con soluciones buffer y después con agua
Bismark Brown Y
substituto).
Sin dejar secar la muestra en este momento (y en ninguno de los procesos anteriores),
se pone una gota de medio de montaje sobre el tejido y se cubre con una laminilla o lámina
cubreobjetos. Se deja secar y se observa luego en un microscopio de campo oscuro, para
detectar depósitos intracelulares de precipitado negro o azul oscuro y/o alguna citopatología

infectados por el agente viral o bacteriano.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Objetivo.
polymerase
chain reaction
que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada ciclo del
muestras de camarones o de organismos relacionados.

Descripción.
primers
complementarios con la secuencia de nucleótidos de los extremos opuestos de las cadenas que

permite obtener hasta un millón de copias de un solo fragmento en pocas horas. Los elementos
necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de kits.
33


de ADN polimerasa (enzima encargada de la síntesis de las cadenas complementarias) y los

la reacción.
pueden dar resultados falsos positivos, por lo que el material y las soluciones a emplear deben
ser muy cuidadosamente manipulados y almacenados.
Metodología. La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación del
cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria). Durante la replicación, las dos
cadenas se separan y una enzima especializada llamada polimerasa, hace una copia de cada
una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso
de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas
hijas.
de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o
es el cofactor MgCl2
ingredientes para copiar ADN en un microtubo de ensayo.
La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnaturalización, la plantilla
la temperatura de la mezcla se baja hasta 55ºC durante 20 segundos para que los cebadores
la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75°C para que la polimerasa copie rápidamente la
molécula de ADN.

sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores, deben renovarse al cabo de unos
copias de ADN.

(cDNA), molécula que es un ADN de doble cadena y, por consiguiente, susceptible de ser

La polimerasa utilizada actualmente es termoestable, no se inactiva por las elevadas
Thermus
aquaticus

34



de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación.

PCR en tiempo real (real time PCR, Q-PCR)
Objetivo.
Descripción.

tradicional reacción en cadena de la polimerasa.
Para llevar a cabo la detección en tiempo real de un genoma de interés, existen varios
métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda)
forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa,
quencher
válida esta técnica, requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones,

utilizado un par de iniciadores (primers), los cuales proporcionan con frecuencia una sensibilidad

procedimientos consumen una cantidad de tiempo considerablemente menor comparados
electroforesis en geles de agarosa, seguidos por la tinción con bromuro de etidio y, de nuevo,

Metodología.
cantidad que dobla de ciclo en ciclo. Un rayo láser excitador es transmitido a la muestra por

longitud de onda elegida para la muestra.

35


A partir de este momento, la señal dobla de ciclo en ciclo. Se observará aparecer en el
concentración inicial de ADN.

PRUEBAS MOLECULARES - DOT BLOT

WSSV sobre una membrana de nitrocelulosa. Cada cuadro
pequeño (1 cm2) corresponde a un camarón. La intensidad
de la mancha morada en cada cuadro, es proporcional a
la cantidad de ADN viral presente en las células analizadas
muestras con severidad baja (círculo amarillo), media (círculo

PRUEBAS MOLECULARES - HIBRIDACIÓN IN SITU

de estómago de un camarón juvenil P. vannamei
infectado con el virus WSSV. La sonda reaccionó
fuertemente con el ADN viral presente en los
cuerpos de inclusión intranucleares, mediante
la prueba de hibridación in situ utilizando una
sonda de ADN marcada con digoxigenina. La
coloración obtenida es producto de la reacción

36



PRUEBAS MOLECULARES – PCR

utilización de un kit comercial con base en soluciones de lisis
celular. Nótese el uso de puntas de micropipeta protegidas con
la micropipeta y el paso de ADN viral de una muestra a otra
(contaminación cruzada).

elementos que se utilizan dentro de la cámara, no deben salir
diferentes tipos de muestras o para diferentes tipos de agentes
patógenos.

de poder (derecha), que permiten la migración del ADN
continuo. Después de este proceso, las muestras migradas
en el gel, están listas para ser observadas en un visor de luz

realizar mediante un comando computarizado programable,
muchos ciclos a diferentes temperaturas y con diferentes
tiempos.

