1. +
Patologia
Infecção HPV
Hugo Sousa
BScH Microbiology
MSc Oncology
PhD Biomedical Sciences
MD Student
_________________________________________
Serviço Virologia – Lab Biologia Molecular
Grupo Oncologia Molecular
IPO Porto FG EPE

2. +
Características Gerais

3. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Vírus com distribuição ubíqua
 Independentemente do género, idade, etnia ou localização geográfica
 Vírus epitelio-mucosotrópico
 Infecta células epiteliais e mucosas

4. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Descritos quase 200 tipos de HPV

5. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Família Papillomaviridae
 Estrutura icosaédrica ( 55nm)

6. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Vírus de DNA cadeia dupla
 Genoma com 8000pb
 positivo
 2 genes estruturais (L1 e L2)
 7 ou 8 genes precoces (E1 a E8)

7. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
GENE FUNCTION
E1 DNA-dependent ATPase, ATP dependent helicasE;
Allow unwinding of the viral genome and act as an elongation factor for DNA replication.
E2 Responsible for recognition and binding of origin of replication. Exists in two forms: full length
(transcriptional transactivator) and truncated (transcriptional repressor). The ratio of these found in the
heterotrimeric complex formed before complexing with E1 regulates transcription of viral genome.
E3 ????
E4 Late Expression: C terminal binds intermediate filament, allowing release of virus-like particles. Also
involved in transformation of host cell by deregulation of host cell mitogenic signalling pathway.
E5 Obstruction of growth suppression mechanisms: e.g EGF receptor; activation of mitogenic signalling
pathways via transcription factors: c-Jun and c-Fos (important in ubiquitin pathway degradation of p53
complex by E6). Inactivation of p21 (p53 induced expression halts cell cycle until DNA is proof-read for
mutations).
E6 Transformation of host cell by binding p53 tumour suppressor protein.
E7 Transforming protein, binds to pRB/p107.
E8 ?????

8. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Baixo-Risco:
 HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89
 Alto-Risco
 HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59
 Provável Alto-risco: HPV26, 53, 66, 68, 73 e 82
 Risco Indeterminado
 HPV30, 32, 34, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85, 87, 90 e 91

9. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
HPV-associated diseases HPV types
Skin w arts 1,2,3,4,7,10,26,27,28,29,41,48,57,60,63,65,75,76,77,78
Epiderm odysplasia verruciform is benign lesions 3,5,8,9,12,14,15,17,19,20,21,22,23,24,25,36,47,49,50
Epiderm odysplasia verruciform is squam ous cell carcinom a
5,8,14,17,20,47
Periungual squam ous cell carcinom a 16,34,35
Laryngeal papillom as 6,11
Oral focal epithelial hyperplasia 13,32
Squam ous cell carcinom a (tonsil) 16,33
Anogenital w arts 6,11,40,42,43,44,54,55,74
Low -grade anogenital intraepithelial neoplasia 6,11,16,18,30,31,33,34,35,39,40,45,51,52,56,57,58,59,61,64,66,67,68,70,71,72,73,74
High-grade anogenital intraepithelial neoplasia 16,18,31,33,34,35,39,45,51,52,56,58,59,68
Squam ous cell carcinom a (cervix m ostly) 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68
Adenocarcinom a (cervix m ostly) 16,18

10. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Baixo-Risco:
 HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89
 Provocam aparecimento de papilomas/verrugas…

11. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Baixo-Risco:
 HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89
 Provocam aparecimento de papilomas/verrugas…

12. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Baixo-Risco:
 HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89
 Provocam aparecimento de papilomas/verrugas…

13. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
 Alto-Risco
 HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59
 Desenvolvimento de lesões baixo/alto grau e cancro

14. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Características Gerais
Yearly Incidence Counts of HPV-Associated Cancers in the United States, 2003–2007

15. +
Infecção

16. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Infecção
 Infecção Basal
 Activação Replicação viral
 E1, E2, E4, E5
 Amplificação Carga viral
 10  1000 cópias/célula
 Maturação vírus
 1-3 semanas
 Desenvolvimento de lesão
 Semanas  Meses

17. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Infecção
 Infecção Basal
 Activação Replicação viral
 E1, E2, E4, E5
 Amplificação Carga viral
 10  1000 cópias/célula
 Maturação vírus
 1-3 semanas
 Desenvolvimento de lesão
 Semanas  Meses

18. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Infecção

19. +
Mecanismo de Carcinogénese

20. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese
Major Events
Escape à Resposta Imunológica
Integração DNA viral no DNA do hospedeiro
Imortalização celular
Instabilidade genómica

21. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese

22. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese

23. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese
Integração Viral
DNA Episomal: expressão de E2 regula a expressão de E6 e E7
DNA integrado: perda de E2 permite expressão desregulada de E6 e E7
Promove
 Inibição replicação viral
 Instabilidade genética
Confere vantagem selectiva para a proliferação de células
Ocorre na maioria dos casos de HSIL
Podem co-existir formas episomais com integradas

24. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese

25. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese – E6
Moody and Laimonis, 2010

26. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese – E7
Moody and Laimonis, 2010

27. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese

28. +
Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Mecanismo de Carcinogénese

29. +
CANCRO COLO DO ÚTERO

30. +
Cancro do Colo do Útero

31. +
Cancro do Colo do Útero
Distribuição Mundial

32. +
Cancro do Colo do Útero
Distribuição Mundial

33. +
Cancro do Colo do Útero
Em Portugal
 4ª neoplasia na mulher
 Neoplasia urogenital
 Alta taxas:
 Incidência 16 / 100 000
 Mortalidade 6 / 100 000

34. +
Cancro do Colo do Útero
Etiologia
 1842 – A culpa era da profissão…
 1901 – A culpa era da religião…
 60s – A culpa era da circuncisão…
 70s – A culpa era dos Herpes…

35. +
Cancro do Colo do Útero
Etiologia
 1980’s – Associação com HPV
 Infecção por HPV é um factor
necessário mas não suficiente
 odds ratio: 60 (95% C.I. 49-73
Prof. Harald Zur Hausen (Nobel da Medicina 2008)

36. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 Desenvolvimento de Lesões Precursoras que podem evoluir para Cancro
Infecção Ca Colo Útero
6 meses 3 anos 6 anos 10 anos

37. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 Colo Útero Normal Normal
Histologia
Citologia

38. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 CIN 1
Histologia
Citologia

39. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 CIN 2
Histologia
Citologia

40. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 CIN 3
Histologia
Citologia

41. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 Carcinoma In Situ
Histologia
Citologia

42. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 Carcinoma Invasor
Histologia
Citologia

43. +
Cancro do Colo do Útero
Patologia
 Carcinoma Invasor

44. +
Métodos de Diagnóstico

45. +
Diagnóstico Infecção HPV
Métodos
 Métodos Indirectos
 Colposcopia
 Teste Papanicolau…
 Serologia….
 Métodos Directos
 Polimerase Chain Reaction (PCR)
 Restriction Fragment Lenght Position (RFLP)
 Reverse Transcriptase – PCR (RT- PCR)
Amplificação
 Real-Time PCR
 Sequenciação
 Captura Híbrida
 Southern Blot
 Hibridização em tiras Hibridização
 CHIPS

46. +
Diagnóstico Infecção HPV
Métodos

47. +
Diagnóstico Indirecto

48. +
Diagnóstico Indirecto
Colposcopia, Papanicolau…
 Teste do Papanicolau
 Detecta células com alterações

49. +
Diagnóstico Indirecto
Colposcopia, Papanicolau…
 Teste do Papanicolau
 Detecta células com alterações
Normal
Alterações celulares

50. +
Técnicas Amplificação

51. +
Técnicas Amplificação
PCR Assays
 Amplificação de um fragmento de DNA especifico;
 Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter
milhões de cópias do fragmento pretendido;
 Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA
de sequência conhecida;
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’
3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
Região Alvo

52. +
Técnicas Amplificação
PCR Assays
 Small portion of genome targeted
 Allows testing of samples with poor quality DNA
 Small changes in virus (variants or integration) may give false negative
results
 Consensus assays
 Generally target L1 region
 Type(s) determined by type specific hybridization, restriction digestion
or sequencing
 Type specific assays
 Generally target E6/E7 region

53. +
Técnicas Amplificação
PCR Assays

54. +
Técnicas Amplificação
PCR Assays
Fig. 1. Outline of the HPV-DNA genome, presented in a linear form. The position of the early (E), late (L) genes and the untranslated region (UTR) is indicated, as
well as the positions of the four most widely used primer sets CPI/II (Tieben et al., 1993), MY09/11 (Hildesheim et al., 1994), GP5+/6+ (Jacobs et al., 1997), SPF10
(Kleter et al., 1998) and Roche Amplicor HPV assay with their respective amplimer sizes (the precise location of the primers, used in the Roche assay is unknown).
The 291 bp fragment used for formal classification of HPV genotypes (Chan et al., 1995; de Villiers et al., 2004) is shown in the L1 region.

55. +
Técnicas Amplificação
PCR Assays
 Primers
 MY09: 5´- CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC – 3´
 MY11: 5`-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG- 3
 São primers degenerados e usam nucleótidos modificados:
 M = A ou C
 R = A ou G
 W = A ou T
 Y = C ou T
 Fragmento de 449pb

56. +
Técnicas Amplificação
Genotipagem
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);
Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela
actividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa
sequência específica)
Presença de polimorfismo → Perda ou ganho de local de restrição
→ Variação no tamanho de fragmentos de DNA.
5’ – (…) ACTGA (…) – 3’
3’ – (…) TGACT (…) – 5’

57. +
Técnicas Amplificação
Genotipagem

58. +
Técnicas Amplificação
Genotipagem
Baixo-Risco
HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89
Alto-Risco
HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 5
Provável Alto-risco
HPV26, 53, 66, 68, 73 e 82
Risco Indeterminado
HPV30, 32, 34, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85, 87, 90 e 91

