Rapport de stage :
Synthèse supportée de peptides pour la mise au
point d’un test enzymatique impliquant les L,D-
transpep...
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TABLE DES MATIERES
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REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier Monsieur Fonvielle pour m’avoir accueillie, pour l’aide qu’il m’a
apporté et pour la ...
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ABREVIATIONS
Aa = acide aminé
ACN = acétonitrile
Ala = alanine
Asp = acide aspartique
Bn = benzyle
DCM = dichlorométhane...
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I/ INTRODUCTION
A/ Contexte biologique
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Figure 12 : Purification du tripeptide D-LacOBn-L-Ala-D-iGlu-L-Lys(D-iAsp) par HPLC en phase
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III/ CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Durant ce stage, j’ai pu me familiariser avec les techniques de synthèse sur support
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L-Lys(ivDde)-D-iGlu-
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résine de départ)
Fmoc-D-Lac-OBn
MW=180.2 g.mol-
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n= 0.2 mmo...
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V. Lavollay, M et al. 2011. J. Bacteriol 193 :778-782 ; Gupta, R et al, 2010, Nat. Med.
16 :466-469
VI. http://cultures...
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  1. 1. Rapport de stage : Synthèse supportée de peptides pour la mise au point d’un test enzymatique impliquant les L,D- transpeptidases de Mycobacterium tuberculosis Léa DERNIAME L2 Sciences pour la santé Responsable du stage : Matthieu FONVIELLE INSERM UMRS 1138-EQUIPE 12 Du 26/05/2015 au 03/07/2015
  2. 2. 2 TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS ....................................................................................................................... 3 ABREVIATIONS............................................................................................................................ 4 I/ INTRODUCTION....................................................................................................................... 5 A/ Contexte biologique ...................................................................................................... 5 B/ Objectifs du stage .......................................................................................................... 7 C/ Synthèse sur support solide........................................................................................... 8 II/ RESULTATS ET DISCUSSION..................................................................................................14 III/ CONCLUSION ET PERSPECTIVES..........................................................................................18 IV/ PARTIE EXPERIMENTALE.....................................................................................................18 V/ BIBLIOGRAPHIE....................................................................................................................24
  3. 3. 3 REMERCIEMENTS Je tiens à remercier Monsieur Fonvielle pour m’avoir accueillie, pour l’aide qu’il m’a apporté et pour la gentillesse et la pédagogie dont il a fait preuve durant ce stage. Je remercie aussi fortement Madame Ethève-Quelquejeu pour m’avoir conseillée et recommandée pour ce premier stage. Enfin je remercie toute l’équipe du laboratoire pour leur sympathique accueil qui a rendu mon stage extrêmement agréable.
  4. 4. 4 ABREVIATIONS Aa = acide aminé ACN = acétonitrile Ala = alanine Asp = acide aspartique Bn = benzyle DCM = dichlorométhane ivDde = 1-(4-4-dimethyl-2,6-dioxacyclohexylidene)3-methylbutyl DIC = diisopropylcarbodiimide DIEA = N,N-diisopropylethylamine DMF = N,N-dimethylformamide Fmoc = fluorénylméthoxycarbonyl GlcNAc = N-acétylglucosamine iAsn = iso-asparagine iAsp = acide iso-aspartique iGln = iso-glutamine iGlu = acide iso-glutamique HOAt = 1-hydroxy-7-aza-1H-benzotriazole HOBt = 1-hydroxybenzotriazole HPLC = high-performance liquid chromatography K-Oxyma = 2-Cyano-2-(hydroxyimino)acetic acid ethyl ester Lac = lactoyl Lys = lysine Méso-DAP = acide méso-diaminopimélique MurNAc = acide N-acétylmuramique TFA = trifluoroacetic acid TIPS = triisopropylsilane
  5. 5. 5 I/ INTRODUCTION A/ Contexte biologique Le peptidoglycane est un élément essentiel de la paroi de la bactérie. Cette macromolécule sert de protection contre la pression osmotique du cytoplasme, donne sa forme à la bactérie et permet l’incorporation de macromolécules à sa surface I . C’est un polymère complexe constitué de longues chaînes glycanes reliées entre elles par des chaînons inter-peptidiques. Chez les bactéries à Gram négatifs, le peptidoglycane est constitué d’une seule couche alors que chez les bactéries à Gram positifs, cette partie de la paroi est beaucoup plus épaisse. La synthèse du peptidoglycane peut se résumer en deux grandes étapes : une étape cytoplasmique qui permet la formation d’un précurseur disaccharide pentapeptidique (UDP-MurNAc-pentapeptide) et une étape à la surface de la bactérie où les transglycosylases II et les transpeptidases III incorporent les nouvelles sous unités au peptidoglycane préexistant. Les transglycosylases et les transpeptidases sont les cibles des deux familles d’antibiotiques majeurs : les glycopeptides et les β-lactamines. Les glycopeptides inhibent les réactions de transpeptidation et de transglycosylation par encombrement stérique alors que les β-lactamines inactivent les transpeptidases en formant un acyl-enzyme entre le cycle β-lactame de l’antibiotique et le résidu catalytique de la protéine. Pour survivre en présence de ces antibiotiques, les bactéries ont développé des mécanismes de résistance qui posent de graves problèmes de santé publique. Le laboratoire d’accueil travaille à la compréhension de ces mécanismes de résistance et a récemment mis en évidence l’existence d’une nouvelle classe de transpeptidases (L,D-transpeptidases) permettant à certaines bactéries de contourner la voie classique de transpeptidation catalysée par les D,D-transpeptidases (voir Figure 1). Chez Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose, le peptidoglycane est formé majoritairement par L,D-transpepdidation IV ; V . La particularité de la paroi de M. tuberculosis fait de la voie des L,D-transpeptidases une cible potentiellement intéressante pour le développement de nouveaux antituberculeux. Le but de ce stage est de synthétiser les substrats de différentes L,D-transpeptidases afin de comprendre leur mécanisme catalytique.
