‫الشعبية‬ ‫الديمقراطية‬ ‫الجزائرية‬ ‫الجمهورية‬
République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignemen...
Remerciement
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Je remercie d’abord l’encadreur ATHAMENA Ahmed.
Je voudrais remercier profondément mes collègues...
Sommaire
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Liste des abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction
Etude bibliographique
Chapitre ...
Sommaire
5.1.2. Sphingophospholipides………………….…………………………………..…08
6. Métabolisme des glycérophospholipides………….…………………………………...
Sommaire
2.4.2. Protocole expérimental……………………………….…………….………….24
2.5. Séparation des phospholipides par chromatographie su...
Liste des abréviations
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AEP : Amino-Ethyl-Phosphonate
AG : Acide Gras
AP : Acide Phosphatidique
CAEP...
Liste des abréviations
PE : Phosphatidyl Ethanolamine
PEP : Phospho-Enol-Pyruvate
PF : Poids Frais
PI : Phosphatidyl Inosi...
Liste des figures
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Figure 01 : Anatomie des moules…………………………………………………….…..…..03
Figure 02: Structure de l...
Liste des figures
Figure 21: Séparation bidimensionnelle des PL…..…………………………………..…...…28
Figure 22 : Dosage du phosphore l...
Liste des tableaux
Liste des tableaux
Tableau 01 : Systématique de l’espèce étudiée……………………………………………....02
Tableau 02 : Cl...
Introduction
Introduction
Introduction
Les phospholipides constituent la classe la plus importante des lipides polaires, Dans les
alime...
Etude bibliographique
Chapitre 1 : Présentation du modèle biologique
Chapitre 1 Etude bibliographique
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1. Présentation du modèle biologique (Mytilus galloprovincialis)
1.1. Mollusques bivalv...
Chapitre 1 Etude bibliographique
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1.2.2. Anatomie et physiologie
L'anatomie de la moule se représente par deux valves éga...
Chapitre 1 Etude bibliographique
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d'enzymes digestives et stockage de produits de réserve) car il joue chez cet invertébr...
Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Chapitre 2 Etude bibliographique
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1. Définition des lipides
Les lipides sont une classe de biomolécules essentiellement c...
Chapitre 2 Etude bibliographique
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2.3. Digestibilité
Les lipides sont bien digérés et la digestibilité est souvent supéri...
Chapitre 2 Etude bibliographique
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4. Lipides simples
4.1. Acides gras
Les acides gras sont les principaux composés des hu...
Chapitre 2 Etude bibliographique
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Leur nomenclature tient compte des molécules qui entrent en réaction avec le glycérol e...
Chapitre 2 Etude bibliographique
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Figure 04: Structure chimique d’une sphingomyélines à choline (BLEICHER-BARDELETTI
et a...
Chapitre 2 Etude bibliographique
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6.2. Anabolisme
La synthèse des phospholipides nécessite la combinaison d'un diacylgly...
Chapitre 3 : Phosphonolipides
Chapitre 3 Partie bibliographique
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Phosphonates
On appelle "phosphonates" des composés qui possèdent une liaison covalen...
Chapitre 3 Partie bibliographique
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éponges) (MUKHAMEDOVA et GLUSHENKOVA, 2000), bien que ces lipides peuvent
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Chapitre 3 Partie bibliographique
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Figure 07 : Structure des sphingophosphonolipides (SPnL) (HAWTHOORNE et ANSELL,
1982)...
Chapitre 3 Partie bibliographique
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Leur stabilité renvoie à l’inertie chimique due à la présence d’une liaison glycéryle...
Chapitre 3 Partie bibliographique
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Figure10 : Biosynthèse de CAEP (MOSCHIDIS, 1985).
6. Rôles physiologiques
Les rôles e...
Chapitre 3 Partie bibliographique
16
8. Applications
Les analogues synthétiques de glycéro-phospholipides d'origine nature...
Etude expérimentale
Chapitre 1 : Matériels et Méthodes
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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1. Matériels
1.1. Matériels chimiques
Les solvants utilisés dans la partie « analyse bi...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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1.3.2. Nature des tissus et organes étudies
Notre étude sur la moule Mytilus galloprovi...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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Glande digestive Manteau Branchie Muscle
Figure 13 : Prélèvement des tissus de la moule
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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2. Les techniques d’analyses biochimiques
L’extraction et les analyses biochimiques son...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
21
2.1. Extraction des lipides totaux
2.1.1. Principe
Cette technique dérive de la méthode...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
22
2.2. Purification de l'éxtrait lipidique
La purification de l’extrait lipidique est fai...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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2.2.2. Deuxième lavage
Les proportions du Folch 2/1 sont d'abord restaurées par additio...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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2.4. Dosage des phospholipides totaux
2.4.1. Principe
Ce dosage est basé sur la quantif...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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2.4.2.2. Dosage du phosphore minéral
Après minéralisation et refroidissement, on ajoute...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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2.5. Séparation des phospholipides par chromatographie sur couche mince
bidimentionnell...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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Le premier système
Est toujours l'éther di-éthylique seul. Cette première migration per...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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2.5.2.3. Révélation des phospholipides aux vapeurs d’iode
C’est une technique non destr...
Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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2.7. Caractérisation chimique des phospholipides particuliers (phosphonolipides)
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Chapitre 1 Matériel et Méthodes
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Les phosphonolipi...
Chapitre 2 : Résultats et Discussion
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D’après les travaux de (LUBET et al., 1985) Les lipides de la branchie, le manteau e...
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Figure 26: Courbe d'étalonnage de dosage du phosphore lipidique.
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Figure 28: CCM bidimensionnelle des lipides totaux extraits des différents tissus de...
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4. Phosphonolipides chez les autres organismes
Foie de lapin Glande digestive de la ...
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La séparation chromatographique sur couche mince en deux dimensions des extraits des...
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6.2. Révelation par exposition de la plaque aux vapeurs d’iode et au réactif à la
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Chapitre 2 Résultats et Discussion
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Selon (HORI et al., 1968): la plaque CCM 1D des phospholipides d’un mollusque de la
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Chapitre 2 Résultats et Discussion
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D’après les résultats obtenus par (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998) les
phosphono...
Conclusion
Conclusion
Conclusion
Les techniques d’analyse biochimique appliquées ou cours de notre étude, nous permettent de
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Annexes
Annexes
Annexes
Annexe 01 : Plaques témoin CCM 2D pour l’identification des PL (Bodennec et al., 2000)
Annexe 02 : Analyse...
Annexes
Annexe 04 : Analyse de la variance et test de Newman-Keuls avec un intervalle de confiance à 95%
du variable X1.
A...
Références bibliographiques
Références bibliographiques
Références bibliographiques
AARAB N., 2004. Les biomarqueurs chez les poissons et les bivalves...
Références bibliographiques
FISKE H., SUBBAROW Y., 1925. The colorimetric determination of phosphorus. J. Biol.
Chem., 66 ...
Références bibliographiques
LE PENNEC M., et HILY P., 1984. Anatomie, structure et ultrastructure de la branchie d'un
Myti...
Références bibliographiques
MUKHAMEDOVA K. S., GLUSHENKOVA A. I., 2000. Natural phosphonolipids.
Chemistry of Natural Comp...
Références bibliographiques
2. Encyclopédie Microsoft Encarta 2009. Structure de la membrane plasmique.
http://fr.encarta....
‫ملخص‬
‫فئ‬ ‫تعتبر‬ ‫التي‬ ‫الفوسفونوليبيدات‬ ‫تمييز‬ ‫على‬ ‫اهتمامنا‬ ‫ركز‬ ‫الدراسة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ .‫الجزائري‬ ‫الساحل‬ ‫في...
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Caractérisation des phosphonolipides dans les différents tissus de la moule mytilus galloprovincialis

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Les phospholipides constituent la classe la plus importante des lipides polaires, Dans les aliments ils sont omniprésents car ils sont les principaux constituants des membranes des cellules animales et végétales. Leurs propriétés technologiques et biologiques font donc leur importance (RESTUCCIA et al, 2012).
Des études récentes ont montré que les PL peuvent avoir un effet nutritionnel positif sur la santé humaine, tels que la réduction du risque des maladies cardio-vasculaires, et l’amélioration du fonctionnement du cerveau (RESTUCCIA et al, 2012).
Les lipides polaires marins, notamment les phospholipides (PL), retiennent depuis quelques années l’attention des chercheurs et des industriels en raison de leur composition particulière (FANNI et al., 2004).
Certaines classes de phospholipides présentent des particularités structurales telles que la liaison éther et la liaison directe P-C ce qui leur donne des propriétés supplémentaires par rapport aux phospholipides classiques (WEIL, 2006).
Les phospholipides à liaison directe P-C sont appelés des phosphonolipides, Ils sont largement distribuer chez les animaux aquatiques comme les anémones de mer, les méduses, les mollusques bivalves, et presque tous les invertébrés marins (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998).
Les phosphonolipides sont des composés très stables qui, contrairement aux phospholipides esters de glycérol, les phosphonolipides nécessitent des acides minéraux forts et des températures supérieures à 80 C° pour leur hydrolyse (BAER et STANACEV, 1964).
Les analogues synthétiques de glycéro-phospholipides d'origine naturelle doués d’une stabilité biologique possèdent un intérêt considérable en tant qu'agents cliniques et thérapeutiques potentiels (BAER et STANACEV, 1964).
Le mollusque bivalve Mytilus galloprovinicialis a été connu pour contenir des quantités considérables de phosphonolipides (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 2003).
Par conséquent, le but de cette étude est de rechercher la présence éventuelle des phosphonolipides dans les différents tissus de la moule mytilus galloprovincialis.

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Caractérisation des phosphonolipides dans les différents tissus de la moule mytilus galloprovincialis

  1. 1. ‫الشعبية‬ ‫الديمقراطية‬ ‫الجزائرية‬ ‫الجمهورية‬ République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Mohamed Khider Biskra Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie Département des Sciences de la Nature et de la Vie Réf: … .. / . . Mémoire de fin d'études en vue de l’obtention du diplôme de Master Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie Filière : Biologie Spécialité : Biochimie Fondamentale et appliquée Présenté par : SOLTANI Amira. Devant le jury: Président : MOUHAMMEDI Kenza. Promoteur : ATHAMENA Ahmed. Examinateur : BENHARZELLA Naouel. Année Universitaire 2015/ 2016 Caractérisation des phosphonolipides dans les différents tissus de la moule Mytilus galloprovincialis
  2. 2. Remerciement Remerciement Je remercie d’abord l’encadreur ATHAMENA Ahmed. Je voudrais remercier profondément mes collègues pour leur soutien qu'ils m’ont réservé malgré leurs grandes occupations. Mes remerciements les plus sincères s'adressent aux étudiants de troisième année « Biologie et physiologie animale ». J'exprime par ailleurs toute ma gratitude à Monsieur OUAMAN Abdelmoheimin Tarek Chargé d’étude lié à la recherche au Centre de Recherche Scientifique et Technique sur les Régions Arides : CRSTRA. Je tiens d'autre part à remercier les membres du jury Mme MOUHAMMEDI Kenza et Mme BENHARZELLA Naoual pour avoir accepté d’examiner mon travail en commentant, discutant et jugeant. Je tiens à remercier également les ingénieurs du laboratoire de notre département, en leur souhaitant une bonne continuation. Je veux exprimer ma gratitude envers tous ceux qui par leur présence, leur soutien, leur disponibilité et leur conseil, qui mon donner le courage d'accomplir ce projet.
