1. Virologia
Ano Lectivo 2010/11
Técnicas Diagnóstico
Virologia – Parte I

2. Testes imunológicos
 Baseiam-se em reacções antigénio-anticorpo:
 Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante
a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar
especificamente a um epítopo de um antigénio.
 Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de
induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar
através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.
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3. Anticorpo
 Cadeias de glicoproteícas :
 Cadeias leves
 Cadeias pesadas
 Região constante – local de activação
de outros elementos dos S. Imune;
 Região variável – local de ligação ao
antigénio
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4. Anticorpo
Tipos de anticorpos

Policlonais
Obtidos a partir de diferentes
clones de células;

Monoclonais
Obtidos a partir de um único
clone de plasmócitos
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5. Classes de anticorpos no Homem
Imunoglobulinas Características
IgG Principal Ig sérica
Envolvida na activação do complemento e na opsonisação
IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)
Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados
IgA Presente no soro, secreções e mucosas
Tem funções de opsonização.
IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como
receptor de antigénios.
Funções pouco definidas.
IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e
eosinófilos.
Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.
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6. Antigénio
Epítopo
 Região do antigénio que reage com o anticorpo
 Possibilidade de reacções cruzadas
 Pequenas alterações na estrutura do antigénio,
entre outras factores, podem afectar
profundamente a ligação com o anticorpo
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7. Aplicabilidade
 Papel importante:
Diagnóstico
Monitorização
Tratamento
 Tipo de amostra varia consoante o
que estamos a pesquisar
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8. Técnicas de Imunologia
 Reacções Imunoenzimáticas
 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)
 ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)
 Imunoflurescência
 Imunocromatografia
 ImunoHisto/Citoquímica
 Análise Proteínas: Western Blot
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9. Reacções Imunoenzimáticas
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10. ELISA
Baseia-se numa reacção imunoenzimatica com detecção final em
espectrofotometria
 Permite determinar a concentração
do analito
 Calcular curva de calibração –
interpolar a concentração da
molécula a quantificar
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11. Tipos de ELISA
Sandwich
1. Poços revestidos com anticorpo especifico
2. Formação de complexos
3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
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12. Tipos de ELISA
Indirecto
1. Poços revestidos com antigénio especifico
2. Formação de complexos
3. Ac conjugado com enzima
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
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13. Tipos de ELISA
Competitivo
1. Ac especificos incubam com a amostra
Quanto
2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag maior a
concentraçã
3. Ac secundário o de analito
4. Adição do substrato menor a
absorvância
5. Medição por espectofotometria
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14. ELISA
Método automatizado
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15. ELFA
Reacção imunoenzimatica com detecção final em fluorescência.
 Permite fazer um análise quantitativa
 Curva de calibração
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 15

16. ELFA
 Teste, geralmente, automatizado onde é
necessário:
 Um cone sensibilizado com Ag,
serve, tanto de fase sólida como
sistema de pipetagem
 Uma barrete que contem os
reagentes necessários para a
realização da técnica
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17. Imunoflurescência
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 17

18. Imunoflurescência
 Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos
 O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência
 A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência
 Fluorocromos mais usados
 Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)
 Rodamina
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19. Imunoflurescência
 Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi-
quantitativa
 Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.
 Tipos de Imunoflourecênca
 Directa
 Indirecta
 Anti-complemento
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20. Imunoflurescência Indirecta
 Etapas
▫ Fixação (quando queremos
pesquisar Ac as laminas vêm
revestidas com o respectivo Ag);
▫ Ac primário
▫ Ac Secundário (marcado com um
fluorocromo);
▫ Reagente de contraste
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21. Imunofluorescência anti-complemento
 Etapas
▫ Inactivação do complemento endógeno
▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo
▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado
▫ Ac conjugado que se liga ao complemento
▫ Detecção por microscopia de fluorescência
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22. Imunofluorescência
 Resultados
Permite localizar o
analito
EX: Membrana celular
Análise com o corante de
contraste
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23. Imunofluorescência
 Resultados
Pesquisa de anticorpos:
resultado positivo
(fluorescência verde)
Pesquisa de anticorpos:
resultado negativo
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24. Imunocromatografia
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 24

25. Imunocromatografia
 Teste qualitativo
 Detecção antigénios virais ou anticorpos
 Rápido e simples
 Fase móvel: amostra diluida
 Fase sólida: membrana revestida
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26. Imunocromatografia
 Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C
 Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex
 Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis
devido às partículas de látex
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27. ImunoHisto/Citoquímica
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28. ImunoHisto/Citoquímica
 Imunologia e citologia ou histologia
 Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais,
proteínas)
 Diferenças de expressão de proteínas
 Localização celular do antigénio
 Método qualitativo (maior parte dos casos)
 Quantificação relativa
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29. ImunoHisto/Citoquímica
 Método directo
 Ac primário marcado enzimaticamente reage directamente
com o antigénio
 Método Indirecto
 Ac primário que se liga ao antigénio
 Ac secundário marcado enzimaticamente
 Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)
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30. ImunoHisto/Citoquímica
 Principio do método
PO+ H2O2+ Dador de electrões  PO+ H2O2+ precipitado
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31. ImunoHisto/Citoquímica
 Passos importantes
 Fixação (sol. Alcoólica)
 Permeabilizar (detergente)
 Ac primário
 Ac secundário conjugado
 Substrato com agente cromogénio
 Corante de contraste
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32. Imunohistoquímica
 Imunohistoquímica
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33. Imunocitoquímica
 Imunocitoquímica
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34. Análise Proteínas
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35. Western Blot
 SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
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36. Western Blot
 Blotting
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37. Western Blot
 Detecção
1. Bloqueio da
membrana
2. Ac primário
3. Ac secundário
conjugado
4. Detecção
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38. Western Blot
 Aplicação
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39. Virologia
Ano Lectivo 2010/11
Técnicas Diagnóstico
Virologia – Parte I