O documento discute teoria e aplicações da PCR quantitativa (qPCR). Resume os principais tópicos da qPCR, incluindo ensaios químicos disponíveis, conceitos importantes como curvas padrão e de dissociação, e fatores que afetam a eficiência. Também aborda cálculos como quantificação absoluta e relativa usando métodos como Livak.
1. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
Biologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)
ICB/UFMG
PCR quantitativa
Teoria e Aplicações
Lucas Secchim Ribeiro
Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
2. • PCR
Histórico
Teoria
Aplicações
• Desenho de primers
• qPCR
Metodologias
Cálculos
Aplicações
PCR Digital
8. Funções da PCR
• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma
grande quantidade de background;
• Amplificação de cópias de uma sequência
específica a partir de pequenas quantidades do
DNA modelo.
9. Aplicações da PCR “convencional”
• Diagnóstico
• Avaliação de mutações
• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)
• Tipagem para transplantes - MHC
• Testes forenses
• Paternidade
• Investigações criminais
• Sequenciamento e clonagem
• Epidemiologia molecular e bioinformática
• Análise de OGM
• ...
11. Importância do tampão e íon potássio na PCR
• pH 8,3 pH 7,2 a 72º C
• Tris/ Tris-Cl
•Função enzimática da DNA polimerase
• K+
• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer
pela neutralização de cargas negativas
↑ [K+
] para fragmentos pequenos
↓ [K+
] para fragmentos grandes
12. Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR
• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
• Associados ao DNA na forma de dNMPs
• Sequestradores de Mg2+
• Mg2+
• Cofator da DNA polimerase
• Especificidade e eficiência da enzima
•Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita
de DNA (↑ Tm)
• Rendimento x Concentração crítica e empírica
↑ [Mg2+
] ↑eficiência ↓especificidade
13.
14. Função e relevância dos primers
• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de
sequência complementar e flanqueadora à fita
molde, com a extremidade 3´-OH livre
15. Thermus aquaticus
DNA polimerase termorresistente
• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
• Taq DNA Polimerase
• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+
> Mn2+
>>>Ca2+
)
• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)
Parque Nacional de Yellowstone / EUA
16. DNA molde
• Qualidade
• Cuidado com resíduos de processos de extração
• SDS (dodecil sulfato de sódio)
• Fenol
• Corantes
• Heparina/EDTA/Citrato
• Polissacarídeos vegetais/carragenina
• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV
• Quantidade
• Excesso de DNA é prejudicial
• Aumento de reação inespecífica
17.
18. Parâmetros de termociclagem
• Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento ↑estringência
↓produtos inespecíficos
↓ Tanelamento ↑rendimento
↑ produtos inespecíficos
• Tempo de extensão
• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C
• Mínimo = 1 minuto
• Excesso Atividade de exonuclase 5´-3´
19. Aditivos
• Separação de fitas com alto conteúdo G:C
• Estruturas secundárias fortes
• Betaína (1 M)
• DMSO (1-10%)
• Formamida (1-10%)
• Agentes estabilizantes da DNA polimerase
• Redução da adesão de reagentes ao tubo
• BSA (0,1 mg/mL)
• Gelatina (0,1 – 1,0%)
• Detergentes não-iônicos (<0,5%)
20. Inibidores
• Derivados das próprias amostras ou do método
de extração/purificação do ácido nucléico;
• Fenol/álcoois
• EDTA
• Debris celular
• Detergentes
29. Características de bons primers
• Tamanho adequado
• 15 a 25 pares de bases
• Tamanho x Temperatura de dissociação
• Temperatura adequada de dissociação (Tm)
• Conteúdo G:C
•Diferença entre primers < 5º C
30. Características de bons primers
• Tamanho do fragmento a ser gerado
• Tempo de extensão da polimerase
•Especificidade
Primers específicos x degenerados
31. Características de maus primers
• Inter-complementariedade
• Formação de dímeros (primer dimer)
• Atenção à extremidade 3´
32. Características de maus primers
• Auto-complementariedade
• Formação de auto-dímeros e hairpins
33.