  6. 6. 6 O OH OH HN O O CH3 O HO OH HN O OH O O NH CH3 C O NH CH C H2C OH O H2C C O NH HC C (CH2)4-NH2 O HN HC CH3 C O HN HC CH3 C OHO GlcNAc MurNAc OH CH3 O NH CH3 C O HN CH C H2C OH O H2C C O NH HC C (CH2)4-NH2 O NH HC CH3 C O NH HC CH3 C OHO D-Lac L-Ala1 D-iGlu2 L-Lys3 D-Ala4 D-Ala5 GlcNAc-MurNAc-pentapeptide D-Lac-pentapeptide NH2 NH2 D,D-transpeptidase L,D-transpeptidase (sérine catalytique) (cystéine catalytique) 1 2 3 4 5 1 2 3 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Dimère tétra-tri (Pont 4-3) Donneur Accepteur Ala Ala Ala Ala D-Ala D-Ala Ala iGlu Lys iGlu Ala Lys Ala iGlu Lys Ala iGlu Lys Ala iGlu iGlu Ala Ala iGlu LysLys Lys iGlu Lys Ala Dimère tri-tri (Pont 3-3) GlcNAc-MurNAc GlcNAc-MurNAc GlcNAc-MurNAc GlcNAc-MurNAc GlcNAc-MurNAc GlcNAc-MurNAc GlcNAc-MurNAc GlcNAc-MurNAc A B Figure 1 : (A) Structure du précurseur du peptidoglycane GlcNAc-MurNAc-pentapeptide et structure de son analogue simplifié D-Lac-pentapeptide. (B) Réactions catalysées par les D,D- transpeptidases et les L,D-transpeptidases. Les D,D-transpeptidases utilisent un disaccharide pentapeptidique donneur d’acyle (GlcNAc-MurNAc-L-Ala1 -D-iGlu2 -L-Lys3 -D-Ala4 -D-Ala5 par exemple) comme premier substrat. La sérine catalytique de l’enzyme attaque le groupement carbonyle de la fonction amide reliant D-Ala4 à D-Ala5 pour former une liaison ester reliant l’enzyme à la D-Ala4 du donneur (l’espèce formée par l’enzyme liée au peptide est appelée acyl-enzyme). La formation de cette liaison ester s’accompagne de la rupture de la liaison D-Ala4 -D-Ala5 (d’où la dénomination D,D-transpeptidases). La fonction carbonyle de cette fonction ester est ensuite attaquée par l’amine de la chaine latérale de l’acide aminé en position 3 d’un peptide accepteur (GlcNAc-MurNAc-L-Ala1 -D-iGlu2 -L-Lys3 ) pour former un dimère tétrapeptide-tripeptide. Le pont inter-peptidique formé se faisant entre l’acide aminé 4 du donneur d’acyle et l’acide aminé 3 de l’accepteur, il est dit de type 4-3. Dans le cas des L,D- transpeptidases, le peptide donneur d’acyle est un tétrapeptide et l’acide aminé catalytique est une cystéine (formation d’une liaison de type thioester). La formation de cette liaison s’accompagne de la rupture de la liaison L-Lys3 -D-Ala4 , d’où le nom de L, D-transpeptidases.
