 Investigadores estudiaron los efectos morfológicos y fisiológicos de células epiteliales de cáncer de próstata humano cultivadas con y sin células estromales del mismo origen, usando un modelo de co-cultivo representativo del tumor original.  En co-cultivo, las células epiteliales mostraron prolongaciones digitiformes y mayores niveles sostenidos de secreción de PSA, y una mayor tasa de proliferación en respuesta a andrógenos, en comparación con cultivos

1. International Journal of Andrology, 28, 39–46. 2005
SECRECIÓN DE ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO,
ACTIVIDAD PROLIFERATIVA
Y RESPUESTA A ANDRÓGENOS DE CO-CULTIVOS
DE CÉLULAS EPITELIALES-ESTROMALES
DERIVADAS DE CÁNCER PROSTÁTICO HUMANO
ENRIQUE CASTELLÓN, KARINA VENEGAS, LEONARDO SÁENZ, HÉCTOR CONTRERAS
and CHRISTIAN HUIDOBRO
Physiology and Biophysics Program, Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine,
University of Chile, and Urology Department, Clinic Hospital J.J., Aguirre, University of Chile,
Chile
Tutor
Dr. Enrique Castellón
Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Curso de Microscopía Electrónica
Presentador
Kenneth Walker

2. INTRODUCCIÓN
 Con un estimado de 258.000 muertes para el 2008, el CaP
se convierte en la sexta causa principal de muerte por
cáncer en los hombres a nivel global.
 En Chile, se estima que actualmente más de 1.700
pacientes mueren anualmente debido a este cáncer
 El diagnóstico precoz mejora el pronóstico del paciente.
Sin embargo, esto resulta complicado principalmente por la
ausencia de síntomas en las etapas iniciales de la patología.

3.  El tratamiento para CaP es la prostectomía. Sin embargo,
más del 30% de los pacientes vuelven a padecer cáncer
después de la cirugía.
 Intentando comprender la mecánica del desarrollo del CaP,
investigadores plantean la existencia de una relación
paracrina entre las células epiteliales y estromales en el
contexto del CaP.
 Sin embargo, trabajan con líneas derivadas de metástasis
que podrían no ser fielmente representativas de los eventos
reales en el desarrollo del tumor primario en la próstata.

4. OBJETIVO GENERAL
Estudiar los efectos morfológicos y fisiológicos en células epiteliales
provenientes de CaP humano cultivadas en presencia y ausencia de
células estromales del mismo origen usando un modelo de estudio
representativo del tumor original.
Objetivos específicos
 Determinar la secreción de PSA, la respuesta hormonal y
la actividad proliferativa en células epiteliales provenientes
de CaP humano en presencia (co-cultivo) y ausencia de células
estromales.
 Describir las características morfológicas ultraestructurales
de las células epiteliales provenientes de CaP humano
cultivadas en presencia (co-cultivo) y ausencia de células
estromales.

5. MATERIALES Y MÉTODOS

6. Próstatas obtenidas de
prostectomías radicales a
pacientes del hospital institucional
Retirar tejido
hiperplásico
Muestras recibidas en medio de
cultivo estéril con inhibidores de
RNasa
60
min.
De las próstatas adquiridas,
se tomaron 8
Inclusión en parafina
A cada una se les realizo una evaluación
histopatológica por medio de la determinación de
un score de Gleason.
Score
4-6

7. Trozos de tejido prostático de
1mm3
45 min.
a 37ºC
Medio de cultivo para eliminar a las
células sanguíneas indeseadas.
Se van recolectando
las células estromales
dispersadas
Lavado con agua y agitación y luego
una digestión en:
 Colagenasa (2,5mg/mL)
 Hialuronidasa (1mg/mL)
 Desoxirribonucleasa (0,01 mg/mL)
Agregados de células epiteliales
Colagenasa por otras 8-12 hrs.
2-3 hrs.
a 37ºC

8. Las células epiteliales agrupadas fueron lavadas y
puestas en placas de cultivo
Las células estromales agrupadas fueron lavadas
y puestas en placas de cultivo

9. Transferrina humana
Insulina
Factor de crec. epidermal
Vitamina A y E
Hidrocortisona
Selenito de sodio
Dihidrotestosterona
Co-cultivos de células
epiteliales y estromales
método de Janecki y
Steinberger (1987)
B
A
C
D
Esquema del sistema bicameral. Las células epiteliales (C) fueron cultivadas en
una cámara con fondo de PET translúcido (B). Las células estromales (D) fueron
cultivadas en una placa de cultivo común (A).

10. MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA

11. Muestra de co-cultivo y cultivo
células epiteliales
60
minutos
a T°
ambiente
Glutaraldehído al 4% en buffer fosfato 100mM, pH 7,4.
Post-fijación con tetróxido de osmio al 1%.
Deshidratación en etanoles de concentración ascendente
Inclusión en Epón 812

12. Microfotografía obtenida por medio
de
microscopio
electrónico
de
transmisión (MET) para el análisis
de la morfología ultraestructural de
las células epiteliales en un sistema
de co-cultivo.
(A) Microfotografía de bajo aumento
que muestra la relación que se
establece
entre
las
células
epiteliales derivadas de CaP de
citoplasma granular y homogéneo.
Destacan las interdigitaciones entre
las membranas de las células
vecinas.
(B, C) Microfotografías tomadas con
alto aumento con la intención de
revelar
los
detalles
ultraestructurales
de
las
prolongaciones de membrana de las
células
epiteliales.
Las
prolongaciones
digitiformes
contienen
un
citoplasma
sin
variantes con respecto al resto de la
célula.