  3. 3. Sommaire Sommaire Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux Introduction Etude bibliographique Chapitre 1 : Présentation du modèle biologique 1. Présentation de modèle d'étude Mytilus galloprovincialis…………………………………02 1.1. Mollusques bivalves ……………………………………………………..…….…....02 1.2. Définition de la moule Mytilus galloprovincialis………………………...…………..02 1.2.1. Systématique ………………………………………………………………..….02 1.2.2. Anatomie et physiologie………………………………………………….......…03 1.2.3. Reproduction ……………………………………………...……………….......04 1.2.4. Habitat ………………………………...………………………………..……….04 1.2.5. Nutrition ……………………………………………………………...………...04 2. Choix et intérêt de la moule Mytilus galloprovincialis …………………………………….....04 Chapitre 2 : Généralités sur les lipides 1. Définition des lipides …………………………………………………………………..….05 2. Intérêt ……………………………………………………………….……………………..05 3. Classification…………………………………………………………………………….…06 4. Lipides simples …………………………………………….……………………………...07 5. Lipides complexes ……………………………….………………………………………..07 5.1 Phospholipides ……………………………….………………………………………07 5.1.1. Glycérophospholipides ………………….…………………………………..…07
  4. 4. Sommaire 5.1.2. Sphingophospholipides………………….…………………………………..…08 6. Métabolisme des glycérophospholipides………….………………………………………09 7. Phospholipides particuliers……………….…………………………………………....... 10 Chapitre 3 : Phosphonolipides 1. Définition des phosphonolipides ………………………………………………………….11 2. Distribution dans la nature………………………………………………………………..11 3. Classification…………………………………………………………………..…………..12 4. Propriétés………………………………………………………………………………….13 5. Métabolisme………………………………………………………………………….……14 6. Rôles physiologiques ……………………………………………………………….….…15 7. Synthèse chimique ………………………………………………………………….….…15 8. Applications…………………………………………………………………………….…16 Etude expérimentale Chapitre1 : Matériels et Méthodes 1. Matériels…...……………………………………………………………………………….17 1.1. Matériels chimiques………………………………………………….……………….17 1.2. Matériel biologique…………………………………………………………….…….17 1.3. Echantillonnage………………………………………………………………….…..17 2. Techniques d’analyses biochimiques…………………..…………..………………….......20 2.1. Extraction des lipides totaux ………………………………..……………………….21 2.1.1 Principe………………………………………………..………………………..21 2.1.2. Protocole expérimental………………….……………………………………..21 2.2. Purification de l'extrait lipidique…………………………………….………...…….22 2.3. Détermination de la quantité des lipides totaux……………………….……….....…23 2.4. Dosage des phospholipides totaux……………………………………….…….……24 2.4.1. Principe…………………………………………………………….………..…24
  5. 5. Sommaire 2.4.2. Protocole expérimental……………………………….…………….………….24 2.5. Séparation des phospholipides par chromatographie sur couche mince bidimentionnelle………………………………………………………………….………..…26 2.5.1. Principe……………………………………………………………………..….26 2.5.2. Protocole expérimental………………………………………………………...26 2.6. Dosage des phospholipides individuels………………………………...……………28 2.7. Caractérisation chimique des phospholipides particuliers (phosphonolipides)…….. 29 2.7.1. Test de méthanolyse alcaline (Saponification)……………………….….…….29 2.7.1.1. Principe ……………………………………………………..…………...29 2.7.1.2. Protocole expérimental……………………………….……….………... 29 2.7.2. Révelation………………………………………………….…….…………….31 3. Analyse statistique……………………………….…………...………….…..…..…..…31 Chapitre 2 : Résultats et Discussion 1. Teneur en lipides totaux dans des différents tissus de la moule ……………..…………..….32 2. Teneur des phospholipids totaux………………………………….…………………….....33 3. Séparation des phospholipides par CCM 2D……………………………….……………..35 4. Phosphonolipides chez les autres organismes…………………………………..………...38 5. Réparition des Phosphonolipides dans les principaux tissus de la moule …….…..……..38 6. Caractérisation chimique des phosphonolipides:……………………………………..…..39 6.1. Test de méthanolyse alcaline (Saponification)…………………………………..….39 6.2. Révélations par exposition de plaque aux vapeurs d’iode et au réactif à la ninhydrine………………………………………………………………………………...….40 Conclusions Annexes Références bibliographiques
  6. 6. Liste des abréviations Liste des abréviations AEP : Amino-Ethyl-Phosphonate AG : Acide Gras AP : Acide Phosphatidique CAEP I : Céramide-Amino-Ethyl-Phosphonate (majeur) CAEP II : Céramide-Amino-Ethyl-Phosphonate (mineur) CCM 1D : Chromatographie sur Couche Mince monodimentionnelle CCM 2D : Chromatographie sur Couche Mince bidimentionnelle CDP-DG : Cytidine-Di-Phosphate Di-Glycéride CMMAEP : Céramide-Mono-Méthyl-Amino-Ethyl-Phosphonate DAG : Di-Acyl-Glycéride DG : Di-Glycéride DO : Densité Optique Doc : Densité Optique corrigée DPG : Di-Phosphatidyl-Glycérol ED : Eau Distillée GPnL : Glycéro-Phosphonolipide LN : Lipide Neutre LPC : Lyso-Phosphatidyl Choline LPE : Lyso-Phosphatidyl Ethanolamine LT : Lipide Totaux P. lip : Phosphore lipidique PC : Phosphatidyl Choline
  7. 7. Liste des abréviations PE : Phosphatidyl Ethanolamine PEP : Phospho-Enol-Pyruvate PF : Poids Frais PI : Phosphatidyl Inositol PL : Phospholipide PLA1: Phospholipase A1 PLA2: Phospholipase A2 PLC : Phospholipase C PLD : Phospholipase D PnL : Phosphonolipide PS : Phosphatidyl Serine SPH : Sphingomyéline SPnGL : Sphingo-Phosphono-Glycolipide SPnL : Sphingo-phosphonolipide TMAEP : Tri-Méthyl-Amino-Ethyl-Phosphonate Vf : Volume du filtrat
  8. 8. Liste des figures Liste des figures Figure 01 : Anatomie des moules…………………………………………………….…..…..03 Figure 02: Structure de la membrane plasmique……………………...……………………..05 Figure 03: Structure des glycérophospholipides……………………………………………..08 Figure 04: Structure chimique d’une sphingomyélines à choline ……………………...……09 Figure 05 : Action des différents phospholipases………………………………………...….09 Figure 06 : Structure des Glycerophosphonolipides……………………….………………...12 Figure 07 : Structure des sphingophosphonolipides ………………………………...……....13 Figure 08 : Structure des sphingophosphonoglycolipides…………………………………...13 Figure 09 : Biosynthèse de l’AEP……………………………………………………………14 Figure 10 : Biosynthèse de CAEP……………………………………………………………15 Figure 11 : Espèce de moule sélectionnée pour l’étude…………………………....…..…….17 Figure 12 : Organes étudiés…………………………………………………………………..18 Figure 13 : Prélèvement des tissus de la moule……………………………………………...19 Figure 14 : protocole général d'analyse des lipides………………………………………….20 Figure 15 : Broyage et filtration des tissus…………………………………………………...21 Figure 16 : 1er lavage par la solution KCl. ………………………………………………….22 Figure 17 : Restauration des proportions chloroforme/ méthanol et 2eme lavage par H2O...23 Figure 18 : Evaporation et conservation des lipides……………………...…………….…...23 Figure 19: Minéralisation acide.. …………………………………...…………......……...…24 Figure 20: Etapes du dosage des PL…………...………...……………………………….….25
  9. 9. Liste des figures Figure 21: Séparation bidimensionnelle des PL…..…………………………………..…...…28 Figure 22 : Dosage du phosphore lipidique. ……………………………...……………...….29 Figure 23: Protocole de saponification………………………...………………………….…30 Figure 24: Révelation à la ninhydrine………………………………………………………..31 Figure 25: Histogramme comparatif des teneurs en lipides totaux dans quatre organes de la moule Mytilus galloprovincialis…………………………………………………………..….32 Figure 26: Courbe d'étalonnage de dosage du phosphore lipidique………...……..….…….33 Figure 27: Teneur en phospholipides totaux dans les différents tissus de la moule Mytilus galloprovincialis, exprimés en g (PL) pour cent g de tissu frais………………………......…34 Figure 28: CCM bidimensionnelle des lipides totaux extraits des différents tissus de la moule Mytilus galloprovincialis après révélation par l’iode……………………………..………….36 Figure 29 : Séparation CCM bidimensionnelle des lipides polaires de Mytilus galloprovincialis. sur gel de silice 60. ……………………………………………………….37 Figure 30: CCM 2D des PL de la glande digestive de la moule et du foie de lapin et de poisson………………………………………………………………………………...…..….38 Figure 31 : Quantité des phosphonolipides dans différents tissus, exprimées en % des phospholipides totaux…………………...…………………………………………………....38 Figure 32: CCM 2D des PL du muscle de la moule avant et après saponification………….40 Figure 33: CCM 1D des PL de l’escargot marin Monodonta labio………………………….41 Figure 34: CCM 1D des lipides polaires de la moule Mytilus galloprovincialis ….......…...42
  10. 10. Liste des tableaux Liste des tableaux Tableau 01 : Systématique de l’espèce étudiée……………………………………………....02 Tableau 02 : Classification des lipides fondée sur la propriété de saponification………...…06 Tableau 03: Composition des systèmes de solvants utilisés pour la séparation des phospholipides par la CCM 2D……………………………………………………………….27 Tableau 04: Densités optiques obtenues en à 830 nm en fonction des quantités du phosphore en (µg). ………………………………………………………………………………….…....33
  11. 11. Introduction
  12. 12. Introduction Introduction Les phospholipides constituent la classe la plus importante des lipides polaires, Dans les aliments ils sont omniprésents car ils sont les principaux constituants des membranes des cellules animales et végétales. Leurs propriétés technologiques et biologiques font donc leur importance (RESTUCCIA et al, 2012). Des études récentes ont montré que les PL peuvent avoir un effet nutritionnel positif sur la santé humaine, tels que la réduction du risque des maladies cardio-vasculaires, et l’amélioration du fonctionnement du cerveau (RESTUCCIA et al, 2012). Les lipides polaires marins, notamment les phospholipides (PL), retiennent depuis quelques années l’attention des chercheurs et des industriels en raison de leur composition particulière (FANNI et al., 2004). Certaines classes de phospholipides présentent des particularités structurales telles que la liaison éther et la liaison directe P-C ce qui leur donne des propriétés supplémentaires par rapport aux phospholipides classiques (WEIL, 2006). Les phospholipides à liaison directe P-C sont appelés des phosphonolipides, Ils sont largement distribuer chez les animaux aquatiques comme les anémones de mer, les méduses, les mollusques bivalves, et presque tous les invertébrés marins (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998). Les phosphonolipides sont des composés très stables qui, contrairement aux phospholipides esters de glycérol, les phosphonolipides nécessitent des acides minéraux forts et des températures supérieures à 80 C° pour leur hydrolyse (BAER et STANACEV, 1964). Les analogues synthétiques de glycéro-phospholipides d'origine naturelle doués d’une stabilité biologique possèdent un intérêt considérable en tant qu'agents cliniques et thérapeutiques potentiels (BAER et STANACEV, 1964). Le mollusque bivalve Mytilus galloprovinicialis a été connu pour contenir des quantités considérables de phosphonolipides (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 2003). Par conséquent, le but de cette étude est de rechercher la présence éventuelle des phosphonolipides dans les différents tissus de la moule mytilus galloprovincialis.