  7. 7. 7 Le dipeptide formé est un dimère tripeptide-tripeptide lié par les acides aminés en position 3 du donneur et de l’accepteur, le pont inter-peptidique est alors de type 3-3. Selon l’espèce bactérienne ou la phase de croissance de la bactérie, la nature des acides aminés qui composent les précurseurs peut varier. Les acides aminés en positions 1, 4 et 5 sont respectivement une L-Ala et deux D-Ala et l’acide aminé en seconde position peut être amidé ou non (D-iGln ou D-iGlu). Le troisième acide aminé peut être un acide méso-diaminopimélique (méso-DAP) ou une L-Lys. Chez les bactéries à Gram positif, cette L- Lys est libre ou fonctionnalisée par de courtes chaines peptidiques dont la séquence varie en fonction de l’espèce (D-iAsp chez Enterococcus faecium, L-Ala-L-Ala chez Enteroccocus faecalis et (Gly)5 chez Staphyloccocus aureus par exemples). B/ Objectifs du stage L’objectif de mon stage est de synthétiser différents substrats accepteurs des L,D- transpeptidases de différentes bactéries de façon à étudier leur mécanisme catalytique. Les substrats des L,D-transpeptidases synthétisés durant ce travail seront utilisés pour mettre au point un test enzymatique permettant de suivre les réactions de L,D-transpeptidation in vitro pour différentes espèces bactériennes. Pour faciliter la synthèse des peptides, la partie disaccharidique (GlcNAc-MurNAc) des molécules sera remplacée par un groupement D- lactoyl (D-Lac) dont la structure est décrite en Figure 1A. Les peptides synthétisés comporteront les modifications suivantes : l’acide aminé en position 2 sera une iso- glutamine (iGln) ou un acide iso-glutamique (iGlu). L’acide aminé en position 3 sera une lysine libre ou fonctionnalisée par les différents acides aminés composant les chainons inter-peptidiques de E. faecium, E. faecalis et S. aureus (voir Figure 2).
  8. 8. 8 Figure 2 : Structure des différents peptides à synthétiser. Les peptides encadrés correspondent à ceux synthétisés durant ce stage. C/ Synthèse sur support solide 1/ Principe général La synthèse peptidique sur support solide est réalisée de la partie C-terminal vers la partie N-terminal du peptide. Comparativement à la synthèse en ballon classique, cette technique permet de simplifier les étapes de purification des déprotections et des couplages peptidiques permettant d’augmenter le rendement global de la synthèse. Le principe de la synthèse sur support solide est décrit dans la Figure 3. Le premier acide aminé est fixé à la résine de Wang par sa fonction acide carboxylique et sa fonction amine est protégée par un groupement Fmoc. La fonction amine est libérée en milieu basique pour réagir avec la fonction acide carboxylique d’un deuxième acide aminé, elle-même protégée par un groupement Fmoc. A chaque étape de déprotection et de couplage, la résine est filtrée puis lavée abondamment avec différents solvants afin d’éliminer les réactifs en excès et les sous-produits des réactions. Ce cycle de déprotection/couplage peptidique est répété jusqu’à l’obtention du peptide d’intérêt. La dernière étape de la synthèse consiste à décrocher le peptide de son support solide dans des conditions acides. Les acides aminés portant des chaines latérales pouvant réagir durant la synthèse (acides carboxyliques, amines, alcools…) sont protégés par des groupements
  9. 9. 9 protecteurs stables dans les conditions de déprotection des groupements Fmoc et clivables dans les conditions de décrochage du peptide de la résine. O OH HN O O R1 Fmoc-Aa1 Résine de Wang O HN O O R1 O O Fmoc-Aa1-Wang O H2N R1 O O Aa1-Wang OH N R1 O O R2 O N H O O OH N R1 O O R2 O N H H2N O R3 N H O O R2 OH O Aa3-Aa2-Aa1-Wang Fmoc-Aa2 FmocAa2-Aa1-Wang OH N R1 OH R2 O N H H N O O R3 R4 HO peptide Aa4-Aa3-Aa2-Aa1 HO O couplage déprotection clivage Figure 3 : Principe général de la synthèse sur support solide VI en stratégie Fmoc. 2/ Peptides cibles La structure de l’ensemble des acides aminés utilisés pour la synthèse des peptides d’intérêt est décrite dans la Figure 4. Les acides aminés qualifiés d’ « iso–acides aminés » sont reliés à la lysine (L-Lys3 ) via la fonction acide carboxylique de leur chaine latérale. La fonction acide carboxylique principale et sa version amidée sont protégées respectivement par les groupements tert-butyle (tBu) et trityl (Trt) clivables en milieu acide. Ils sont donc éliminés en une seule étape lors du clivage de la résine. Le résidu D-Lac est protégé par un groupement benzyle (Bn) stable en milieu basique et en milieu acide. Sa déprotection s’effectue par hydrogénation catalytique en présence d’un catalyseur métallique (palladium) après le clivage du peptide de la résine. Le laboratoire d’accueil ne disposant pas du matériel permettant cette étape d’hydrogénation, cette réaction est effectuée dans un laboratoire de chimie organique de l’université Paris V Descartes, partenaire du laboratoire d’accueil.