13. 
Aquellas células epiteliales que se co-cultivaron con células
estromales, presentaron prolongaciones digitiformes que
normalmente no se observan en cultivos sin células estromales.

Por lo que la aparición de estas estructuras depende de alguna
manera de la presencia de las células estromales y esto en parte,
permite evidenciar que ocurren interacciones paracrinas.

Las estructuras observadas podrían relacionarse con propiedades
invasivas y metastásicas de las células tumorales epiteliales.

Esta observación puede impulsar futuros estudios que podrían
ayudar a comprender mejor el origen de estos cambios en el
citoesqueleto de la célula epitelial durante el desarrollo del CaP.

14. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

15. Secreción de PSA en cultivos de células epiteliales y estromales de CaP humano. Las células epiteliales
y estromales fueron aisladas y cultivadas por separado. Ambos cultivos se mantuvieron en presencia de 10 nM
de DHT. La secreción de PSA se evaluó cada 48 hrs. en ambos cultivos. (A) Corte histológico de tejido
prostático representativo del grado de diferenciación del adenocarcinoma usado para estos experimentos
(score de Gleason 4-6). (B,C) Gráficos de barras que entregan información relevante acerca de la secreción de
PSA en el cultivo de células estromales (B) y en cultivos de células epiteliales (C).

16. Secreción de antígeno prostático específico en co-cultivos. Los co-cultivos se mantuvieron en presencia
de 10 nM de DHT. Las mediciones de PSA se hicieron cada 48 hrs. (A) Imagen de corte histológico de tejido
prostático que indica el grado de diferenciación del tumor que se utiliza para estos experimentos (Gleason 46). (B) Gráfico de barras que entrega información respecto a la secreción de PSA en el sistema de co-cultivo.
Los niveles de PSA detectados en el medio de cultivo fueron significativamente mayores y sostenidos que en
los cultivos exclusivamente de células epiteliales.

17. Respuesta a andrógenos por parte del cultivo de células prostáticas . La secreción de PSA fue evaluada en ausencia y
presencia de diferentes concentraciones de dihidrotestosterona (DHT) (1-100 nM). Los niveles de PSA se evaluaron en el medio de
cultivo cada 48 h. (A) Imagen de un corte histológico de tejido prostático representativo del tumor utilizado en estos experimentos
(Score Gleason 4-6). (B) La secreción de PSA en cultivos exclusivos de células epiteliales no muestra efectos relacionados al DHT.
(C) la secreción de PSA en co-cultivos bicamerales aumenta significativamente por la presencia de cualquiera de las concentraciones
de DHT probados.

18. Evaluación de la tasa de proliferación celular de los cultivos de células epiteliales vs.
co-cultivos en sistema bicameral a través de espectrofotometría. Se aprecia un aumento
significativo en los co-cultivos. Los valores representan la media ± la desviación estándar de
seis experimentos diferentes. Inserto: curva de calibración que grafica el número de células
epiteliales/cm3 en función de la densidad óptica expresada en nanómetros (nm).

19. INMUNOCITOQUÍMICA PARA
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

20. Cultivos en portaobjetos
30
minutos
a T°
ambiente
Paraformaldehído al 3% + Sucrosa al 2% en PBS
Bloqueo con PBS + Glicina 20mM y albúmina de suero bovino
Anticuerpos primarios específicos preparados en conejo contra
 Antígeno tumoral de CaP (PCTA-1) para identificar células epiteliales
 Vimentina para identificar células estromales
Anticuerpos secundarios contra conejo
conjugados con FIT-C

21. Fotografías de Inmunocitoquímica aplicada a los cultivos celulares. Las células fueron tratadas con
anticuerpos contra PCTA-1 y vimentina los que se detectaron con IgG conjugadas con FITC. (A, C) Fotografías
tomadas a bajo aumento que muestra la mayoría de las células fuertemente marcadas. (B, D) Fotografías
tomadas a alto aumento que muestran la distribución de la fluorescencia en la célula.

22. Referencias
1. Castellón E, Venegas K, Sáenz L, Contreras H, Huidobro C. Secretion of
prostatic specific antigen, proliferative activity and androgen response in
epithelial-stromal
co-cultures
from
human
prostate
carcinoma.
International journal of andrology. 2005.
2. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM. GLOBOCAN
2008 v2.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase
No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on
Cancer; 2010.
3. Celià-terrassa T, Meca-cortés Ó, Mateo F, Paz AM De, Rubio N, Arnal-estapé
A, et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of
human epithelial tumor-initiating cells. Journal of Clinical Investigation.
2012.