  13. 13. Etude bibliographique
  14. 14. Chapitre 1 : Présentation du modèle biologique
  15. 15. Chapitre 1 Etude bibliographique 2 1. Présentation du modèle biologique (Mytilus galloprovincialis) 1.1. Mollusques bivalves Les mollusques bivalves sont des animaux invertébrés, aquatiques à symétrie bilatérale, Caractérisés par une coquille composée de deux valves calcifiées qui recouvrent les côtés droit et gauche du corps. Les deux valves sont normalement également convexes (CAMPBELL et REECE, 2004). Notre étude a été menée sur une espèce de mollusques bivalves Mytilus galloprovincialis. 1.2. Définition de la moule Mytilus galloprovincialis Mytilus galloprovincialis est une espèce de mollusques bivalves, de la famille des Mytilidés (Tableau 01). 1.2.1. Systématique Tableau 01 : la systématique de l’espèce étudiée (LICHTFOUSE et al., 2011). Règne Animalia Embranchement Mollusca Classe Bivalvia Ordre Mytiloida Famille Mytilidae Genre Mytilus Espèce Mytilus galloprovincialis
  16. 16. Chapitre 1 Etude bibliographique 3 1.2.2. Anatomie et physiologie L'anatomie de la moule se représente par deux valves égales, reliées par un ligament externe, et maintenues par deux muscles adducteurs (GRASSE et DOUMENC, 1998). La coquille est composée à 95 % de carbonate de calcium. Le corps de la moule est entouré par le manteau composé de deux lobes, Ces deux lobes sont soudés dorsalement sauf au niveau du siphon exhalant, ils délimitent alors la cavité palléale (MAISSIAT et al., 1998). Le pied est une saillie musculaire douée d'une grande mobilité (Figure : 01). Le byssus, de nature protéique, est constitué de nombreux filaments très résistants terminés par un disque adhésif (BACHELOT ,2010). Figure : 01 Anatomie des moules (Comité National de la Conchyliculture, 2006). Les organes principaux de la moule sont : Branchies : organe à la fois impliqué dans les processus de respiration et d’alimentation (MARTEIL, 1976). Cet organe joue un rôle primordial dans les activités nourricières. Le captage et le transport des particules nutritives vers les palpes labiaux sont assurés par une ciliature abondante, en rapport avec un développement extraordinaire des mucocytes (LE PENNEC et HILY, 1984). Muscle: la fermeture générale des valves est assurée par deux muscles adducteurs (antérieur et postérieur). Ces muscles relient les deux valves afin de fermer la coquille. Ils travaillent en opposition au ligament qui tend à écarter les valves (PAGLIASSOTI, 1994). Glande digestive : une glande volumineuse, elle assure la digestion et l’absorption des aliments captés par la branchie. Cet organe est encore appelé hépatopancréas (sécrétion
  17. 17. Chapitre 1 Etude bibliographique 4 d'enzymes digestives et stockage de produits de réserve) car il joue chez cet invertébré un rôle analogue au foie des Vertébrés (PAGLIASSOTI, 1994). Manteau : Le manteau des Lamellibranches intervient dans le processus de la calcification de la coquille. Il secrète la trame protéique et les constituants minéraux, La partie centrale se présente comme une mince lame de tissus bordée par deux couches unicellulaires: les épithéliums (ISTIN, 1972). Le manteau a aussi le rôle de support des gonades (BACHELOT, 2010). 1.2.3. Reproduction Chez les moules, les sexes sont séparés et la maturité sexuelle est acquise au bout d'un an. La glande génitale s'étend de façon diffuse dans le manteau. Les gonades sont blanchâtres chez les mâles et jaunes orangés chez les femelles. Les gonades sont constituées d'une multitude de follicules où se forment les ovules ou les spermatozoides (LUBET, 1959). Le cycle sexuel va du repos (au cours duquel l'animal accumule des réserves), à la maturité sexuelle. Lorsque les produits génitaux sont arrivés à maturité, ils sont expulsés dans le milieu extérieur où a lieu la fécondation. La période de reproduction est définie de février à juillet. La larve, de type zooplanctonique, se fixe pour donner l'individu adulte qui, dans la nature, restera fixé (BACHELOT, 2010). 1.2.4. Habitat La moule est originaire de la méditerranée, elle vit à faible profondeur : environ 10 m en dessous, en colonies fixées sur les substrats durs (rochers…) (LICHTFOUSE et al., 2011). 1.2.5. Nutrition La nutrition a un effet important dans la répartition des moules qui prolifèrent généralement dans les zones riches en phytoplancton, en matières organiques dissoutes ou en suspension et en bactéries (AARAB, 2004). 2. Choix et intérêt de la moule Mytilus galloprovincialis D’abord la moule est largement considérée comme de bon bio-indicateur de la contamination du milieu marin (TALEB et BOUTIBA, 2007). Ensuite c’est une espèce d’une importante commerciale dans plusieurs zones de la Méditerranée. Mais les informations sur sa biochimie des lipides sont très rare (PRATO et al., 2010).
  18. 18. Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
  19. 19. Chapitre 2 Etude bibliographique 5 1. Définition des lipides Les lipides sont une classe de biomolécules essentiellement caractérisées par leur grande solubilité dans les solvants organiques et leur faible solubilité dans l’eau, et par leur texture, leur caractère graisseux, huileux et visqueux. Cependant, ils ne présentent pas toujours des analogies de structure (BLEICHER-BARDELETTI et al, 2014). 2. Intérêt 2.1. Maintien des membranes biologiques Les membranes biologiques sont des structures constituées de lipides principalement (des phospholipides), (Figure 02), La notion de vie est indissociable de leur existence (ESTEN, 1979) car elles assurent l’individualité cellulaire et la compartimentation de l’espace cytoplasmique en organites fonctionnellement spécialisés (BASSAGLIA, 2004). Figure 02: Structure de la membrane plasmique (Encyclopédie Microsoft Encarta, 2009). 2.2. Apport énergétique Parmi les macronutriments, les lipides constituent la source énergétique la plus efficace. En effet, les lipides apportent 39,5 kJ pour 1 gramme, Alors que 1 g de protéines n'apporte que 23,7 kJ et 1 g de glucides 17,2 kJ (REGOST, 2001).
  20. 20. Chapitre 2 Etude bibliographique 6 2.3. Digestibilité Les lipides sont bien digérés et la digestibilité est souvent supérieure à 95% quelle que soit leur origine (animale ou végétale). Seuls les lipides à point de fusion élevée sont mal digérés car ils sont solides à basse température (REGOST, 2001). 3. Classification Selon la structure Les lipides sont séparés en deux grandes classes : les lipides simples et les lipides complexes.  Lipides simples : ne contenant dans leur molécule que du carbone, d'oxygène et d'hydrogène (glycérides, cérides et stérides..).  Lipides complexes : sont constitués des mêmes éléments que les lipides simples, mais contiennent en plus au moins un hétéroatome (P ou autre…). Au sein de la classe des lipides complexes, on trouve principalement les phospholipides dont l’hétéroatome est le phosphore. Les PL sont divisés selon la nature du squelette de base en :  Glycérophospholipides : le squelette de base est le glycérol.  Sphingophospholipides : le squelette de base est la sphingosine (LOUISOT, 1980). Les lipides peuvent être aussi classés selon leur réactivité aux alcalis (Tableau 02) Tableau 02 : Classification des lipides fondée sur la propriété de saponification (FRENOT et VIERLING, 2004). La saponification est une réaction chimique représentée par une hydrolyse alcaline en présence d’une base forte comme l’hydroxyde de potassium (KOH) ou l’hydroxyde de sodium (NaOH) (FRENOT et VIERLING, 2004).
  21. 21. Chapitre 2 Etude bibliographique 7 4. Lipides simples 4.1. Acides gras Les acides gras sont les principaux composés des huiles et des graisses alimentaires, Ils sont constitués exclusivement de carbone, d'hydrogène et d'oxygène, Les atomes de carbone sont reliés les uns aux autres par des liaisons simple (AG saturés) ou par des double liaisons (AG insaturés) pour former une chaîne dont la longueur varie de 4 à 26 atomes de carbone (BRISSON, 1982). 4.2. Glycérides Les corps gras alimentaires ne contiennent pratiquement pas d'acides gras à l'état libre, Ils s'y trouvent sous forme de glycérides qui sont constitués d'une molécule de glycérol et des acides gras. Le glycérol est formé d'une chaîne de trois atomes de carbone comportant chacun un groupement hydroxyle (-OH), Ces groupements hydroxyles entrent en réaction avec le groupement carboxyle (-COOH) des acides gras pour former des esters. Sur la molécule de glycérol, Si les trois positions sont occupées par des acides gras: il s'agit donc d'un triglycéride (BRISSON, 1982). 4.3. Cholestérol Le cholestérol est un composé que l'on trouve dans toutes les cellules du corps, Cette molécule est constituée presque exclusivement de carbone et d'hydrogène, Plusieurs atomes de carbone sont reliés les uns aux autres pour former quatre anneaux désignés par les lettres A. B. C. D (BRISSON, 1982). 5. Lipides complexes 5.1 Phospholipides Les phospholipides constituent un groupe important de corps lipidiques; ils ont en commun le fait d'être des di-esters de l'acide phosphorique. 5.1.1. Glycérophospholipides Glycérophospholipides ou Glycérophosphatides: Constituent une grande proportion des phospholipides de l'organisme animal ou végétal.
  22. 22. Chapitre 2 Etude bibliographique 8 Leur nomenclature tient compte des molécules qui entrent en réaction avec le glycérol et l'acide phosphorique. Il y a deux groupements hydroxyles sur la molécule d'acide phosphorique qui peuvent réagir avec des groupements provenant d'autres molécules. Pour un groupe considérable de phospholipides, le groupement OH de l'acide phosphorique entre en réaction d'estérification avec un groupement OH du glycérol. Par ailleurs, l’autre groupement OH de l'acide phosphorique peut entrer en réaction avec le groupement hydroxyle d'autres molécules telles que la choline, l’ethanolamine, la serine et l'inositol (Figure 03). Généralement le glycérol est estérifié par un acides gras saturés en position C1et un acide gras insaturé en C2 (BRISSON, 1982). Figure 03 : Structure des glycérophospholipides (FRENOT et VIERLING, 2004). 5.1.2. Sphingophospholipides Au lieu de réagir avec le glycérol, le groupement OH de l'acide phosphorique peut former un ester avec le groupement OH terminal de la sphingosine. La sphingosine est un composé qui possède une chaîne de 18 atomes de carbone sur laquelle se trouvent une double liaison, deux groupements hydroxyles et un groupement aminé (-NH2) qui va se lié à un acide gras (Figure 04). Par ailleurs, l’autre groupement de l'acide phosphorique entre en réaction d'estérification avec le groupement hydroxyle de la choline, Pour former les sphingomyélines, ainsi appelées par ce qu'elles font partie de la gaine myélinique des neurones (BRISSON, 1982).