  10. 10. 10 Figure 4 : Structure des acides aminés protégés utilisés pour la synthèse des peptides La Lys3 porte deux fonctions amines qui doivent être protégées par des groupements protecteurs orthogonaux. Il est en effet nécessaire de déprotéger sélectivement l’une ou l’autre de ces deux fonctions pour pouvoir synthétiser indépendamment le tripeptide principal et le chaînon inter-peptidique. Nous avons choisi le ivDde comme groupement protecteur de la chaine latérale de la lysine (voir Figure 5) et le Fmoc comme groupement protecteur de la fonction amine principale. Le ivDde est un groupement stable dans les conditions de déprotection des groupements Fmoc et est hydrolysé en conditions nucléophiles compatibles avec les groupements protecteurs Trt, tBu et Boc VII . Ces conditions sont également compatibles avec la résine de Wang et ne provoquent pas le clivage du peptide. Fmoc-L-Lys(NHivDde) Wang FmocHN H C C CH2 O O CH2 CH2 CH2 HN O O O Figure 5 : Structure de la résine de Wang Fmoc-L-Lys(ivDde)
  11. 11. 11 3/ Déprotection de la fonction amine Les groupements Fmoc sont clivés en milieu basique par un mélange à 20% de pipéridine dans la DMF. Le mécanisme de cette réaction est donné dans la Figure 6. Le sous- produit de la réaction est un adduit Fmoc-pipéridine soluble dans la DMF et facilement éliminé par filtration. De façon à ce que la totalité de l’amine soit libérée, 3 étapes de déprotection sont réalisées successivement. N H O O NH Fmoc-Aa H N H O O CH2 N CO2 COOH R COOH R H2N COOH R Acide aminé H N Adduit Fmoc-pipéridine H Figure 6 : Mécanisme de déprotection de la fonction amine par la pipéridine 4/ Couplage peptidique Le mélange réactionnel est composé d’un excès d’agent de couplage (diisopropylcarbodiimide, DIC), d’un additif (le K-oxyma) et de l’acide aminé protégé par un groupement Fmoc. K-oxyma est une alternative non explosive à HOBt et HOAt VIII , il est vendu sous forme anhydre et permet d’obtenir des taux de couplage plus importants et une racémisation beaucoup plus faible comparativement à HOBt et HOAt. Pour avoir un rendement de couplage le plus élevé possible, on utilise un excès d’acide aminé (3 équivalents) et d’agents de couplage. La réaction se fait dans de la DMF anhydre distillée sous vide extemporanément. On effectue une étape de pré-activation de l’acide aminé par le DIC et le K-oxyma avant d’ajouter le mélange réactionnel à la résine préalablement lavée
  12. 12. 12 par de la DMF anhydre. Le mélange est agité à température ambiante pendant 4h. Le mécanisme de couplage peptidique est décrit dans la Figure 7. FmocHN N O K-Oxyma N C N NC COOEt R2 O O KFmocHN R2 O O N NH FmocHN R2 Aa1-Wang O H2N R1 O O H N H O O N C N DIC R2 O O H O N H N H H O N NC COOEt O N O K-Oxyma NC COOEtO H N R1 O OFmocHN O R2 Fmoc-Aa2 Fmoc-Aa2-Aa1-Wang Figure 7 : Mécanisme de couplage d’un acide aminé par le système DIC/K-oxyma IX Après chaque étape de couplage, la résine est rincée avec de la DMF et du DCM anhydres puis séchée sous vide. De façon à savoir si la réaction s’est faite correctement, on prélève après chaque couplage un échantillon de la résine pour effectuer une analyse HPLC. Quelques billes de résine sont alors incubées 1h en présence d’une solution de TFA à 50% dans le DCM additionnée de 5% de TIPS et de 5% de H2O. Après évaporation sous vide, l’échantillon est dilué dans une solution d’eau et d’acétonitrile puis injecté en HPLC. 5/ Déprotection de la chaine latérale de la lysine L’amine de la chaine latérale de la lysine est libérée en milieu nucléophile fort par une solution d’hydrazine à 2% dans la DMF. L’hydrazine étant également une base, il est important que cette étape de déprotection s’effectue après la synthèse de la chaine principale du peptide. Cette partie du peptide se terminant par un groupement D-LacOBn, la molécule ne possède pas de groupements Fmoc susceptibles d’être hydrolysés en milieu basique. Le mécanisme de déprotection de la fonction ivDde est décrit dans la Figure 8. Les
  13. 13. 13 cycles de couplages et de déprotections sont ensuite répétés jusqu’à ce que le peptide soit complet. H2N NH2 Hydrazine NH O O OH N (CH2)4 O O R R-Lys(ivDde)-Wang NH O O H N (CH2)4 R'R O H2N NH2 NH2 O H N (CH2)4 R'ROHNHN H O H2O NHN R-Lys-Wang Figure 8 : Mécanisme de déprotection du ivDde par l’hydrazine X 6/ Clivage de la résine Le clivage final de la résine consiste à décrocher le peptide de son support en incubant la résine dans une solution de TFA à 50% dans le DCM (le mécanisme de ce clivage est décrit en Figure 9). Cette solution de clivage est complémentée par 5% d’eau et 5% d’un piégeur de radicaux libre, le triisopropylsilane (TIPS) qui va servir à inactiver le radical hautement réactif provenant de la déprotection du groupement trytil. Après l’incubation, le filtrat est récupéré et les solvants et le TFA sont évaporés sous vide. Les peptides ne pouvant être précipités dans l’éther à cause de leur petite taille, nous avons effectué une étape supplémentaire d’extraction liquide-liquide afin d’éliminer les sous-produits hydrophobes de la déprotection XI . Le résidu est dilué dans 5 mL d’une solution d’acide acétique à 10% et les sous-produits hydrophobes sont extraits au chloroforme (2x 5 mL). La solution aqueuse contenant le peptide est alors lyophilisée, purifiée par HPLC et les différentes fractions sont analysées par spectrométrie de masse.
