Procesamiento de muestras destinadas a estudio inmunohistoquimico cromogenico

1. Procesamiento de
muestras para estudio
inmunohistoquímico
cromogénico
Santiago Sepúlveda
Jorge Gatica

2. Objetivos
 Conservar la inmunorreactividad de células y
tejidos
 Conservar la localización antigénica.
 No provocar interferencia con los
procedimientos inmunohistoquímica (IHQ)
 Preservar la morfología del tejido

3. Tipos de muestras para estudio
IHQ
 CÉLULAS DE CULTIVO
 CÉLULAS EN SUSPENSIÓN
 FROTIS CITOLÓGICOS
 FROTIS SANGUÍNEOS
 CORTES EN CRIÓSTATO
 CORTES EN PARAFINA
 CORTES ULTRAMICRÓTOMO

4. Procesamiento de muestras
incluidas en parafina para IHQ
cromogénica
ETAPAS A CONSIDERAR:
 FIJACIÓN
 IMPREGNACIÓN / INCLUSIÓN
 CORTE Y MONTAJE
 RECUPERACION DE INMUNOREACTIVIDAD
 BLOQUEO DE PEROXIDASA ENDOGENA Y
REACTIVIDAD INESPECIFICA
 INCUBACION CON ANTICUERPOS Y SISTEMA
DE DETECCIÓN

5. Fijación
 Detener los procesos de autólisis.
Especialmente la acción de proteasas y
nucleasas
 Conservar la cito-histoarquitectura de la
muestra similar a su estado “in vivo”.
 Preparar al tejido para los procedimientos
posteriores
 Anti-microbiano

6. Fijación con formaldehido
 Fijador más utilizado  Formalina neutra
10% pH 7,0
 La fijación involucra una interacción con
proteínas, específicamente con aminoácidos
básicos, con formación de puentes
metilénicos.
 Provoca enmascaramiento de antígenos
(Ag.), perjudicando la inmunotinción.
 Requiere de recuperación antigénica.

7. Aclaramiento e impregnación en
parafina
 Agente “aclarante” en buen estado
 Temperatura de las parafinas de
impregnación entre 56 -62°C.
 Tiempo de impregnación entre 30 –45
minutos en cada parafina.

8. Corte y montaje.
 Grosor recomendado:4 –5 µm.
 Montaje en portaobjetos previamente
silanizados.
 Evitar cortes con melladuras, irregularidades,
gruesos o desgarrados.

9. Recuperación de
inmunoreactividad
 El formaldehido y otros reactivos forman
enlaces cruzados intra e inter-proteicos que
enmascaran a los epítopos originando falsos
negativos.
 Los métodos de recuperación están
designados para romper lo enlaces cruzados,
desenmascarando los epítopos y
aumentando la intensidad de las
inmunotinciones.

10. Recuperación antigénica
mediante calor (HIER)
 El más utilizado
 Incubación de placas en buffer (citrato pH 6,0
o EDTA pH 8,0)
 Llevar a temperatura de 90°C aprox. con
fuente de calor (sea vaporera, olla a presión o
microondas) por un tiempo aprox. de 25 min.

11. Bloqueo de peroxidasa endógena
y de reactividad inespecífica
 Necesarios para resultados óptimos en IHQ
cromogénica. Evitan falsos positivos.
 Bloqueo de peroxidasa endógena 3% H₂O₂
NECESARIA SI SE USA HRP COMO ENZIMA
EN LA REACCIÓN CROMOGÉNICA.
 Bloqueo de reactividad inespecífica 
PBS/BSA al 2,5%.

12. Incubación con Ac. primario
 Anticuerpo (Ac.) especifico para el antígeno a
estudiar.
 Debe ser compatible con el sistema de
detección a utilizar posteriormente.
 En ocasiones, puede tener conjugado el
sistema de detección.

13. Demostración de reacción Ag-Ac
mediante uso de enzimas
 La enzima está activa
 Va conjugada al componente del penúltimo
paso de la inmunotinción
 La actividad de la enzima se revela mediante
un sustrato y un cromógeno.

14. Incubación con anticuerpo
secundario
 Reconoce al anticuerpo primario
 Suele estar conjugado con biotina, con el
sistema de detección o utilizarse como
puente.

15. Sistema de amplificación
 Amplifica la señal de la reacción ag.-ac.