  23. 23. Chapitre 2 Etude bibliographique 9 Figure 04: Structure chimique d’une sphingomyélines à choline (BLEICHER-BARDELETTI et al, 2014). 6. Métabolisme des glycérophospholipides 6.1. Catabolisme Les phospholipases constituent un groupe d'enzymes capables d'hydrolyser les phospholipides. Leur classification principale est basée sur leur site d'action sur les phospholipides (Figure 05). Les phospholipases A hydrolysent les chaînes acyles en position C-1 (PLA1) ou en position C-2 (PLA2). Les phospholipases C et D sont des phosphodiestérases. Les PLC hydrolysent la liaison glycérophosphate et génère ainsi un DAG et la tête polaire du PL. (BERRIDGE, 1993) Enfin, les PLD hydrolysent la liaison entre le phosphate et le résidu alcool de la tête polaire du phospholipide, générant l'acide phosphatidique (PA) (FRANSON et al., 1971). Figure 05 : Action des différents phospholipases (FRANSON et al., 1971).
  24. 24. Chapitre 2 Etude bibliographique 10 6.2. Anabolisme La synthèse des phospholipides nécessite la combinaison d'un diacylglycéride ( DAG ) à un alcool. Deux voies de synthèse sont donc possibles : - la voie du CDP-DG, par l'activation du l ; 2- di-glycéride qui conduit aux glycérophospholipides non azotés : phosphatidylinositols, phosphatidylglycérols, cardiolipines. - la voie du CDP-alcool, par activation de l'alcool, Elle conduit aux glycérophospholipides azotés : phosphatidyléthanolamines, phosphatidylcholines et phosphatidylsérine (MOUSSARD, 2006). 7. Phospholipides particuliers 7.1. Alkénylphosphatide (Plasmalogène) Elle se distingue par le fait que l’acide gras en position C1du glycérophosphate est remplacé par un aldéhyde gras lié par une liaison éther-oxyde éthylénique (WEIL, 2006). 7.2. Alkylphosphatide (Etherophosphatide) Elle se distingue par le fait que l’acide gras en position C1du glycérophosphate est remplacé par un alcool gras lié par une liaison éther-oxyde (WEIL, 2006). 7.3. Phosphonolipide Dans la membrane plasmique de divers eucaryotes unicellulaires, les phospholipides classiques sont remplacés presque totalement par des Phosphonolipides, ce type de lipide est caractérisé par une liaison phosphore-carbone. Les phosphonolipides sont insensibles à certaines hydrolases qui dégradent les phosphatides. Ils conferent aux cellules une certaine résistance exogènes vis-à-vis d’agents exogènes (WEIL, 2006).
  25. 25. Chapitre 3 : Phosphonolipides
  26. 26. Chapitre 3 Partie bibliographique 11 Phosphonates On appelle "phosphonates" des composés qui possèdent une liaison covalente phosphore carbone. La démonstration de l'existence de phosphonates naturels remonte seulement en 1959, lors de l’isolement d’un composé phosphoré à partir d’un hydrolysat de protozoaires du rumen et qu’il était résistant à l'hydrolyse chlorhydrique et révélable par la ninhydrine (HORIGUCHI et KANDATSU, 1959). Il s’appelle "ciliatine" cette nouvelle substance et l'identifièrent de l'acide 2 aminoethylphosphonique (2-AEP). Depuis cette date, la ciliatine a été mise en évidence dans un grand nombre d’organismes (TAMARI et al., 1976). Parmi ces phosphonates on trouve les phoshonolipides (ENGEL, 1977). Phosphonolipides 1. Définition des phosphonolipides Ce sont des phospholipides avec une liaison directe entre l'atome de phosphore et l’atome de carbone à la place de la liaison phosphodiester normale (FERGUSON et al., 1982). "Phosphonolipides "est le nom générique appliqué aux lipides complexes comprenant dans leurs molécules un acide aminoéthylphosphonique AEP (H2N-CH2CH2-PO3H2) (MOSCHIDIS, 1985). Le 2-AEP est un analogue phosphonique de phosphatidylethanolamine (FLORIN-CHRISTENSEN, 1986). Les phosphonolipides sont le groupe le plus intéressant des lipides contenant du phosphore Dans ceux-ci l'acide phosphorique (H3PO4) des phospholipides est remplacé par un acide phosphonique RPO (OR’) (OR’’) (BAER et STANACEV, 1964). 2. Distribution dans la nature Les AEP ont été découverts pour la première fois dans les protozoaires ciliés Tetrahynema pyriformis, qui ont été isolés à partir de l’estomac du mouton, Ensuite il a été découvert que cette classe de lipides se produit dans les protozoaires et aussi très largement distribué parmi de nombreuses espèces d'animaux marins principalement les anémones de mer et les mollusques (Le céramide -aminoethylphosphonate, est largement distribué dans les mollusques bivalves (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998) les huîtres et les
  27. 27. Chapitre 3 Partie bibliographique 12 éponges) (MUKHAMEDOVA et GLUSHENKOVA, 2000), bien que ces lipides peuvent également être détectés en quantités infimes dans les tissus de mammifères. Les phosphonolipides ont été détectés dans les bactéries, mais les niveaux trouvés étaient généralement très faibles (HAWTHOORNE et ANSELL, 1982). 3. Classification Les phosphonolipides que l'on rencontre dans la nature peuvent être divisés en trois groupes : glycerophosphonolipides, sphingophosphonolipides, et sphingophosphonoglycolipides (MUKHAMEDOVA et GLUSHENKOVA, 2000). Les glycerophosphonolipides (GPnL) sont des glycérolipides contenant l’aminoethylphosphonates (AEP) (Figure 06), leur présence été initialement démontrée dans le protozoaire, Tetrahymena pyriformis (HAWTHOORNE et ANSELL, 1982). Figure 06 : Structure des Glycerophosphonolipides (MUKHAMEDOVA et GLUSHENKOVA, 2000). Les sphingophosphonolipides (SPnL) ont donné les premières preuves de la présence des phosphonolipides. Au cours d'une analyse de l'anémone de mer, Anthopleura elegantissima le phosphonolipide extrait était identifié comme un céramide aminoethylphosphonate, CAEP (Figure 07). Des travaux ultérieurs ont montré que le CAEP a été largement diffusé dans une variété d'espèces des mollusques bivalves marins et d'eau douce (HAWTHOORNE et ANSELL, 1982).
  28. 28. Chapitre 3 Partie bibliographique 13 Figure 07 : Structure des sphingophosphonolipides (SPnL) (HAWTHOORNE et ANSELL, 1982). Les sphingophosphonoglycolipides sont une classe de phosphonolipide contenant un glycolipide (Figure 08), il est montré qu’il était un 2 AEP céramide galactopyranosyl, Ce lipide a été démontré qu’il contient l'AEP et une chaîne d'oligosaccharides il est répondu chez l'escargot marin (HAWTHOORNE et ANSELL, 1982). Figure 08 : Structure de sphingophosphonoglycolipide (SPnGL) (MUKHAMEDOVA et GLUSHENKOVA, 2000). 4. Propriétés Les phosphonolipides sont des composés très stables qui, contrairement aux phospholipides esters de glycérol, les phosphonolipides nécessitent des acides minéraux forts et des températures supérieures à 80 C° pour leur hydrolyse (BAER et STANACEV, 1964).
  29. 29. Chapitre 3 Partie bibliographique 14 Leur stabilité renvoie à l’inertie chimique due à la présence d’une liaison glycéryle éther dans les glycerophosphonolipides ou en raison de la présence d'acides gras hydroxylés dans les sphingophosphonolipides (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998). 5. Métabolisme Le processus biochimique par lequel l’aminoéthylphosphonate est métabolisé en phosphonolipide est le même dans un organisme où se produit une synthèse de novo de la liaison P-C que dans des tissus susceptibles d’incorporer des composés phosphonés (MAGET-DANA et al., 1973). Il est assez bien établi que la biosynthèse de l'AEP implique des réarrangements intramoléculaires, Le phosphoénolpyruvate PEP donne la 3 phosphonopyruvate 3PP (Figure 09) qui va donner par une transamination la phosphonoalanine puis une décarboxylation vient pour former l’AEP (MOSCHIDIS, 1985). Figure 09 : Biosynthèse de l’AEP (MOSCHIDIS, 1985). La voie la plus probable à suivre pour la formation de céramide-AEP pourrait être une réaction de liaison de base AEP libre et un sphingolipide (Figure 10). Une voie possible de biosynthèse du CAEP est décrite ci-dessous (MOSCHIDIS, 1985).
  30. 30. Chapitre 3 Partie bibliographique 15 Figure10 : Biosynthèse de CAEP (MOSCHIDIS, 1985). 6. Rôles physiologiques Les rôles exacts des phosphonolipides ne sont pas encore bien compris. Les rôles fonctionnels possibles comprennent la contribution à la protection de l'intégrité cellulaire, et par conséquent à la survie des organismes aquatiques. Leur présence joue un rôle vital à l'adaptation de la cellule lorsque les conditions environnementales se changent, Aussi les phosphonolipides ont une capacité à conférer une résistance aux enzymes hydrolytiques, Ils facilitent le transport de petits ions essentiels et participent à des voies métaboliques spécifiques. Aussi ils substituent les sphingomyélines et les gangliosides en quelques organismes. Enfin, ils permettent des inter ou intra-processus de communication ou de reconnaissance (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998). 7. Synthèse chimique Plusieurs di-éther phosphonolipides, membres d'une nouvelle classe de lipides complexes contenant du phosphore avec une ressemblance structurelle aux céphalines, ont été synthétisés (BAER et STANACEV, 1964). La synthèse chimique peut être réalisée comme suit : Le chlorure -Bromoethylchlorophosphonyl réagit avec un dérivé de glycérol diacyle- dipalmitin pour donner le phosphonate qui est ensuite amené à réagir avec le trimethylamine - pour donner le conjugué triméthyle aminoéthylphosphonate TMAEP. La plupart des autres synthèses chimiques des phosphonolipides sont des variantes de ce protocole (BAER et STANACEV, 1964).
  31. 31. Chapitre 3 Partie bibliographique 16 8. Applications Les analogues synthétiques de glycéro-phospholipides d'origine naturelle doués d’une stabilité biologique possèdent un intérêt considérable en tant qu'agents cliniques et thérapeutiques potentiels (BAER et STANACEV, 1964). 8.1. Thérapie génique Les liposomes cationiques à base de phosphonolipides ont été largement utilisés dans les dernières années pour introduire des gènes dans différents types cellulaires afin de traiter les maladies génétiques (FLOCH et al., 1997). 8.2. Thérapie surfactant Les phosphonolipides participent à la synthèse des surfactants exogènes utilisés pour traiter le syndrome de détresse respiratoire (WILLSON et NOTTER, 2011). 8.3. Cancérologie Les alkyle-phosphonates sont une nouvelle classe des agents antinéoplasiques (RIES et al., 1992).
  32. 32. Etude expérimentale
  33. 33. Chapitre 1 : Matériels et Méthodes
  34. 34. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 17 1. Matériels 1.1. Matériels chimiques Les solvants utilisés dans la partie « analyse biochimique » sont de grade analytique et proviennent chez Sigma-Aldrich (Spruce street, St Louis, USA). Toutes les plaques de chromatographie sur couche mince 20*20 cm (support en aluminium) en gel de silice 60 (l’épaisseur du gel est 0.25 mm) proviennent chez Merck (Darmstadt, Allemagne). 1.2. Matériel biologique Notre étude a été menée sur un organisme marin: le mollusque bivalve Mytilus galloprovinicialis, Une espèce largement répandue dans le domaine méditerrano- lusitanien (LUBET, 1976). 1.3. Echantillonnage Un échantillonnage des moules a été effectué pendant l'automne durant le mois de Décember 2015 issues de l'Institut Orca marine Ain Taya Alger, Le choix de station est basé sur la disponibilité des moules. Les échantillons de moules sont prélevés en les détachants des rochers à la main ou à l'aide d'un couteau. Ils sont acheminés au laboratoire dans une glacière avec des pochettes remplies en glaces. 1.3.1. Préparation des échantillons Les moules sont placées dans un récipient en plastique puis on élimine les moules trops fragiles ou endommagées par le changement du milieu (Figure 11). Figure 11 : Espèce de moule sélectionnée pour notre étude (photo originale).