  14. 14. 14 Figure 9 : Mécanisme du clivage de la résine de Wang par le TFA II/ RESULTATS ET DISCUSSION Pour pouvoir synthétiser les différents peptides en parallèle, nous avons choisi de faire la synthèse en deux étapes. Une première étape a consisté à effectuer la synthèse d’une quantité importante de résine de Wang portant la chaine principale du tripeptide D- LacOBn-L-Ala-D-iGln-L-Lys. Après cette étape, la résine a été séparée en deux lots pour synthétiser le tripeptide sans chaine latérale et le tripeptide portant la chaine latérale L-Ala- L-Ala. Durant les synthèses, nous avons observé l’apparition d’un nombre de pics de plus en plus important lors des étapes successives de couplages. L’analyse du peptide résultant du clivage de la résine après la synthèse de la chaine principale D-LacOBn-L-Ala-D-iGln-L-Lys nous a permis de voir que le couplage de la L-Ala n’était pas complet. L’analyse de la fraction principale contenant le peptide obtenu par HPLC préparative nous a révélé la présence d’une impureté correspondant au peptide D-LacOBn-D-iGln-L-Lys (voir Figures 10A et 10B). De la même façon, l’analyse de la fraction principale du peptide portant la chaine latérale L-Ala-L-Ala nous a montré que le peptide d’intérêt était bien présent mais qu’il était accompagné d’impuretés correspondant au peptide d’intérêt tronqué de 1, 2 ou 3 résidus alanines. Pour séparer le peptide d’intérêt de ces impuretés nous avons adapté le gradient de purification et obtenu la molécule recherchée (voir Figures 11A et 11B). L’étape de couplage avec l’acide aminé L-Ala étant problématique, nous avons modifié notre protocole de synthèse pour améliorer le rendement de ces étapes. Nous avons effectué trois étapes successives de couplage de la L-Ala pour synthétiser le peptide
  15. 15. 15 D-LacOBn-L-Ala-D-iGlu-L-Lys(D-iAsp) Cette modification du protocole de couplage nous a permis d’obtenir le peptide d’intérêt avec une bonne pureté (voir Figures 12A et 12B). Figure 10 : Purification du tripeptide D-LacOBn-L-Ala-D-iGln-L-Lys par HPLC en phase inverse (A) Chromatogramme de la purification sur colonne préparative. (B) Chromatogramme de la fraction d’intérêt analysée par HPLC analytique. Le peptide d’intérêt est indiqué par une flèche rouge. Le pic c correspond au peptide tronqué de 1 alanine et le pic a correspond à une impureté que l’on retrouve systématiquement lors de toutes les purifications et dont D-LacOBn-L-Ala-D-iGln-L-Lys-OH -500 0 500 1000 1500 2000 2500 0 200 400 600 800 1000 mAU Volume (mL) 100% 80% 60% 40% 20% 0% %B -200 -100 0 100 200 300 400 0 10 20 30 40 50 60 70 mAU Temps (min) 100% 80% 60% 40% 20% 0% %B A B a b c
  16. 16. 16 on ignore encore la nature. Figure 11 : Purification du peptide D-LacOBn-L-Ala-D-iGln-L-Lys(L-Ala-L-Ala) par HPLC en phase inverse (A) Chromatogramme de la purification sur colonne préparative. La flèche indique la fraction contenant le peptide d’intérêt. (B) Chromatogramme de la fraction d’intérêt analysée par HPLC analytique. Le peptide d’intérêt est indiqué par une flèche rouge. Les pics b, c et f correspondent à des peptides tronqués de 1, 2 ou 3 alanines. Le pic a correspond à l’impureté retrouvée systématiquement lors de toutes les purifications. -100 100 300 500 700 900 0 10 20 30 40 50 60 mAU Temps (min) 100% 80% 60% 40% 20% 0% %B -500 0 500 1000 1500 2000 2500 0 200 400 600 800 1000 1200 mAU Volume (mL) 100% 80% 60% 40% 20% 0% %B a bc d e f peptide A B D-LacOBn-L-Ala-D-iGln-L-Lys-(L-Ala-L-Ala)-OH
  17. 17. 17 Figure 12 : Purification du tripeptide D-LacOBn-L-Ala-D-iGlu-L-Lys(D-iAsp) par HPLC en phase inverse (A) Chromatogramme de la purification sur colonne préparative. (B) Chromatogramme de la fraction d’intérêt analysée par HPLC analytique. Le peptide d’intérêt est indiqué par une flèche rouge.et le pic a correspond à l’impureté retrouvée systématiquement lors de toutes les purifications. -100 100 300 500 700 900 0 10 20 30 40 50 60 mAU Temps (min) 100% 80% 60% 40% 20% 0% %B -500 0 500 1000 1500 2000 2500 0 200 400 600 800 1000 mAU Volume (mL) 100% 80% 60% 40% 20% 0% %B A B D-LacOBn-L-Ala-D-iGlu-L-Lys-(D-iAsp)-OH a b