59. +
Técnicas Amplificação
Genotipagem

60. +
Técnicas de Hibridização

61. +
Técnicas de Hibridização
 Alvo – DNA ou RNA
 Utilização de sondas
específicas
 Possibilidade de diferenciação
entre subtipos de vírus
 Técnicas
 Captura Híbrida
 Hibridização em tiras
 Southern Blotting
 CHIPS

62. +
Técnicas de Hibridização
Captura Híbrida
Principio da técnica
Hibridização de Ácidos Nucleicos
Amplificação sinal por Quimioluminescência
Método semiquantitativo
Método
Hibridização amostras positivas com sondas específicas
Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca
Reacção com anticorpo secundário conjudado com FA
Adição de reagente e detecção por quimioluminescência

63. +
Técnicas de Hibridização
Captura Híbrida
45 minutes
at 65ºC
60 minutes
at 65ºC
15 minutes
30 minutes
60 minutes
agitação

64. +
Técnicas de Hibridização
Southern Blot

65. +
Técnicas de Hibridização
Hibridização em Tiras

66. +
Técnicas de Hibridização
CHIPs
 Tubos ou lâminas com sondas
específicas para cada subtipo;
 Tipagem de vírus:
 HPV, HCV, HIV

67. +
Técnicas de Hibridização
CHIPs

68. +
Técnicas de Hibridização
CHIPs
56
18 66
16

69. +
Casos Clínicos

70. +
Caso Clínico #1
 História Clínica
 37 anos
 Sexo feminino
 Divorciada
 2 filhos
 Bom estado geral
 Queixas principais
 Escorrências esbranquiçadas
 Dor durante acto sexual
 Exame ginecológico
 Colo uterino com zona vermelha
peri-orificial extensa

71. +
Caso Clínico #1
 História Clínica  Diagnósticos Diferenciais
 37 anos  Candidíase
 Sexo feminino
 Herpes Genital
 Divorciada
 2 filhos
 Lesão/Cancro do Colo do Útero
 Bom estado geral
 Queixas principais  Suspeitas
 Escorrências esbranquiçadas
 Vírus do Papiloma Humano
 Dor durante acto sexual
 Candida Albicans
 Exame ginecológico  Herpes simplex 1/2
 Colo uterino com zona vermelha
peri-orificial extensa

72. +
Caso Clínico #1
 Citologia
 Células atípicas
Lesão baixo grau
Citologia

 Raspagens Colo do Útero
 HPV Alto-Risco Positivo
 Herpes Simplex 2 Positivo
Histologia
 Biópsia Colo do Útero
 CIN 2

73. +
Caso Clínico #2
 História Clínica
 8 anos
 Sexo masculino
 Sinais e Sintomas
 Voz ciciada
 Rouquidão
 Odinofagia (dor à deglutição)
 “Respiração rude”

74. +
Caso Clínico #2
 História Clínica  Diagnósticos Diferenciais
 8 anos  Asma
 Sexo masculino  Infecção respiratória
 Cancro da Laringe
 Sinais e Sintomas
 Papilomatose Laríngea
 Voz ciciada
 Rouquidão  Suspeitas
 Odinofagia (dor à deglutição)  Respiratory Syncicial Virus
 “Respiração rude”  Cytomegalovirus
 Influenza virus
 Human Papillomavirus

75. +
Caso Clínico #2
 Sangue – Biologia Molecular
 DNA CMV neg
 DNA RSV neg
 RNA InfA, B, C neg
 DNA HPV neg
 Biópsia
 Lesao papilomatosa/verrucosa
 HPV positivo
Diagnóstico:
Papilomatose laríngea
Human Papillomavirus (HPV)

76. +
Prevenção

77. Como se pode prevenir?
 Castidade!?!?!?
 Abstinência sexual !?!?!?
 Monogamia !?!?!?

78. Como se pode prevenir?
 Uso de Preservativo
É a medida mais eficaz para prevenir DST e travar a sua disseminação, mas não
confere protecção absoluta para a infecção por HPV…
 Exames ginecológicos regulares
 Precauções com parceiros e comportamentos de risco

79. Como se pode prevenir?
 Teste do Papanicolau... Rastreio
o Detecta células com alterações
Início actividade
sexual Anual
< 30 anos
18 21
30
≈ 3/3 anos
Citologia 2/3 anos
≥ 30 anos
30
Citologia +
HPV
3 anos

80. Como se pode prevenir?
Vacinas profiláticas oferecem grandes promessas no futuro…
 Merck® (Gardasil™)
Vacina tetravalente (HPV6, 11, 16 e 18)
 Glaxo SmithKline® (Cervarix™)
Vacina bivalente (16 e 18)

81. Como se pode prevenir?
Vacinas profiláticas em Portugal
•Vacina integrada no Programa Nacional de Vacinação
(Despacho n.º 8378/2008, de 20 de Março)
Merck® (Gardasil™)
Vacina tetravalente (HPV6, 11, 16 e 18)

82. +
Patologia
Infecção HPV
Hugo Sousa
BScH Microbiology
MSc Oncology
PhD Biomedical Sciences
MD Student
_________________________________________
Serviço Virologia – Lab Biologia Molecular
Grupo Oncologia Molecular
IPO Porto FG EPE