  35. 35. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 18 1.3.2. Nature des tissus et organes étudies Notre étude sur la moule Mytilus galloprovincialis a porté sur les tissus suivants: Glande digestive, Manteau, Branchies et muscles (Figure 12). Figure 12 : Organes étudies (Photo originale) 1.3.3. Prélèvement des organes Pour le prélèvement des organes de la moule, on glisse une lame d’un couteau entre les deux valves, et on coupe juste le muscle adducteur postérieur. Les valves s’écartent légèrement. Les différents organes de moules sont récupérés par dissection dans l’ordre suivants: éliminer premièrement le byssus et le pied puis à l’aide d’une pince on prélève les branchies, le manteau, la glande et finalement les muscles (Figure 13) les tissus sont pesés pour déterminer leur poids frais à analyser. Branchies Manteau MusclesGlande digestive
  36. 36. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 19 Glande digestive Manteau Branchie Muscle Figure 13 : Prélèvement des tissus de la moule
  37. 37. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 20 2. Les techniques d’analyses biochimiques L’extraction et les analyses biochimiques sont réalisées selon le protocole suivant (Figure 14) Résidus lipidiques secs Conservation des LT dans du Benzène/Méthanol (1 :1) Prélèvement des tissus de la moule Peser le poids frais de chaque tissu Purification des LT par un 1ier lavage ¼ de Vf avec Kcl 0,25% et un 2 ième lavage ¼ de Vf avec H2O, décantation T=50C˚ Extraction des LT selon la méthode de Folch et al (1957) 20 ml chloroforme /methanol (2:1) /1g du PF Elimination Evaporation des solvants Phase supérieure hydrophile Séparation des PL par CCM-2D Dosage des PL individuels Test de saponification Teneur des PL Totaux en g/100 g PF Quantités en % de PL totaux Test de la ninhydrine Révélation par les vapeurs I2 CCM-2D Dosage des PL totaux Profil de migration des PL Figure 14 : Protocole général d'analyse des lipides Quantification des LT en g/100 g PF
  38. 38. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 21 2.1. Extraction des lipides totaux 2.1.1. Principe Cette technique dérive de la méthode de (FOLCH et al., 1957) : qui est basé sur l’extraction par un mélange de solvants [chloroforme – méthanol 2 :1 (v/v)], à une température de laboratoire, de la plupart des composés lipidiques présents dans les tissus d’animaux. On utilise 20 ml de cette solution par gramme de tissu frais. 2.1.2. Protocole expérimental 2.1.2.1. Détermination du poids frais des tissus Après la dissection des moules, les quatre tissus sont prélevés, pesés puis fragmentés en petits morceaux, l’opération est répétée trois fois sur tous les tissus. 2.1.2.2. Broyage des tissus Les tissus à analyser sont broyés à l’aide d’un mixeur en présence de Folch 2/1. Après le broyage, le bras du mixeur est rincé avec 10 ml de solution d’extraction qui est ajouté au mélange. Le broyat est transféré dans un flacon en verre de 250 ml (Figure : 15). Il faut agiter les flacons des broyats de temps en temps pour assurer une bonne extraction du matériel lipidique, puis laissé pendant 24 heures à une température de 4C°. Les échantillons sont ensuite filtrés sur un papier filtre avec rinçage du culot par 10 ml de solution de Folch 2/1. Figure 15 : Broyage et filtration des tissus Filtrats Agitation et extraction /24hBroyage des tissus Filtration
  39. 39. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 22 2.2. Purification de l'éxtrait lipidique La purification de l’extrait lipidique est faite par deux lavages successifs visant à éliminer les interférents hydrosolubles non lipidiques. 2.2.1. Premier lavage Il est réalisé par addition d'une solution aqueuse de KCl à 0,25% (m/v), elle est ajoutée au filtrat à raison de 1/4 du volume total de filtrat. Après agitation, on laisse décanter le mélange ou par un passage au bain Marie à 50°C, deux phases distinctes se forment (Figure 16)  Une phase inférieure, chloroformique, contenant les lipides  Une phase supérieure contenant l'eau, le méthanol et les interférants hydrosolubles. Cette dernière est éliminée par aspiration à la trompe à vide. Solution KCl à 0.25 % Deux phases séparéesElimination de la phase Supérieure par la trompe à vide Décantation/passage au bain Marie 50 C˚ Figure 16 : 1er lavage par la solution KCl.
  40. 40. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 23 2.2.2. Deuxième lavage Les proportions du Folch 2/1 sont d'abord restaurées par addition de méthanol absolu (1/3 du volume de filtrat) à la phase chloroformique restante. Le second lavage est alors effectué avec de l'eau distillée, dans les mêmes proportions que le premier lavage (1/4 du volume total). Après agitation, les deux phases sont séparées par décantation, la phase aqueuse supérieure est à nouveau éliminée (Figure17). 2.3. Détermination de la quantité des lipides totaux La phase lipidique lavée est transférée dans des ballons de 500 ml préalablement tarés et les solvants sont évaporés à 50 C° sous vide à l’aide d’un évaporateur rotatif (Figure 18). Des autres évaporations avec 10 ml d'éthanol absolu permettent l'élimination de l'eau résiduelle par formation d'un azéotrope éthanol-eau. La quantité totale des lipides purifiés est finalement déterminée : Après équilibration thermique à la température ambiante, les ballons sont à nouveau pesés. Par différence on obtient le poids de lipides totaux extraits des tissus. Les lipides sont ensuite rapidement dissous dans un mélange de benzène-méthanol 1:1 (v/v), qui permet une conservation sous congélation à -30°C, même pendant de longues durées. Restauration de méthanol Décantation2ieme lavage par H2O La phase chloroformique restante Elimination de la phase supérieure Figure 17 : Restauration des proportions chloroforme/ méthanol et 2eme lavage par H2O. Evaporation Homogénéisation du filtrat par l’éthanol Dissoudre les LT dans Bz/Met Extrait de LT Figure 18 : Evaporation et conservation des lipides ..totaux purifiés.
  41. 41. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 24 2.4. Dosage des phospholipides totaux 2.4.1. Principe Ce dosage est basé sur la quantification par méthode colorimétrique, du phosphore lipidique préalablement libéré par minéralisation acide. Il est basée sur la réduction de l'acide phosphomolybdique par l'acide 1-amino-2-naphtol-4-sulfonique, en milieu sulfurique. Elle comprend deux étapes: - La libération du phosphore lié aux lipides, par minéralisation acide. - Le dosage proprement dit du phosphore minéral. L’absorbance est mesurer à 830 nm contre une gamme étalon comportant 0, 3, 6, 9, µg de phosphore (solution standard de phosphate monopotassique à 6 µg de P/50 µl ED) qui servira à quantifier le phosphore, Elle sera traitée dans les mêmes conditions que les échantillons lipidiques. Cette méthode est mise au point par (FISK et SUBBAROW, 1925). 2.4.2. Protocole expérimental 2.4.2.1. Minéralisation Ce liquide de minéralisation (Un mélange d’acide perchlorique (1 vol.), acide sulfurique (2 vol.), tétroxyde de vanadium (1 g/L de mélange acide)) est ajouté à chaque échantillon de lipides totaux et de gamme étalon, à raison de 0.25 ml par tube. La minéralisation acide s’effectue par chauffage sur bec bensun sous la hotte, jusqu’à l’obtention de fumées blanches. (Figure 19). NB: il faut penser impérativement à évaporer le benzène: méthanol dans lequel sont conservés les lipides, avant la minéralisation. Evaporation du Bz/Mt L’addition de réactif de minéralisation Chauffage au bec bunsen Figure 19: Minéralisation acide.
  42. 42. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 25 2.4.2.2. Dosage du phosphore minéral Après minéralisation et refroidissement, on ajoute à chaque tube 5ml de réactif ANSA donnant avec le phosphore en milieu sulfurique une coloration bleue spécifique (bleu de molybdène) après 10 minutes de chauffage à 100 °C, les tubes sont à nouveau vortexés et l’intensité de la couleur bleue est mesurée au spectrophotomètre à 830 nm (Figure 20). Les Proportions pour 100 ml de réactif:  Mélange ANSA (0,63 g),  Heptamolybdate d'ammonium: (0,2 g)  H2O 100 ml. Le mélange ANSA est obtenu en mélangeant au mortier :  60 g de métabisulfite de sodium.  2 g de sulfite de sodium.  1 g d'acide amino naphtol sulfonique. La teneur en phosphore lipidique des échantillons sont alors calculées à partir de l’equation de la courbe d’étalon. Les résultats obtenus sont ramenés au volume total de l’échantillon (phosphore lipidique total) puis en g/100 g de tissus frais. Les teneurs en phospholipides totaux sont déduites du phosphore lipidique en utilisant la relation suivante: Phospholipides totaux (g) = phosphore lipidique total (g) *27 NB: ce facteur de 27 correspond aux animaux aquatiques. Figure 20: Etapes de dosage des PL Lecture d’absorbanceIncubation100C°/10’Agitation au vortexAjout de solution ANSA
  43. 43. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 26 2.5. Séparation des phospholipides par chromatographie sur couche mince bidimentionnelle Définition La chromatographie est une méthode physique de séparation de mélanges en leurs constituants; elle est basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile. Elle est effectuée surtout en vue d’une analyse pour identifier et quantifier des composés au sein d'échantillons divers (SOLDATI, 2010). 2.5.1. Principe Le support est une plaque sur laquelle a été déposée une couche constituée de fines particules de silice les lipides son déposés au bas de la plaque qui elle-même placée dans une cuve contenant une phase mobile (solvant). La migration correspond à la résultante entre les forces d'entrainement par le solvant et les forces d'adsorption sur le support. Plus le support sera chargé ou polaire en surface, plus son interaction avec le composé sera forte, ce qui limitera sa migration. À l'inverse, un composé non chargé migrera rapidement entraîné par un solvant hydrophobe qui va monter par capillarité. Après réalisation d'une chromatographie monodimensionelle la plaque sera séchée, puis après un basculement de 90°, la plaque est prolongée dans une cuve contenant un deuxième système de solvant et ainsi de suite (BARDELETTI et al., 2014). 2.5.2. Protocole expérimental 2.5.2.1. Dépôts Après concentration éventuelle des lipides par évaporation, le dépôt est réalisé avec une micropipette de 10 µL dans un angle de la plaque à 1.5 cm environ de chacun des bords. Il est effectué sous courant d'air tiède. 2.5.2.2. Systèmes des solvants utilisés La séparation optimale des divers phospholipides met en jeu 3 systèmes successifs de solvants dont la composition est résumée sur le ( tableau 3).