37


PRUEBAS MOLECULARES – PCR

para revelar la presencia de bandas de ADN, producto de la
transiluminador de luz ultravioleta. La columna de la izquierda
posee un marcador de peso molecular; las columnas siguientes
de guantes por parte del operario, mientras manipula el gel de
agarosa para ser puesto sobre el transiluminador.

blancas que se observan en éstas, corresponden a resultados

PRUEBAS MOLECULARES – PCR EN TIEMPO REAL

(termociclador); a su derecha una fuente de poder, luego una
CPU para el procesamiento de los datos suministrados por
el termociclador y a la derecha el módulo de visualización
(monitor) para la observación de los resultados que se van
obteniendo en cada ciclo y en tiempo real.

tiempo real. Se observa un panel de control con comandos
(botones) verdes y azules para la programación del equipo,
así como una pequeña pantalla para visualizar la información
correspondiente a la programación y al avance de los ciclos de

Cada línea de color corresponde a una muestra analizada y al
control utilizado. La columna de la derecha indica la cantidad
aproximada de copias de ADN que se encuentra en cada
muestra.

38


1.9


Parámetros inmunológicos

razón, sólo se hará en éste capítulo una mención general de las principales técnicas
inmunológicas, como herramientas para el diagnóstico de enfermedades en camarones.
La medición de algunos parámetros inmunológicos en los camarones, permite
evaluar y determinar en un momento dado, las condiciones sanitarias de un grupo
están relacionados con la capacidad de respuesta inmune de los organismos, frente a
la invasión de agentes bioagresores (virus, bacterias y hongos), o elementos inertes que
entran en contacto con los animales.
Los principales parámetros inmunes de los camarones que se pueden medir en la
hemolinfa, son los siguientes:
Hemograma: los hemocitos constituyen la barrera celular del sistema inmune, que
total o diferencial de los hemocitos en la hemolinfa, para establecer una relación entre
los valores obtenidos y las condiciones de salud de los camarones examinados (o de
sus poblaciones de origen). Para realizar un hemograma, se extrae hemolinfa con un

correspondientes a la dilución con el anticoagulante y la profundidad y área de la
cámara utilizada. Los resultados se dan en hemocitos (totales, granulares, semigranulares
o hialinos) por cada mm de hemolinfa. Los valores promedio de hemocitos totales/
mm más frecuentes en camarones preadultos sanos, se encuentran entre 25.000 y
propias del camarón (muda, sexo y edad) y del medio de cultivo (temperatura, salinidad
y oxígeno disuelto, entre otras), ya que éstas afectan los valores obtenidos en los conteos
de hemocitos.
Concentración de proteínas plasmáticas: este parámetro es utilizado para evaluar el
plasmáticas totales está compuesto por hemocianina (pigmento extracelular que
transporta el oxígeno a los tejidos del camarón). Por esta razón, cambios importantes
en la concentración de la hemocianina, afectan directamente los valores obtenidos para
proteínas plasmáticas. Adicionalmente, la concentración de las proteínas plasmáticas
Cuando el camarón está infectado, puede haber una lisis celular y destrucción de
sus tejidos afectados, lo que genera un aumento en la concentración proteica de la
poder utilizar este parámetro inmunológico como un verdadero criterio para conocer el
estado sanitario de los camarones. Para determinar las proteínas plasmáticas totales en
una muestra de hemolinfa de camarón, se pueden utilizar métodos de rutina como el de
De manera general, el nivel de proteínas plasmáticas totales en camarones, se
determina a partir de muestras de suero. Luego de extraer la hemolinfa, se deja coagular
a 4ºC por al menos 12 horas y luego se centrifuga para recuperar el suero. Se agrega un
39