  18. 18. 18 III/ CONCLUSION ET PERSPECTIVES Durant ce stage, j’ai pu me familiariser avec les techniques de synthèse sur support solide, de purification HPLC et d’analyse par spectrométrie de masse. J’ai compris qu’il était primordial de travailler en milieu anhydre pour obtenir des taux de couplage élevés. Il est aussi très important d’obtenir d’excellents rendements à chaque étape de couplage pour maximiser le rendement global de la synthèse peptidique. J’ai synthétisé quatre peptides qui ont été caractérisés par spectrométrie de masse. Après hydrogénation des groupements benzyles, ces molécules ont été testées avec succès comme substrats des L,D-transpeptidases. Ces premiers résultats ont permis de confirmer que la partie disaccharidique (GlcNAc-MurNAc) des substrats naturels n’est pas essentielle pour l’activité des L,D-transpeptidases. Des études plus poussées sont en cours afin de déterminer l’impact des modifications chimiques introduites sur la catalyse enzymatique. La capacité de ces enzymes à utiliser ces différents peptides accepteurs permettra de comprendre les déterminants moléculaires importants pour la réaction de L,D- transpeptidation. La suite de ce travail consistera à synthétiser les peptides avec les acides aminés D-iGlu et D-iGln et portant des chaines latérales penta-glycine. IV/ PARTIE EXPERIMENTALE La DMF a été distillé sur tamis moléculaire 4 Å et sous pression réduite afin d’obtenir de la DMF anhydre. Le DCM a été distillé sur CaCl2 à pression atmosphérique et sous atmosphère inerte (azote). Les acides aminés commerciaux ont été obtenus chez Bachem et les résines chez Novabiochem (Merck-Millipore). L’acide aminé Fmoc-D-iGln-NHTrt a été synthétisé par l’équipe du professeur Mélanie Ethève-Quelquejeu (Université Paris V Descartes). L’ensemble des produits utilisés ont été utilisés sans autres purifications. Taux de greffage de la résine de wang 0,69mmol de la résine de Wang Fmoc-L-Lys correspondent à 1g de résine pesé. Avant utilisation, la résine est pesée puis mise à gonfler dans la DMF pendant au moins 1 heure. Hydrolyse du groupement Fmoc
  19. 19. 19 72 mg (0.05 mmol) de résine sont incubés 3x pendant 7 min à température ambiante avec 2 mL d’une solution de pipéridine à 20% (v/v) dans de la DMF anhydre. La résine est ensuite filtrée et lavée par 5x 2 mL de DMF anhydre, 3x 2 mL de DCM anhydre puis séchée sous vide. Note : Lors de la déprotection finale des peptides portant une chaine latérale, le lavage final est modifié de la façon suivante, 5x par 10 mL de DMF, 5x par 10 mL de méthanol et 5x par 10 mL de DCM. Couplage peptidique Le mélange de couplage composé de 3 Eq d’acide aminé, de 3 Eq de K-oxyma, de 3 Eq de DIC et de 6 Eq de DIEA est dilué dans un petit volume de DMF (1 mL). Après incubation 4h à température ambiante, la résine est filtrée, lavée par 5x 2 mL de DMF anhydre, 3x 2 mL de DCM anhydre puis séchée sous vide. Notes : Lors du dernier couplage, le lavage final est modifié de la façon suivante, 5x par 10 mL de DMF, 5x par 10 mL de méthanol puis 5x par 10 mL de DCM. Lors du couplage de l’acide aminé Fmoc-D-iGln-NHTrt, seulement 1,5 Eq d’acide aminé sont utilisés car il s’agit d’un acide aminé synthétisé et non acheté. Lors du couplage de l’acide aminé Fmoc-L-Ala- OH, plus d’équivalents d’acide aminé (10 Eq) sont utilisés à cause des problèmes de couplages mis en évidence lors des synthèses. Déprotection de la fonction ivDde La résine est incubée 3x pendant 7min en présence de 3.3 mL d’une solution d’hydrazine à 2% dans de la DMF. Elle est ensuite filtrée et lavée à la DMF anhydre (5x 2mL) et au DCM anhydre (3x 2 mL) Clivage de la résine La résine est incubée pendant 1h en présence de 2 mL de solution de TFA à 50% dans le DCM complémentée par 5% (v/v) de TIPS et 5% (v/v) d’eau. Elle est ensuite transférée dans un ballon où les solvants et le TIPS sont évaporés sous pression réduite. Purification par HPLC en phase inverse