  44. 44. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 27 Le premier système Est toujours l'éther di-éthylique seul. Cette première migration permet de séparer les lipides neutres (qui migrent au front) des phospholipides (qui restent au dépôt). La migration est poussée jusqu’à environ 1cm du bord supérieur de la plaque. Second système ( basique ) Cette seconde migration s'effectue le long d'un axe perpendiculaire au premier et elle est réalisée après séchage rapide des plaques issues du solvant N°= I. Troisième système (acide) appelé ainsi car il contient de l’acide acétique Avant passage dans le système N°= III les plaques sont séchées. La migration s'effectue selon le même axe que pour l'éther di-éthylique. Tableau 03: Composition des systèmes de solvants utilisés pour la séparation des phospholipides par chromatographie bidimensionnelle sur couche mince de gel de silice. Systèmes Composition Proportions volumes respectifs I- Ether di-éthylique 100% 100 II- Mélange basique OH- -Tétrahydrofurane -Acétone -Méthanol -Eau désionisée 50 20 40 6 III- Mélange acide H+ -Chloroforme -Acétone -Méthanol -Acide acétique -Eau désionisée 50 20 10 15 5
  45. 45. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 28 2.5.2.3. Révélation des phospholipides aux vapeurs d’iode C’est une technique non destructive où après contact avec une atmosphère saturée en vapeurs d’iode des plaques obtenues de la migration, les Phospholipides se révèlent en jaune plus ou moins intense par fixation réversible de l’Iode (I2) sur les doubles liaisons (Figure: 21). La coloration est labile et disparaît après élimination des vapeurs d’Iode. 2.6. Dosage des phospholipides individuels La technique est la même pour le dosage du phosphore contenu dans les lipides totaux et celui de chaque phosphonolipide isolé par chromatographie. Après révélation par les vapeurs d'iode, les tâches correspondant aux différents PL sont matérialisées. Pour le dosage du phosphore lipidique. Leurs surfaces sont mesurées avec une grille calibrée, ainsi qu'une portion de gel ne contenant pas de PL (blanc-gel). Cette procédure permet ainsi de corriger une éventuelle contamination par du P contenu dans le gel. Les différentes tâches sont ensuite récupérées dans des tubes à essai pour le dosage du P.lip. (Figure : 22) La correction est faite en utilisant la formule suivante: DO corrigée = DO lue- (DO blanc gel*Surface PL/Surface Blanc gel). Surface PL= surface de chaque spot de phosphatide. Surface Blanc gel= surface de gel sans phosphatide. Dans le cas des phospholipides provenant des plaques, il faut éliminer le gel après réaction colorimétrique par centrifugation à 1500 tours /min (après transfert dans des tubes à hémolyse en verre de 5 ml). Dépôt CCM 2 D Révélation au vapeur d’iode Figure 21: Séparation bidimensionnelle des PL
  46. 46. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 29 2.7. Caractérisation chimique des phospholipides particuliers (phosphonolipides) 2.7.1. Test de méthanolyse alcaline (Saponification) 2.7.1.1. Principe La soude NaOH par son pouvoir à hydrolyser chimiquement les esters de glycerol permet de saponifier les phospholipides classiques, ils sont éliminés au cours des lavages, Seul les molecules non saponifiables restent dans la phase chloroformique (VANCE et SWEELEY 1967). 2.7.1.2. Protocole expérimental On Prélève de 5 à10 mg (7.5 mg) de LT de chaque tissus puis on élimine les solvants par évaporation à l’étuve à 50 C°, après 2 ml de chloroforme et 2 ml de solution de soude méthanolique à 0.6 M sont ajoutés, Après une agitation laisser à la température de laboratoire pendant 1 heure, Puis ajouter 0.23 ml d’acide chlorihydrique concentrer et attendre de 10 à 20 minutes puis 2 ml chloroforme et 1.3 ml ED sont ajoutés, Ensuite agiter et centrifuger et éliminer la phase superieure, laver 2 fois la phase inferieure par 2ml méthanol et 1.5 ml ED, Grattage des spots Récupération dans des tubes à essai Dosage de P .lip Elimination de gel de siliceLecture d’absorbance Figure 22 : Dosage de phosphore lipidique.
  47. 47. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 30 centrifuger et éliminer la phase superieure à chaque fois (Figure: 23) (VANCE et SWEELEY 1967). Prélèvement de de LT 2ml NaOH+agitaion + 1H à la température de laboratoire Évaporation des solvants Ajout de 2 ml de CHcl3 0.23ml HCl/10 à 20’Centrifugation 1500rpm/10’ 2 ml de CHcl3+1.3 ml ED Centrifugation2ml CH3OH + 1.5 ml ED Elimination de la phase supérieure Phase chloroformique lavée Évaporation des solvantsCCM-2D Figure 23: Protocole de saponification
  48. 48. Chapitre 1 Matériel et Méthodes 31 2.7.2. Révelation 2.7.2.1. Exposition de la plaque aux vapeurs d’iode Les phosphonolipides se révèlent en couleur jaune par fixation réversible de l’Iode (I2) sur les insaturatios des AG qui les composent. 2.7.2.2. Réactif à la ninhydrine La ninhydrine donne une coloration pourpre caractéristique des groupements aminés libres et permet de visualiser les phosphonolipides, la PS, PE et leurs dérivés lyso (LPS, LPE). La coloration apparaît après quelques minutes de chauffage à 110°C (Figure: 24) et disparaît spontanément en quelques heures (Waldi, 1962). 3. Analyse statistique Les pourcentages des teneurs en lipides ont été transformés en leur arcsinus avant les analyses statistiques. Les comparaisons entre les moyennes des trois répétitions ont été réalisées à l'aide d’ANOVA à un facteur. Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± l'erreur standard à la moyenne (ESM). Ces analyses ont été effectuées en utilisant le logiciel XLSTAT version 2009. La signification de la différence entre les moyennes est résumée comme suit : p > 0,05 = la différence n’est pas significative. 0.01< P < 0,05 = la différence est significative. 0.001< p < 0,01 la différence est hautement significative. Pulvérisation Chauffage 110C° /3’Ninhydrine Figure 24: Révelation à la ninhydrine
  49. 49. Chapitre 2 : Résultats et Discussion
  50. 50. Chapitre 2 Résultats et Discussion 32 Après l’application de l’étude statistique (le test choisi est L’ANOVA à un facteur), on a obtenu les résultats suivants : 1. Teneur en lipides totaux dans des différents tissus de la moule Mytilus galloprovincialis La figure ci-dessous montre la distribution des lipides totaux (LT) dans les différents tissus de la moule Mytilus galloprovincialis, exprimés en g/100 g de poids frais. Figure 25: Histogramme comparatif des teneurs en lipides totaux dans quatre organes de la moule Mytilus galloprovincialis. L'extraction des lipides totaux dans différents tissus (glande digestive, branchie, muscle, et manteau) réalisée sur la moule Mytilus galloprovincialis a révélé que: dans la glande digestive qu’on retrouve la plus grande quantité de lipides totaux (4.25 % de poids frais). Le manteau est le second site de stockage des lipides (3.06 %). Le muscle et la branchie sont les deux organes les plus pauvres en lipides totaux (les valeurs mesurées dans ces deux tissus sont très proches, elles sont comprises entre 1.97 % et 1.70 de poids frais, respectivement). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± ESM Les lettre a et b indique une différence significative (p < 0,05) voir (Annexe 02). 4,25 3,06 1,97 1,70 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 Glande digestive Manteau Muscle Branchie LTeng%gduPF Tissus a a b b
  51. 51. Chapitre 2 Résultats et Discussion 33 D’après les travaux de (LUBET et al., 1985) Les lipides de la branchie, le manteau et la glande digestive diffèrent dans leurs teneurs, la quantité de lipide dans la glande digestive est de trois à six fois plus que celles du branchies. Cette différence résulte en grande partie des quantités relatives des lipides neutres. La glande digestive contient des quantités plus élevées de lipides totaux (9.97 ± 1.42) et celle du manteau est (3.01 ± 0.28). 2. Teneurs des phospholipides totaux Une gamme d'étalonnage a été établie à partir d’une solution mère de KH2PO4 (6µg de P/50µl ED) à des quantités comprise entre 0 et 9 µg Les densités optiques obtenues en fonction de la quantité du phosphore sont résumée dans le tableau suivant: Tableau 04: Les densités optiques obtenues en à 830 nm en fonction des quantités du phosphore en (µg). Quantités du phosphore en (µg) 0 3 6 9 DO 0 0.547 1 1.508 On trace la courbe d’étalonnage obtenue avec les solutions étalons (Figure 26) et on déduit par interpolation, la quantité du phosphore lipidique.
  52. 52. Chapitre 2 Résultats et Discussion 34 Figure 26: Courbe d'étalonnage de dosage du phosphore lipidique. Y: L’équation de la droite exprimant l’absorbances en fonction des quantités du phosphore en (µg). R2: Coefficient de corrélation. Figure 27: Teneurs en phospholipides totaux dans les différents tissus de la moule Mytilus galloprovincialis, exprimés en g (PL) pour cent g de tissu frais. y = 0,1684x R² = 0,9985 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 2 4 6 8 10 Absorbanceà830nm Phosphore (µg) 1,28 0,92 0,70 0,51 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 Glande digestive Manteau Branchie Muscle PLeng%gduPF Tissus a b b c
  53. 53. Chapitre 2 Résultats et Discussion 35 La conversion du phosphore lipidique en phospholipides totaux montre que, Les teneurs en phospholipides les plus élevées se retrouvent encore dans la glande digestive (1,28 % du poids frais). Le muscle présente les valeurs les plus faibles en PL. Dans le manteau et la branchie, les valeurs exprimées des phospholipides totaux restent très comparables (0.92 et 0.70 % du poids frais, respectivement). Les lettre a et b et c indique une difference hautement significative (0,001< p < 0,01) voir (Annexe 03). Ces résultats sont similaires à ceux qui ont été présenté par (LUBET et al., 1985), où il a trouvé que les teneurs en phospholipides des tissus de cette moule est relativement stable dans la branchie et le manteaux, Il a trouvé des valeurs comprises entre (1,05 et 1,01 % du poids frais respectivement). La teneur en phospholipides totaux la plus élevée est mesurée à 1,69 % du poids frais dans la glande digestive. 3. Séparation des phospholipides par chromatographie sur couche mine bidimensionnelle Les lipides des différents tissus (glande digestive, manteau, branchie et muscle) ont été extraits et purifiés comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Un aliquot de Lipides Totaux (LT) est déposé sur la plaque comme mentionné sur la (figure 28). Les lipides sont successivement séparés dans les systèmes de solvant 1, 2 et 3, Les phospholipides sont révélés par l’Iode (I2), Puis identifier à l’aide d’une plaque CCM 2D témoin voir (Annexe 01). Les composés X1, X2 et X3 qui réagissent positivement à ce réactif vont être définir après leur caractérisation chimique comme étant des phosphonolipides.
  54. 54. Chapitre 2 Résultats et Discussion 36 Figure 28: CCM bidimensionnelle des lipides totaux extraits des différents tissus de la moule Mytilus galloprovincialis après révélation par l’iode. (PC): phosphatidylcholine ; (PE) : phosphatidyléthanolamine ; (PS) : phosphatidylsérine ; (PI) : phosphatidylinositol ; (LPC) : lysophosphatidylcholine ; (LPE) : lysophosphatidyléthanolamine ; (DPG) : diphosphatidylglécérol ou cardiolipine (LN) : ensemble de tous les lipides neutres. Les trois axes de migration : le système 1 dans l'éther diéthylique seul, le système 2 dans le solvant basique (OH- ) et le système 3 dans solvant acide (H+ ).