volumen de suero a una microplaca y se hace reaccionar con el reactivo del método
utilizado. De esta manera se obtiene la formación de un complejo coloreado el cual
concentración de proteínas totales en el plasma de la muestra, a partir de una curva de
calibración con una solución stock
Capacidad de hemoaglutinación: con este método es posible determinar las condiciones
sanitarias de los camarones, mediante la medición de la capacidad de las proteínas
lipopolisacáridos), presentes de manera natural en la hemolinfa. Sus funciones incluyen
reconocer y aglutinar cuerpos invasores. Por comodidad, se usan en los ensayos eritrocitos
de diferentes mamíferos, por ser células extrañas al camarón y, sobretodo, por ser células
estudio de estas proteínas y sus mecanismos de reconocimiento, comienza a ser una
herramienta muy potente para las estrategias de selección de animales genéticamente
resistentes a enfermedades. La actividad hemoaglutinante de la hemolinfa, podría
constituirse en un indicador de salud y de adaptación del camarón, ya que por ejemplo
existe una relación directa entre los títulos de hemoaglutinación y la calidad reproductiva
de los machos (índice de espermatogénesis). Igualmente, la sensibilidad de la actividad
hemoaglutinante ante el estrés, demuestra que los títulos de hemoaglutinación pueden
ser usados tanto como indicadores sanitarios, como de adaptación de los animales a sus
condiciones de vida. La prueba de hemoaglutinación se realiza utilizando eritrocitos
humanos o de otros mamíferos (principalmente de roedores que son particularmente
aglutinación y el título aglutinante. Cuanto mayor es el título, mayor será la cantidad de
Actividad de la fenoloxidasa: la enzima fenoloxidasa (PO por sus siglas en Inglés), se
crucial en la cascada inmunológica que se activa cuando es reconocida una substancia
como cuerpo extraño (antígeno). La PO se encuentra en forma de enzima inactiva
inactiva es exocitada de los hemocitos hacia el plasma del camarón y es convertida en
serin-proteasa. Las reacciones que culminan con la transformación de proPO en PO y
con la subsecuente melanización, son consideradas como un componente que integra
in vitro, se ha observado que el paso de proPO a PO se produce incubando la muestra
L-DOPA como sustrato. La determinación de la actividad de la PO, permite tener una idea
de la capacidad de respuesta inmune de un camarón, frente a la presencia de agentes
patógenos en el organismo. Para su medición, se parte de la reacción en la que se utiliza
suero de los camarones o un lisado de sus hemocitos, que son la fuente de la enzima PO
nm y puede ser detectada espectrofotométricamente con un lector de microplacas.
Actividad antibacteriana de los hemocitos por la producción de intermediarios reactivos
de oxígeno (fagocitosis): en condiciones normales, las células fagocíticas de los
camarones se encuentran en estado inactivo. La presencia de partículas extrañas sobre
40



en la actividad metabólica; esta se llama choque respiratorio o metabolismo oxidativo. La
transición celular de un estado inactivo a uno activo, involucra cambios característicos

la producción de muchos reactivos intermediarios de oxígeno altamente tóxicos como el
singlet oxygen
actividad antimicrobiana en el camarón y con la destrucción de los agentes infectantes.
La producción del anión superóxido puede ser medida a partir de una muestra de
hemolinfa, mediante la estimulación de los hemocitos y la capacidad de este anión para
reducir el nitro blue tetrazolium

Actividad antibacteriana del plasma: existen en la hemolinfa del camarón diferentes
de éstos en un camarón cuando se presenta el ataque de bioagresores, mayores serán
las posibilidades de defensa y, por ende, de supervivencia. La prueba de la actividad
antibacteriana del plasma permite medir la inhibición del crecimiento bacteriano, por
la acción de péptidos que poseen propiedades microbicidas y que están presentes en la
hemolinfa de los camarones.
Con base en lo anterior, medir la actividad antibacteriana del plasma/suero de
camarones, permite estimar la capacidad de respuesta frente a una eventual infección
por bacterias. Para realizar la evaluación, se deben tener cultivos de cepas bacterianas
Gram positivas y negativas en pozos de una microplaca y se hacen diluciones seriadas
del plasma/suero de camarones frente a estas bacterias. Se analiza la inhibición del
crecimiento bacteriano causada por el plasma diluido seriadamente y se calcula luego el
título de inhibición. La medición se hace por medio de un método turbidimétrico, cuyo
principio está basado en la determinación espectrofotómetrica de la turbidez causada
por las suspensiones bacterianas; si la turbidez de la muestra de bacterias disminuye
en presencia de plasma, sugiere destrucción bacteriana por presencia de los péptidos
del cultivo control (sin plasma/suero) y del cultivo con la muestra de plasma/suero,
utilizando un lector de microplacas.
2Macroglobulina