  20. 20. 20 Les colonnes analytique et préparative utilisées pour nos études HPLC sont greffées en C18 (Nucleosil 100-3 C18 ; Macherey-Nagel). La phase mobile est un gradient d’acétonitrile dans l’eau (solvant A : H2O + 0.1% TFA et solvant B : ACN + 0.09% TFA). Le débit est de 1 mL.min-1 et de 10 mL.min-1 respectivement pour les HPLC analytique et préparative. Nous avons effectué deux gradients pour les séparations sur colonne analytique. Le premier gradient dit rapide (de 0 à 100% de B en 30 min) nous permet de vérifier l’efficacité des couplages peptidiques. Cette analyse s’effectue sur un peptide toujours protégé par un groupement Fmoc (molécules hydrophobes). Le second gradient est beaucoup plus lent (de 25 à 35% de B en 30 min) et nous permet d’analyser les peptides ne portant plus que le groupement benzyl sur le D-Lac comme seul groupement protecteur. Nous nous sommes placés à une longueur d’onde de 214 nm de façon à visualiser l’ensemble des molécules synthétisées. Peptide L-Lys-D-iGln-L-Ala-D-LacOBn : C24H37N5O7 Peptide cible Acide aminé DIC K-Oxyma DIEA L-Lys(ivDde)-D-iGln- NHTrt (0.164 mmol de résine de départ) Fmoc-D-iGln(OH)- NHTrt MW=610 g.mol-1 n= 0.246 mmol m=150 mg MW=126.2 g.mol-1 n=492 mmol d=0.815 V=76 µL MW=180.2 g.mol-1 n=492 mmol m=89 mg MW=129.25 g.mol-1 n=0.984 mmol d=0.742 V=171 µL L-Lys(ivDde)-D-iGln- NHTrt-L-Ala-OH (0.164 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH MW=311.33 g.mol-1 n=492 mmol m=153.2 mg n= 492 mmol V=76 µL n=492 mmol m=89mg n=0.984 mmol V=171 µL L-Lys(ivDde)-D-iGln- NHTrt-L-Ala-D-Lac-OBn (0.164 mmol de résine de départ) Fmoc-D-Lac-OBn MW=180.2 g.mol-1 n=492 mmol m=89 mg n= 492 mmol V=76 µL n= 492 mmol m=89 mg n=0.984 mmol V=171 µL Peptide L-Lys (L-Ala-L-Ala)-D-iGln-L-Ala-D-LacOBn : C30H47N7O9 Peptide cible Acide aminé DIC K-Oxyma DIEA L-Lys(ivDde)-D-iGln- Fmoc-D-iGln(OH)- MW=126.2 MW=180.2 MW=129.25
  21. 21. 21 NHTrt (0.164 mmol de résine de départ) NHTrt MW=610 g.mol-1 n= 0.246 mmol m=150 mg g.mol-1 n=492 mmol d=0.815 V=76 µL g.mol-1 n=492 mmol m=89 mg g.mol-1 n=0.984 mmol d=0.742 V=171 µL L-Lys(ivDde)-D-iGln- NHTrt-L-Ala (0.164 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH MW=311.33 g.mol-1 n=492 mmol m=153.2 mg n= 492 mmol V=76 µL n= 492 mmol m=89 mg n=0.984 mmol V=171 µL L-Lys(ivDde)-D-iGln- NHTrt-L-Ala-D-Lac-OBn (0.164 mmol de résine de départ) Fmoc-D-Lac-OBn MW=180.2 g.mol- 1 n=492 mmol m=89 mg n= 492 mmol V=76 µL n= 492 mmol m=89 mg n=0.984 mmol V=171 µL L-Lys(L-Ala)-D-iGln- NHTrt-L-Ala-D-Lac-OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH n=0.15 mmol m=47 mg n= 0.15 mmol V=23 µL n= 0.15 mmol m=27 mg n=0.3 mmol V=50 µL L-Lys(L-Ala-L-Ala)-D-iGln- NHTrt-L-Ala-D-Lac-OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH n=0.5 mmol m=156 mg n= 0.5 mmol V= 77 µL n=0.5 mmol m=90 mg n=1 mmol V=174 µL L-Lys (L-Ala-L-Ala)-D-iGlu-L-Ala-D-LacOBn n°1: C30H46N6O10 Peptide Acide aminé DIC K-Oxyma DIEA L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-D-iGlu(OH)- OtBu MW=425.48 g.mol-1 n= 0.15 mmol m=64 mg MW=126.2 g.mol-1 n=0.15 mmol d=0.815 V=23 µL MW=180.2 g.mol-1 n=0.15 mmol m=27 mg MW=129.25 g.mol-1 n=0.3 mmol d=0.742 V=50 µL L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala (0.05 mmol de résine Fmoc-L-Ala-OH MW=311.33 g.mol-1 n=0.15 mmol V=23 µL n=0.15 mmol m=27 mg n=0.3 mmol V=50 µL