  55. 55. Chapitre 2 Résultats et Discussion 37 La Figure 28 montre que tous les phospholipides observés chez les mammifères, PC, PE, PI et PS, DPG ainsi que les lysophosphatides LPC et LPE sont également présents chez la moule Mytilus galloprovincialis. Les phospholipides majoritaires PC et PE sont aussi principalement retrouvés chez la moule (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 2003). Les phosphonolipides ont été trouvés également dans les résultats obtenus par (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998) sur les lipides polaires de la moule Mytilus galloprovincialis, Leur plaque CCM 2D a donné presque le même profil de migration. Figure 29 : Séparation CCM bidimensionnelle des lipides polaires de Mytilus galloprovincialis sur gel de silice 60 (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998). Les CAEP I et CAEP II correspond aux phosphonolipides de la classe des sphingophosphonolipides.
  56. 56. Chapitre 2 Résultats et Discussion 38 4. Phosphonolipides chez les autres organismes Foie de lapin Glande digestive de la moule Foie du poisson Figure 30: CCM 2D des PL de la glande digestive de la moule et du foie de lapin et de poisson. D’après la (figure 30) on peut observer que les phosphonolipides ne sont pas détactables que dans la glande digestive de la moule. 5. Répartition des phosphonolipides dans les principaux tissus de la moule Figure 31 : Quantités des phosphonolipides dans différents tissus, exprimées en % des phospholipides totaux. 11,5 9,02 10,6 9,52 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 G. digestive Manteau Muscle Branchie Quntitédesphosphonolipidesen%des PLtotaux Tissus X1 X2 X3a b a a
  57. 57. Chapitre 2 Résultats et Discussion 39 La séparation chromatographique sur couche mince en deux dimensions des extraits des lipides totaux et le dosage des différents phospholipides permettent de montrer que: L’espèce dominante de phosphonolipides est le X1 qui peut correspond au phosphonolipides majeur CAEP I puis avec une moindre mesure le X2, Les quantités les plus faibles sont celle de X3, Ces deux derniers phosphonolipides peuvent correspond aux phosphonolipides mineur CAEP II. Dans tous les tissus, le phosphonolipides X1 est l’espèce dominante est surtout dans la glande digestive et le muscle (11,5 et 10,6) respectivement. Afin de determiner si des differences existent dans la répartition des PnL entre les différents tissus de la moule, un test statistique d'ANOVA à un facteur a été effectué. Les lettres a et b indiquent une difference significative (p < 0,05) voir (Annexe 04). Ces résultats sont en accord avec les travaux de (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 2003) sur la composition et la diversité en sphingophosphonolipides des mollusques comestibles (Mytilus galloprovincialis et Eobania vermiculata), Ils ont trouvé que chez M. galloprovincialis les quantités de CAEP-I et CAEP- II étaient 11,2 et 2,8% des PL totaux respectivement, Or ces valeurs chez E. vermiculata sont le (CAEP- I) = 7.6±0.3 % avec 1.5±0.1% pour le (CAEP-II). 6. Caractérisation chimique des phosphonolipides 6.1. Test de méthanolyse alcaline (Saponification) Le traitement par la base NaOH à révélé que ces molécules X1, X2 et X3 sont des molécules alcalis stable.
  58. 58. Chapitre 2 Résultats et Discussion 40 6.2. Révelation par exposition de la plaque aux vapeurs d’iode et au réactif à la ninhydrine Avant saponification Après saponification. Figure 32: CCM 2D des PL du muscle de la moule avant et après saponification. Les molécules X1 X2 et X3 sont révélables par les vapeurs d’iode après saponification ce qui indique leur stabilité envers la digestion chimique par la base forte (NaOH). Ces molecules reagit aussi positivement au réactif de la ninhydrine ce qui indique qu’ils contient une fonction aminée libre caractéristique de la structure de l’aminoethylphosphonate, Un composé present dans tous les phosphonolipides.
  59. 59. Chapitre 2 Résultats et Discussion 41 Selon (HORI et al., 1968): la plaque CCM 1D des phospholipides d’un mollusque de la classe des gastropoda : Monodonta labio (Un escargot marin) montre que certains PL demeurent stables aux alcalis. Figure 33: CCM 1D des PL de l’escargot marin Monodonta labio (HORI et al., 1968) A, E et F : des phospholipides non identifiés B, Cet D : des phospholipides alcali- stable : B : CMMAEP . C et D: CAEP.
  60. 60. Chapitre 2 Résultats et Discussion 42 D’après les résultats obtenus par (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998) les phosphonolipides de la moule Mytilus galloprovincialis réagit positivement à la ninhydrine. Figure 34: CCM 1D des lipides de M.galloprovincialis (KARIOTOGLOU et MASTRONICOLIS, 1998). Aprés cette caractérisation ont peut dire que les molécules X1, X2 et X3 révélées par les vapeurs d’iode dans les plaques CCM 2D des quatre tissus de la moule mytilus galloprovoncialis sont des phosphonolipides.
  61. 61. Conclusion
  62. 62. Conclusion Conclusion Les techniques d’analyse biochimique appliquées ou cours de notre étude, nous permettent de mettre en évidence les points suivants : dans la glande digestive de la moule Mytilus galloprovincialis qu’on trouve la plus grande quantité de lipides totaux 4.25 % PF puis le manteau avec 3.06 % PF, Le muscle et la branchie sont les deux organes les plus pauvres en lipides . Les teneurs en phospholipids totaux des tissus de la moule sont relativement stables dans le manteau et la branchie (0.92 et 0.70 % du poids frais, respectivement). La CCM 2D montre que tous les phospholipides observés chez les mammifères, PC, PE, PI et PS, DPG ainsi que les lysophosphatides LPC et LPE sont également présents chez la moule. Les molécules X1, X2 et X3 sont également séparées par la CCM 2D. Ces matériaux sont susceptibles d'être des phosphonolipides. Le dosage de ces molécules a montré que l’espèce dominante est le X1 qui peut correspond au phosphonolipides majeur CAEP I, puis avec une moindre mesure le X2 et les quantités les plus faibles sont celle de X3, Ces deux derniers phosphonolipides peuvent correspond aux phosphonolipides mineur CAEP II. La caractérisation chimique a révélé que ces molécules sont des alcali-stables et qu’elles possèdent une fonction aminé libre. Pour dire que ces molécules sont évidemment des phosphonolipides il est recommandé de poursuivre cette caractérisation pour montrer la présence de la liaison directe P-C qui se révèle par le réactif de DITTMER-LESTER après une carbonisation à des températures élevé.
  63. 63. Annexes
  64. 64. Annexes Annexes Annexe 01 : Plaques témoin CCM 2D pour l’identification des PL (Bodennec et al., 2000) Annexe 02 : Analyse de la variance et test de Newman-Keuls avec un intervalle de confiance à 95% du variable LT. Annexe 03 : Analyse de la variance et test de Newman-Keuls avec un intervalle de confiance à 95% du variable PL.
  65. 65. Annexes Annexe 04 : Analyse de la variance et test de Newman-Keuls avec un intervalle de confiance à 95% du variable X1. Annexe 05 : Analyse de la variance et test de Newman-Keuls avec un intervalle de confiance à 95% du variable X2 et X3.
  66. 66. Références bibliographiques
  67. 67. Références bibliographiques Références bibliographiques AARAB N., 2004. Les biomarqueurs chez les poissons et les bivalves: de l'exposition à l’effet et du laboratoire au terrain. Doctorat en sciences du vivant, géosciences, sciences de l'environnement, université bordeaux 1, Talence ,46 p. BACHELOT M., 2010. Contamination de moule (MYTILUS SP) en milieu marin par des substances pharmaceutiques et produits de soin. Thèse de doctorat, Université Montpellier, 60-70 P. BAER E., STANACEV N.Z., 1964. Phosphonolipids. The jornal of biological chemistary, 240, 1, pp 44-48. BASSAGLIA Y., 2004. Biologie cellulaire. 2 edit., Maloine, Paris, 217 p. BERRIDGE MJ., 1993. Cell signaling a tale of two massengers .Nature, 365, pp 388- 389. BLEICHER-BARDELETTI F., DUCLOS B., VAMECQ J., 2014. Biochimie. DUNOD, France, 513 p. BODENNEC J., KOUL O., AGUADO I., BRICHON G., ZWINGELSTEIN G., et PORTOUKALIAN J., 2000. A procedure for fractionation of sphingolipid classes by solid phase extraction on aminopropyl cartridges. Journal of Lipid Research, 41, pp 1524 – 1531. BRISSON G., 1982. Lipides er nutrition humaine. Les presses de l’université LAVAL, France, 172 p. CAMPBELL N., et REECE J., 2004. Biologie. 2 édit., De boeck, Bruxelles, 714-715 p ENGEL R., 1977. Phosphonates as Analogues of Natural Phosphates. Chemical Reviews, 77, 3, pp 349- 367. ESTEN W M., 1979 .Biochimie et biologie moléculaire. Université de Francfort, Allemagne, 345 p. FANNI J., LINDER M., PARMENTIER M,. 2004. Lipides polaires marins. Oléagineux, Corps Gras, Lipides, 2, pp145-150. FERGUSON A. J., ANTHONY K., SNARY D., 1982.The detection of phosphonolipids in the protozoan Trypanosoma cruzi. Biochem. J., 207, pp171-174.
  68. 68. Références bibliographiques FISKE H., SUBBAROW Y., 1925. The colorimetric determination of phosphorus. J. Biol. Chem., 66 pp 375-400. FLOCH V., LE BOLCH G., AUDREZET M.P., FEREC C., 1997. Cationic Phosphonolipids as non Viral Vectors for DNA Transfection in Hematopoietic Cell Lines and CD34+ Cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases, 23, 5, pp 69-87. FLORIN-CHRISTENSEN J., FLORIN-CHRISTENSEN M., Knudsen J., and Rasmussen L., 1986. Phospholipases and phosphonolipids in a ciliate : an attack and defence system. TIBS 11, pp 354-355. FOLCH J., LEES M., STANLAY G.H.S., 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, pp 497-509. FRANSON R., WAITE M., LAVIA M., 1971.Biochemistry, 10, 10, pp 1942-1946. FRENOT M., VIERLING E., 2004. Biochimie des aliments Diététique de sujet bien portant. 2 edit., doin, France,297 p. GRASSE P., DOUMENC D., 1998. Zoologie In : Invertébrés. 6 édit., Masson, Pris, 165,167 p. HAWTHOORNE JN., ANSELL G.B., 1982.Phospholipids. Elsevier, new york, 99 p. HORI T., SUGITA M., ITASAKA O., 1969. Biochemistry of Shellfish Lipids. The Journal of Biochemistry, 65, 3, pp. 451-457. HORIGUCHI M., KANDATSU M., 1959. Isolation of 2- Aminoethane phosphonique acid from rumen protozoa. Nature, 184, pp 901-902. ISTIN M., MASONI A., 1973. Absorption et redistribution du calcium dans le manteau des lamellibranches en relation avec la structure. Calc. Tiss. Res., 11, pp 151-162. KARIOTOGLOU., D.M., MASTRONICOLIS S.K., 1998. Phosphonolipid in mussel Mytilus galloprovincialis. Food Chemistry, 53, pp 888-896. KARIOTOGLOU., D.M., MASTRONICOLIS S.K., 2003. Sphingophosphonolipid molecular species from edible mollusks and a jellyfish. Comparative Biochemistry and Physiology, 136, pp 27–44.