plasmática: en invertebrados, se ha sugerido

sistema inmune. Los inhibidores de las proteasas no sólo participan en las acciones
de protección contra microorganismos patógenos, sino que también juegan un papel
2Macroglobulina plasmática, se realiza basándose en que reacciona con las proteasas
sin bloquearles el sitio activo, siendo así protegidas las proteasas e impidiendo el acceso
produce un compuesto de color amarillo, el cual puede medirse con un lector de

41


la presencia de compuestos microbianos en el
sistema inmune puede activar directamente las funciones celulares de defensa tales como
fagocitosis, melanización, encapsulación y coagulación; las proteínas reconocedoras
sistema proPO de crustáceos, ha permitido demostrar la presencia de dos proteínas
directamente relacionadas con la comunicación celular entre hemocitos. Una de ellas
ß-1,3-Glucan Binding Protein)
camarón Penaeus californiensis
del sistema proPO. La otra molécula es la proteína de unión a los lipopolisacáridos de la
Lipopolysaccharide Binding Protein),

aglutinar bacterias. Una vez reacciona con el LPS o con bacterias, la proteína se une a los
solamente después de reaccionar con los ß-glucanos y con los LPS, respectivamente.
entre los inmuno-reactantes y la hemolinfa.

su detección consiste en inmovilizar antígeno (dichas proteínas) en una microplaca de
poliestireno, agregando luego los anticuerpos e incubando para que éstos reaccionen.
presentado unión antígeno-anticuerpo, la aplicación del sustrato en presencia del
anticuerpo producirá una reacción colorimétrica medible mediante espectrofotometría,
método.
Concentración de hemocianina en la hemolinfa: la hemocianina es una proteína
presente en la hemolinfa de los camarones, responsable del transporte de por lo menos
las actividades inmunológicas del camarón, ya que los hemocitos pueden convertir
porciones de la hemocianina en una enzima similar a la fenoloxidasa. Adicionalmente,
antigénicos desencadenen reacciones donde la hemocianina genera varias moléculas
inmunorreactivas. La medición de esta proteína a partir de muestras de hemolinfa,
métodos de espectrofotometría, utilizando un lector de microplacas.
Concentración de óxido nítrico sintasa:
criterio para medir la actividad de los hemocitos dentro de las acciones de defensa de un

es altamente inestable transformándose rápidamente en nitritos (NO2) y nitratos (NO
NO es extremadamente tóxico y por lo tanto altamente microbicida. Su producción por
42



puede ser analizado por quimioluminescencia, aunque debe ser liberado de la muestra
se basa en la transformación del NO a NO2 y NO . Para medir la concentración total de
nitratos y nitritos (NOx), se pueden usar dos métodos: la reducción química con cadmio
o la reducción enzimática utilizando nitrato reductasa.
Otra forma de detectar la presencia de NOS en muestras biológicas, es utilizando
anticuerpos contra la proteína. Para ello se utilizan anticuerpos de conejo anti-iNOS
(NOS inducible presente en los hemocitos), los cuales reconocen la NOS de camarón,
probado diferentes diluciones de anti-NOS y combinaciones de conjugado anti-conejo,
habiendo sido las mejores 1:1000 y 1:40000, respectivamente.
Consideraciones generales sobre parámetros inmunológicos
La interpretación de resultados obtenidos con todas las pruebas mencionadas
sexo, estado de muda, estrés (ambiental, nutricional o séptico) y condiciones sanitarias
(presencia o ausencia de enfermedad); en el agua de cultivo está principalmente la
origen químico o biológico).

PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS – HEMOGRAMA

hemolinfa cuando se hace conteo de hemocitos.
De izquierda a derecha se observa una caja con
puntas de micropipeta (20-200 μL), micropipeta
con volumen graduable (20-200 μL), microtubos
de 1.5 mL con tapa y contador de células.

P. vannamei para la
extracción de hemolinfa del seno hemolinfático
ventral, ubicado en la unión entre el cefalotórax
y el abdomen, ventralmente. Nótese el uso de
una jeringa desechable de 1 mL (tipo insulina),
la cual contiene una solución anticoagulante.

43


PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS – HEMOGRAMA

anticoagulada en una cámara de Neubauer
(hematocitómetro). Debido a que esta cámara
posee dos campos de conteo, se pueden montar
muestras de 2 animales diferentes al mismo
tiempo.

anticoagulada en cámara de Neubauer,
utilizando un microscopio de contraste de fases
y el objetivo de 40X.

P. vannamei observados en cámara de Neubauer,
utilizando microscopio de contraste de fases y
objetivo de 40X. Se pueden observar encerradas
de los tipos diferentes de hemocitos que hay
reportados: granulares (G), semigranulares (S) y

44


1.10


Microscopía electrónica de transmisión

Objetivo.
agentes patógenos o lesiones dentro de las células de tejidos afectados.
Descripción.
rickettsias, bacterias intracelulares y otros muy pequeños microorganismos que están
el patólogo examina las estructuras internas de las células y los organelos celulares, en

actividad altamente especializada y debe ser realizada por personal bien entrenado.
Metodología.

Las soluciones de glutaraldehído comercial generalmente vienen en concentraciones
de 25%, 50% y 70%. La de 25% es grado histológico y por eso es la más utilizada para
50% y 70% se consiguen en ampollas de 5 mL.

Glutaraldehído
stock
% activo

Actividad por
ampolla

25%

2.5 g/5 mL

1%

4%

6%

5 / 245

5 / 57.5

5 / 42

n/a

50%

Volumen stock (mL) / Buffer requerido (mL)

70%

Al igual que en muestras que se preparan para diagnóstico histopatológico, la
preservación de los tejidos debe hacerse de manera rápida y a temperatura baja, para

abdominal. Con tijeras de disección y por debajo de la cutícula (sin atravesar tejido blando),
se debe hacer un corte longitudinal por la línea media a los dos lados, para asegurar una

45


animales vivos, la cual se debe tener a una temperatura de 4ºC.

debiéndolos cortar rápidamente con una cuchilla y manteniéndolos inmersos en la solución

mantener a 4ºC.
Los procedimientos posteriores pueden realizarse siguiendo los protocolos estándar para

en soluciones de glutaraldehído de 0.5% a 1%.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM)

forma de bastón, de nucleocápsides sin envoltura del virus

GAP, morfología de virus, estudios de micropartículas y nanopartículas y, estructura interna de láminas delgadas.

46



Objetivo. Determinar si el agente causal de una enfermedad es de origen infeccioso
(virus, bacterias, hongos, etc.), tóxico (toxinas químicas o biológicas) o, descartando lo
evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana inyectada o suministrada vía oral
a camarones libres de dichos agentes patógenos.
Descripción. Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este
caso, durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones

reproducir.
La susceptibilidad de los camarones que se utilizan en los bioensayos, hacen
referencia a la especie y talla de los animales. La manera de buscar su eventual infección
es utilizando batido (macerado) de camarones enfermos y los cuales presentaban
la enfermedad en los camarones susceptibles utilizados en un bioensayo, deberá
corresponder al tiempo estimado de aparición de los signos clínicos en los camarones
que se enferman en condiciones naturales.
Metodología. Los bioensayos son pruebas de desafío, en las cuales se utiliza tejido
infectante para realizar de manera experimental, una infección per os (vía oral) en
(enfermos avanzados o moribundos), que hayan presentado los mismos signos clínicos de
la enfermedad en cuestión y procedentes de una misma población (edad y talla similar).
La capacidad infectante de este batido de tejido de camarones enfermos, depende de la
carga viral o bacteriana que tenga (cantidad de microorganismos por gramo de aquellos
que causan la enfermedad) y de la cantidad de tejido que se suministre a los camarones

cada gramo de tejido infectante.
Los camarones que van a ser infectados experimentalmente per os, deben estar
libres de la enfermedad que se pretende reproducir. Para ello, deben proceder de una
o estén presentando signos clínicos de ninguna enfermedad (completamente sanos). Si
existen herramientas moleculares de diagnóstico para la enfermedad en cuestión, se
debe someter a prueba un grupo de camarones procedentes de la población de donde

Cuando el objetivo del bioensayo incluye trabajar con un patógeno desconocido y
para el cual no existen en el momento pruebas de diagnóstico moleculares, los camarones
Los bioensayos deben realizarse en instalaciones cerradas, con condiciones
controladas y con parámetros físico-químicos estables. Los principales factores que
deben mantenerse bajo control durante un bioensayo, son los siguientes:
bacteriológicas apropiadas
47


transparencia)

recirculación, etc.
con el protocolo de operación claramente comprendido por la o las personas que

fecha (o condiciones particulares) para dar por terminada la prueba (ej.: luego de 2 días
en los que se haya estabilizado la mortalidad).
experimental, ya que este valor será el 100% de la población de partida. Con base en
Los datos de mortalidad diaria deben ser observados con rigurosidad y registrados en un
momento de mayor mortalidad de la prueba, entre otra información de interés.

48



BIOENSAYOS

las partes superior e inferior de los tanques, se observa
la tubería de aire a través de la cual se conectan las
mangueras de aireación para cada uno. Los tanques de
arriba están con agua y tienen mangueras de aireación
y piedras difusoras en sus extremos (dentro de cada
tanque).

tanque de vidrio durante la realización de un bioensayo.
Se observa dentro del tanque el electrodo del equipo,
con el cual se obtienen datos de temperatura, salinidad
y oxígeno disuelto.

vannamei durante la realización de un bioensayo. Nótese
la presencia de una cubierta de malla que está siendo
levantada para la alimentación y la cual evita pérdida de
camarones por saltos hacia el exterior del tanque o hacia
otros tanques vecinos.

49


Recomendación general
de desecho procedentes de pruebas de diagnóstico, así como de camarones que han
contaminación de entornos acuáticos comerciales o silvestres y del propio ambiente.

Apéndice
Métodos para la detección de los principales agentes virales en camarones penaeidos

Método

WSSV

IHHNV

BP

MBV

BMN

-

SMV

YHV*

TSV

PvNV

-

-

IMNV

-

-

-

tología
-

-

PAb / MAb

-

-

-

-

-

Sondas ADN /
-

-

=

método desconocido o cuya aplicación no está publicada
practicada o difícilmente disponible
o sensibilidad en la detección de patógenos para la mayoría de las
aplicaciones
patógenos

Abreviaturas para los métodos

LM

50

= microscopía de luz



PAb

= anticuerpos policlonales

MAb

= anticuerpos monoclonales

Métodos para vigilancia y diagnóstico de patógenos virales en camarones penaeidos
Agente

Vigilancia

Diagnóstico
histopatología

WSSV

histopatología, bioensayos
histopatología, bioensayos
Microscopía directa, histopatología
histopatología

SMV
IMNV
PvNV

histopatología

Sondas de ADN

Sondas de ADN, histopatología,
bioensayos
histopatología
histopatología

51


2005. Análisis
proteómico de la subunidad IsI1 de la lectina del camarón blanco del Golfo de México
Litopenaeus setiferus
Pacifastacus leniusculus

Penaeus
vannamei
of Penaeus japonicus
Clifford H.C. and H. L. Cook. 2002. Disease Management in Shrimp Culture Ponds (Parts 1, 2 and

las principales enfermedades en camarones penaeidos cultivados en Colombia: técnicas de
campo y de laboratorio para el procesamiento de muestras y el diagnóstico de enfermedades.