  22. 22. 22 de départ) n=0.15 mmol m=47 mg L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala-D-Lac-OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-D-Lac-OBn MW=180.2 g.mol- 1 n=0.15 mmol m=27 mg n=0.15 mmol V=23 µL n=0.15 mmol m=27 mg n=0.3 mmol V=50 µL L-Lys(L-Ala)-D-iGlu- OtBu-L-Ala-D-Lac-OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH n=0.5 mmol m=156 mg n=0.5 mmol V=77 µL n=0.5 mmol m=90 mg n=1 mmol V=174 µL L-Lys(L-Ala-L-Ala)-D- iGlu-OtBu-L-Ala-D-Lac- OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH n=0.15 mmol m=47 mg n=0.15 mmol V=23 µL n=0.15 mmol m=27 mg n=0.3 mmol V=50 µL L-Lys (L-Ala-L-Ala)-D-iGlu-L-Ala-D-LacOBn n°2: C30H46N6O10 Peptide Acide aminé DIC K-Oxyma DIEA L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-D-iGlu(OH)- OtBu MW=425.48 g.mol-1 n=0.15 mmol m=64 mg MW=126.2 g.mol-1 n=0.15 mmol d=0.815 V=23 µL MW=180.2 g.mol-1 n=0.15 mmol m=27 mg MW=129.25 g.mol-1 n=0.3 mmol d=0.742 V=50 µL L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH MW=311.33 g.mol-1 n=0.15 mmol m=47 mg n=0.15 mmol V=23 µL n=0.15 mmol m=27 mg n=0.3 mmol V=50 µL L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala-D-Lac-OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-D-Lac-OBn MW=180.2 g.mol- 1 n=0.15 mmol n=0.15 mmol V=23 µL n=0.15 mmol m=27 mg n=0.3 mmol V=50 µL
  23. 23. 23 m=27 mg L-Lys(L-Ala)-D-iGlu- OtBu-L-Ala-D-Lac-OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH n=0.5 mmol m=156 mg n=0.5 mmol V=77 µL n=0.5 mmol m=90 mg n=1 mmol V=174 µL L-Lys(L-Ala-L-Ala)-D- iGlu-OtBu-L-Ala-D-Lac- OBn (0.05 mmol de résine de départ) Fmoc-L-Ala-OH n=0.15 mmol m=47 mg n=0.15 mmol V=23 µL n=0.15 mmol m=27 mg n=0.3 mmol V=50 µL L-Lys (D-iAsp)-D-iGlu-L-Ala-D-LacOBn : C28H41N5O11 Peptide cible Acide aminé DIC K-Oxyma DIEA L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu (0.067 mmol de résine de départ) Fmoc-D-iGlu(OH)- OtBu MW=425.48 g.mol-1 n=0.2 mmol m=85.5 mg MW=126.2 g.mol-1 n=0.2 mmol d=0.815 V=31 µL MW=180.2 g.mol-1 n=0.2 mmol m=36 mg MW=129.25 g.mol-1 n=0.4 mmol d=0.742 V=70 µL L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala (0.067 mmol de résine de départ) Couplage 1 Fmoc-L-Ala-OH MW=311.33 g.mol-1 n=0.2 mmol m=62 mg n=0.2 mmol V=31 µL n=0.2 mmol m=36 mg n=0.4 mmol V=70 µL L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala (0.067 mmol de résine de départ) Couplage 2 Fmoc-L-Ala-OH MW=311.33 g.mol-1 n=0.2 mmol m=62 mg n=0.2 mmol V=31 µL n=0.2 mmol m=36 mg n=0.4 mmol V=70 µL L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala (0.067 mmol de résine de départ) Couplage 3 Fmoc-L-Ala-OH MW=311.33 g.mol-1 n=0.67 mmol m=209 mg n=0.67 mmol V=104 µL n=0.67 mmol m=121 mg n=1.34 mmol V=233 µL
  24. 24. 24 L-Lys(ivDde)-D-iGlu- OtBu-L-Ala-D-Lac- OBn (0.067 mmol de résine de départ) Fmoc-D-Lac-OBn MW=180.2 g.mol- 1 n= 0.2 mmol m=36 mg n=0.2 mmol V=31 µL n=0.2 mmol m=36 mg n=0.4 mmol V=70 µL L-Lys(D-iAsp)-D-iGlu- OtBu-L-Ala-D-Lac- OBn (0.067 mmol de résine de départ) Boc-D-iAsp(OH)- OtBu MW=289.33 g.mol-1 n=0.4 mmol m=116 mg n=0.4 mmol V=62 µL n=0.4 mmol m=72 mg n=0.8 mmol V=140 µL Masse des peptides (ESI+) Les différentes fractions HPLC ont été analysées en masse sur la plateforme de masse du Muséum d’Histoire Naturelle. Peptide Formule brute Masse exacte calculée (g.mol-1 ) Masse exacte trouvée (g.mol-1 ) L-Lys-D-iGln-L-Ala-D-LacOBn C24H37N5O7 507,2693 507,2756 L-Lys (L-Ala-L-Ala)-D-iGln-L-Ala- D-LacOBn C30H47N7O9 649,3435 649,3589 L-Lys (L-Ala-L-Ala)-D-iGlu-L-Ala- D-LacOBn C30H46N6O10 650,3275 650,3315 L-Lys (D-iAsp)-D-iGlu-L-Ala-D- LacOBn C28H41N5O11 623,2803 623,2850 V/ BIBLIOGRAPHIE I. Typas, A. et al. 2011. Nat. Rev. Microbiol 10 :123-36 II. Ostach, B and S ; Walker. 2005. Curr. Opin Chem biol 9 :459-66 III. Sauvage et al. 2008, FEMS Microbiol Rev. 32 :234-58 IV. Lavollay, M et al. 2008. J Bacteriol 190 :4360-6
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