  69. 69. Références bibliographiques LE PENNEC M., et HILY P., 1984. Anatomie, structure et ultrastructure de la branchie d'un Mytilidae des sites hydrothermaux du Pacifique oriental. OCEANOLOGICA ACTA, 7 (4), pp 517-523. LICHTFOUSE E., SCHWARZBAUER J., ROBERT D., 2011. Environmental chemistry for a sustainable world. INRA, UMR Agroecologie, France, 367 p. LOUISOT P., 1980. Biochimie générale et médicale/structurale, Métabolique. 3 edit. , SIMEP, France, 936 P. LUBET P., 1959. Recherches sur le cycle sexuel et 1'émission des gamètes chez les mytilidae et les Pectinidae. Bev Trav Inst.Peche marit., 23,4, pp 390-548. LUBET P., BRICHON G., BESNARD J. Y., ZWINGELSTEIN G., 1985. Composition and metabolism of lipids in some tissues of the mussel mytilus galloprovincialis l (moll. bivalvia) in vivo and in vitro incorporation of 1(3)-[3H]-glycerol.Comp. Biochem. Physiol., 82, 3, pp 425-431. LUBET P., DARDIGNAC M.J. 1976. Technologie de la mytiliculture. HALIOTIS, 5, pp 154-172. MAGET-DANA R., TAMARI M., MARMOUYE J., DOUSTE-BLAZY L., 1973. Incorporation de l’acide 2-aminoéthylphosphonique dans les lipides tissulaires de rat. Eur. J. Biochem., 42, pp 129-134. MAISSIAT J., BAEHR J.C., PICAUD JL., 2005. Biologie animale In : Invertébrés.2 edit., Dunod, paris, 131,137,150 P. MARTEIL L., 1976. Biologie de l'huître et de la moule. Travaux de l’Institut des Pêches Maritimes, 40 (2), pp 149-346. MASATO T., MASAFUMI O., HASEGAWA S., 1976. Etudes sur les Phosphonolipides de la Bile de Bœuf. Agr. BioI. Chem., 40 (10), pp 2057 - 2062. MOSCHIDIS M. C., 1985. Phosphonolipids. Prog. Lip.Res., 23, pp 223-246. MOUSSARD C., 2006.Biochimie structurale et métabolique. 3 edit., de boeck, Bruxelles, 195 p.
  70. 70. Références bibliographiques MUKHAMEDOVA K. S., GLUSHENKOVA A. I., 2000. Natural phosphonolipids. Chemistry of Natural Compounds, 36, 4, pp 329 -341. PAGLIASSOTTI M.J., DAVIS S.N., CHERRINGTON A.D., 1994. The role of the liver in maintening glucose homeostasis, CRC Press, austin, 118 P. PRATO E., DANIELI A., MAFFIA M., BIANDOLINO F., 2010. Lipid and Fatty Acid Compositions of Mytilus galloprovincialis Cultured in the Mar Grande of Taranto (Southern Italy): Feeding Strategies and Trophic Relationships. Zoological Studies ,49(2) pp 211-219. REGOST C., 2001. Effets des lipides sur la qualite nutritionnelle, physique et organoleptique de la chair de la truite fario (salmo trutta) et du turbot (psetta maxima). Doctorat Vie - Agronomie –Santé, Universite de rennes 1, Rennes, 193 p. RESTUCCIA D., SPIZZIRRI U. G., PUOCI F., CIRILLO G., VINCI G., PICCI N., 2012. Determination of Phospholipids in Food Samples. Food Reviews International, 28,1 pp 1-46. RIES U.J., FLEER E.A.M., EIBL H., 1992. Synthesis of alkylphosphonates, a new class of antineoplastic agents. Chemistry and Physics of Lipids, 61 pp 225-234. SOLDATI T., 2010.Travaux pratique de biochimie. Genève, 10 p. TALEB M. Z., BOUTIBA Z., 2007. La moule mytilus galloprovincialis : bioindicatrice de pollution marine – cas du port d’Oran. Sciences & Technologie, (25), pp.59-64. VANCE D.E., SWEELEY C.C., 1967. Quantitative determination of the neutral glycosyl ceramides in human blood. J Lipid Res., 8, pp 621-630. Waldi D., 1962. Preparation and use of spraying reagents. In: Thin Layer Chromatography. Springer, Berlin, 496 p. WEIL J.H., 2006. Biochimie générale.10 edit., Dunod, France , 726 p. WILLSON F., NOTTER H., 2011. The Future of Exogenous Surfactant Therapy. Respiratory care, 56, 9, pp 1369-1388. Sites web : 1. Comité National de la Conchyliculture. 2006. Biologie des moules http://www.coquillages.com/index.php?rub=1&page=42&type=theme&id=40.
  71. 71. Références bibliographiques 2. Encyclopédie Microsoft Encarta 2009. Structure de la membrane plasmique. http://fr.encarta.msn.com/media_461547459_761556947_1_1/Structure_de_la_membrane_pl asmique.html.
  72. 72. ‫ملخص‬ ‫فئ‬ ‫تعتبر‬ ‫التي‬ ‫الفوسفونوليبيدات‬ ‫تمييز‬ ‫على‬ ‫اهتمامنا‬ ‫ركز‬ ‫الدراسة‬ ‫هذه‬ ‫في‬ .‫الجزائري‬ ‫الساحل‬ ‫في‬ ‫البحر‬ ‫بلح‬ ‫نوعية‬ ‫تقييم‬ ‫إلى‬ ‫عملنا‬ ‫يهدف‬‫من‬ ‫ة‬ ‫من‬ ‫أعضاء‬ ‫أربعة‬ ‫في‬ ‫الخاصة‬ ‫الفوسفوليبيدات‬‫الحيوان‬‫الرخوي‬‫الفوسفونوليبيدات‬ ‫قيمة‬ ‫وتحديد‬ "‫غالوبروفونسياليس‬ ‫"ميتيليس‬‫الدسم‬ ‫بإجمالي‬ ‫والع‬ ،‫عباءة‬ ،‫الهضمية‬ ‫الغدد‬ ‫من‬ ‫عينات‬ ‫أخذت‬ ‫لذلك‬ .‫الكواشف‬ ‫مختلف‬ ‫تجاه‬ ‫التفاعل‬ ‫أساس‬ ‫على‬ ‫لها‬ ‫الكيميائية‬ ‫الخواص‬ ‫تحديد‬ ‫ثم‬ ،‫الفوسفورية‬‫ضالت‬ ‫الفوسف‬ ‫الدسم‬ ‫اجمالي‬ ‫قياس‬ ‫ثم‬ ‫ومن‬ ‫الكلية‬ ‫الدهون‬ ‫نسبة‬ ‫إجمالي‬ ‫وتنقية‬ ‫الستخراج‬ ‫مرات‬ ‫ثالث‬ ‫العملية‬ ‫كررت‬ ‫حيت‬ ‫والخياشيم‬‫و‬ ‫فصل‬ ‫تم‬ ‫حيث‬ .‫ورية‬ ‫فوسفون‬ ‫تكون‬ ‫أن‬ ‫يمكن‬ ‫أنها‬ ‫يعتقد‬ ‫مفصولة‬ ‫جزيئات‬ ‫ثالثة‬ .‫بعدين‬ ‫ذات‬ ‫الرقيقة‬ ‫الطبقة‬ ‫على‬ ‫الكروماتوغرافيا‬ ‫بتقنية‬ ‫الفوسفوليبيدات‬ ‫تعيين‬‫وليبيد‬. ‫ات‬‫ثم‬ ‫الجزيئات‬ ‫هذه‬ ‫كمية‬ ‫تحديد‬ ‫تم‬.‫هذه‬ ‫أن‬ ‫النتائج‬ ‫أظهرت‬‫ال‬‫نسب‬ ‫ذات‬ ‫فوسفونوليبيدات‬ ‫الى‬ ‫تنقسم‬ ‫فوسفونوليبيدات‬‫كما‬ .‫منخفضة‬ ‫نسب‬ ‫ذات‬ ‫واخرى‬ ‫عالية‬ ‫ة‬ ‫التحل‬ ‫بين‬‫ي‬‫الفوسفون‬ ‫أن‬ ‫النينهدرين‬ ‫بمادة‬ ‫المعالجة‬ ‫بينت‬ ‫و‬ ‫مستقرة‬ ‫قلوي‬ ‫جزيئات‬ ‫أنها‬ ‫على‬ ‫القلوي‬ ‫بالميثانول‬ ‫ل‬‫حرة‬ ‫أمينية‬ ‫وظيفة‬ ‫لديها‬ ‫وليبيدات‬. .‫مستقرة‬ ‫،قلوي‬ ‫الفوسفونوليبيدات‬ ،‫الفوسفوليبيدات‬ ،"‫غالوبروفونسياليس‬ ‫"ميتيليس‬ ،‫المالحة‬ ‫المياه‬ ‫بحر‬ ‫:بلح‬ ‫المفتاحية‬ ‫الكلمات‬ Résumé Notre travail s'inscrit dans le cadre de la valorisation des moules d’eau de mer de côte algérienne. Au cours de cette étude notre intérêt a porté sur la caractérisation des phosphonolipides une classe particulière de phospholipides dans quatre organes d’une espèce de mollusque bivalve Mytilus galloprovincialis et de déterminer sa quantité par rapport les phospholipides totaux, Puis sa caractérisation chimique en se basant sur la réactivité envers les différents réactifs spécifiques. Pour cela des échantillons de glandes digestive, manteau, muscle et branchie ont été prélevés en triplicata afin d'en extraire et purifier les lipides totaux puis de quantifier la fraction phospholipidique total par un dosage colorimétrique. Les PL ont été identifiés après séparation par chromatographie sur couche mince en deux dimensions. Trois molécules séparées: X1, X2 et X3 on pense qu’elles peuvent être des PnL. Puis un autre dosage colorimétrique va quantifier ces molécules. Les résultats montrent que les quantités mesurées en X1 sont élevées dans les quatre tissus mais les quantités de X2 et X3 Semble plus faibles, Le traitement des échantillons des lipides par la méthanolyse alcaline montre qu’ils sont des molécules alcali-stables, Ensuite la révélation à la ninhdrine va prouver qu’ils ont une fonction aminée libre. Mots clés : moules d’eau de mer, Mytilus galloprovincialis, phospholipides, phosphonolipides, alcali-stables. Summary Our work aims to valorize water Algerian coast Sea mussels. In this study our interest focused on the characterization of phosphonolipids a particular class of phospholipids in four organs from bivalve molluscs Mytilus galloprovincialis and determine its amount over the total phospholipids, then its chemical characterization based on the reactivity towards various specific reagents. For that samples of digestive glands, mantle, muscle and gill were taken in triplicate to extract and purify the total lipid fraction and then quantifying the total phospholipid by a colorimetric assay. PL were identified by separation on thin layer chromatography in two dimensions. Three molecules: X1, X2 and X3 is believed that they can be PnL. Then another colorimetric assay will quantify these molecules. The results show that the measured quantities X1 were hight in the four tissues but the quantities of X2 and X3 seems lowest. Lipids treatment by alkaline methanolysis shows that they are alkali-stable molecules, then the revelation by ninhdrine reagent will prove that they have a free amino function. Keywords: saltwater mussels, Mytilus galloprovincialis, phospholipids, phosphonolipids, alkali-stable.

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