2001. SDS-induced Phenoloxidase Activity of
Limulus polyphemus, Eurypelma californicum, and Cancer magister.
2001. Antifungal
peptides are generated from the C terminus of shrimp hemocyanin in response to microbial
.
European Union SI&DC INCO-DC Project.
June 1st.

Galván.

Penaeus stylirostris in relation

52



immunological parameters in female shrimp Litopenaeus vannamei submitted to unilateral
a form of immunostimulation. Aquaculture, 241: 501-515.
Litopenaeus vannamei

immunological parameters in the shrimp Farfantepenaeus paulensis submitted to environmental

2001. Actividad hemoaglutinante
de la hemolinfa del camarón blanco Litopenaeus schmitti
2000.
Litopenaeus stylirostris. Journal
2001.
Litopenaeus setiferus adult males:

Carcinus maenas

prophenoloxidase, agglutinin and antibacterial activity in haemolymph of the black tiger
Penaeus monodon

USDA – UCA.
UCA. Managua, Nicaragua.
shrimp (Penaeus californiensis

defences of the edible crab, Cancer pagurus

53


World Organisation for Aniamal Health (OIE).

Montajes en Fresco:

54

C. R. Pantoja y D.V. Lightner

Enfermedades Virales

55

Capítulo 2
Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner
Expertos en Patología Acuática
México / USA

Introducción
En poco menos de 40 años, la camaronicultura mundial se ha desarrollado desde
sus inicios a nivel experimental hasta volverse una industria con ingresos de billones de
dólares, proveyendo de empleo, directa e indirectamente, a cientos de miles de personas.
Desde 1970 hasta 1990, la industria dependía completamente de la captura de
postlarvas silvestres o de postlarvas producidas a partir de reproductores capturados en
el océano. La mayoría de las veces, estos animales eran capturados cerca de la región en
donde serían cultivados. Los sistemas de cultivo eran relativamente simples, se usaban tasas
muy altas de recambio de agua y las medidas de bioseguridad eran mínimas o no existentes.
En esa época se sabía de muy poco de las enfermedades del camarón y todavía menos
sobre los mecanismos de defensa -humoral y celular- especialmente contra agentes virales.
Había muy pocos especialistas en enfermedades de camarón y la capacidad de diagnóstico
era muy pequeña en la mayoría de las regiones. El uso de antibióticos y agentes químicos
era práctica común, tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como en las
granjas. No fue sino hasta 1987, cuando el aumento explosivo de la industria camaronícola
enfermedades ocasionadas por virus eran una de las mayores amenazas para la industria.
También rápidamente se puso en evidencia que la dispersión de esas enfermedades fue el
resultado del traslado sin control tanto de postlarvas como de reproductores.
La industria camaronícola del presente ha sido transformada por la necesidad de un
mejor control de las enfermedades. Como resultado de los cambios rápidos que comenzaron
a principios de los 90’s, la dependencia de la industria sobre el suministro de postlarvas
silvestres, o de postlarvas derivadas de reproductores silvestres, ha disminuido notablemente.
Desde hace algunos pocos años hasta la fecha, poblaciones domesticadas de Penaeus
vannamei (también llamado Litopenaeus vannamei) han reemplazado a P. monodon como
la principal especie cultivada y se encuentran ya en progreso varios programas para la
domesticación de otras especies. Se han descrito ya muchas enfermedades importantes y
aunque se han desarrollado métodos para su diagnóstico, existen todavía algunos problemas
relativos a su implementación y estandarización. Las medidas de bioseguridad aplicadas a
los sistemas intensivos de cultivo se vuelven más comunes cada día. El uso de probióticos
se ha vuelto también común tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como
de esto, el uso de antibióticos ha disminuido y se ha vuelto más responsable. Estudios de
biología molecular están ayudando a lograr un mejor entendimiento de la relación entre
el camarón y los agentes patógenos que lo atacan. El resultado de todos estos avances ha
sido un incremento continuo de la producción mundial de camarón cultivado.


En el futuro, se espera que la industria camaronícola mundial tenga acceso fácil a una
variedad de especies domesticadas de camarón, genéticamente mejoradas y libres de los
patógenos más importantes. Métodos para el diagnóstico de estas enfermedades, tanto
en el laboratorio como en el campo, estarán disponibles en el mercado en forma de kits
y se mejorarán los mecanismos para su estandarización. De la misma manera se espera
una mejora en los métodos de bioseguridad, los cuales serán aplicados en todos los tipos
de sistemas de cultivo, aunque aquellos con mayor control (sistemas intensivos y superintensivos) serán más competitivos que los sistemas más tradicionales y extensivos. En
verán facilitados a través del mejor entendimiento del camarón, sus patógenos, la ecología
microbiana y el uso de agentes antibacterianos y antivirales ambientalmente seguros.

2.1

Principales enfermedades y métodos de diagnóstico

Las enfermedades que afectan a los camarones de cultivo incluyen síndromes con
etiologías infecciosas y no infecciosas (Tabla 1 y Tabla 2). Dentro de las enfermedades
infecciosas están aquellas ocasionadas por virus, bacterias, (incluyendo ricketsias), hongos,
protozoarios y parásitos metazoarios y entre las no infecciosas están las de impactos
ambientales, desbalances nutricionales, agentes tóxicos y desórdenes genéticos.

En el caso del camarón, se cuenta con herramientas o procedimientos de diagnóstico
de dos tipos.
Métodos clásicos. Dependiendo del tipo de enfermedad, estos métodos pueden ser lo

Métodos moleculares.
y/o sensitivos, es necesario complementarlos con uno o más de los siguientes métodos
moleculares.

o
o

Hibridaciones tipo “dot blot” (en membrana de nylon).

o

58

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

Hibridaciones tipo in situ (en cortes histológicos).

C. R. Pantoja y D.V. Lightner


Tabla 1. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura del

Enfermedades de origen viral
WSSV (White spot syndrome virus
disease)
YHV (Yellow head virus disease)

Enfermedades de origen
bacteriano/fúngico
Vibriosis
- sistémica/entérica
- vibriosis larvaria

BMN (Baculoviral midgut gland
necrosis virus disease)

Otras enfermedades
Epicomensales
- Leucothrix mucor
- Protozoarios
peritrichidos
Gregarinidos

MBV (Monodon baculovirus
disease)
IHHNV (Infectious hypodermal
and hematopoietic necrosis virus
disease)
HPV (Hepatopancreatic parvovirus
disease)
IMNV (Infectious myonecrosis virus
disease)

Microsporidios
Micosis larvaria

Desbalances nutricionales
Síndromes tóxicos
Síndromes ambientales

Tabla 2. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura de las Américas.
Enfermedades de origen viral
WSSV (White spot syndrome virus
disease)
TSV (Taura syndrome virus disease)
BP (Baculovirus penaei disease)
YHV (Yellow head virus disease)
IHHNV (Infectious hypodermal
and hematopoietic necrosis virus
disease)

Enfermedades de origen
bacteriano/fúngico
Vibriosis
- sistémica/entérica.
- vibriosis larvaria
NHP (Necrotizing hepatopancreatitis disease)

PvNV (Penaeus vannamei nodavirus disease)

Epicomensales
- Leucothrix mucor
- Protozoarios
peritrichidos
Gregarinidos

Espiroplasmosis

HPV (Hepatopancreatic parvovirus
disease)
IMNV (Infectious myonecrosis virus
disease)

Otras enfermedades

Microsporidios
Micosis larvaria

Desbalances nutricionales
Síndromes tóxicos
Síndromes ambientales
Síndrome de Zoea II

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