34. Características de bons primers
• Adequação para qPCR
• Tamanho do amplicon
•Junção exon-exon e contaminação com gDNA
35. Ferramentas online de suporte
• Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
• Primer3
bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3
• IDT Oligo Analyzer 3.1
www.idtdna.com/calc/analyzer
• UCSC PCR in silico
genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
• RT Primer DB (específico para qPCR)
• medgen.ugent.be/rtprimerdb
36. Problema
detectado
Workflow para desenho de primers
Verificar
• Temp. de anelamento
• Temp. de dissociação
• Tamanho do amplicon
• Estruturas secundárias
• Complementaridade
• EspecificidadeNãoSim
PCR para
confirmação de
funcionamento
PCR para
confirmação de
funcionamento
GenBank/NCBI
Encontrar sequência da
região desejada
Encontrar sequência da
região desejada
PrimerBLAST
Primer3, etc
Desenhar primersDesenhar primers
Registrar e arquivar
resultados obtidos
Registrar e arquivar
resultados obtidos
Reação
adequada
OK?OK?
CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!
39. Ensaios químicos disponíveis
• SYBR Green I
• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)
• Molecular Beacons
• LightCycler
• LUX
Detecção de
fluorescência!
↑ sensibilidade
40. SYBR Green I
• Corante específico para DNA de fita dupla
• Flourescência aumenta ao longo da reação
• Não tem ação inibitória
• Detecta produtos inespecíficos
SYBR Green I
Brometo de etídio
41. Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase
• Altamente específica, sem produtos espúrios
• Duas marcações simultâneas são possíveis
• Tecnologia baseada em FRET
• Flourescence Resonance Energy Transfer
42. FRET - Transferência de energia por ressonância
fluorescente
• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito
próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão
de luz
• Quencher/bloqueador
53. E = 10(-1/slope)
Conceitos importantes
• Eficiência
Eficiência 100% = 2n
a cada ciclo = log 2 x
Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32
Slope
(inclinação)
54. Conceitos importantes
• Curva-padrão e blank sample
• Gene de referência/constitutivo/normalizador
• Gene de interesse
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação
Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0
Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0
Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0
Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33
Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0
Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67
55. Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Indica a temperatura em que 50% dos primers
estão anelados;
• Ligação específica do corante à fita dupla
56. Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C
• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de
primers
57. Conceitos importantes
• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Importante para distinção de amplicons/primers
em protocolos multiplex
58. Fatores que afetam a eficiência da qPCR
• DNA degradado
• Produtos inespecíficos
• Tamanho do amplicon
• Condições de termociclagem
• Prática laboratorial inadequada
• Reagentes contaminados
• Primers mal desenhados
• Diluições mal feitas
• Falta de calibração e manutenção
• Pipetagem errada!
59. Funções da PCR quantitativa
• Quantificação absoluta
• Curvas-padrão
• Quantidade conhecida de “cópias por volume”
• Semelhante a um ELISA
• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano
• Avaliação relativa
• Ausência de curva-padrão
• Gene de referência para normalização
• Apresentada em aumento/redução em relação a um
controle experimental
• Exemplo: expressão gênica
60. CÁLCULOS E
ANÁLISES
CÁLCULOS E
ANÁLISES
Verificar dispersão entre replicatas
biológicas e técnicas
Verificar dispersão entre replicatas
biológicas e técnicas
Checar controles positivos
(curva-padrão) e negativos (blank)
Checar controles positivos
(curva-padrão) e negativos (blank)
Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm)
Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold
Análise de resultados
Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação
61. Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta
• Regressão linear simples
• Método PfafflMétodo Pfaffl Curva de cópias (plasmídeos)Curva de cópias (plasmídeos)
62. Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
• Relação matemática entre a expressão dos genes
de referência e os de interesse
• Método LivakMétodo Livak 22--ΔΔΔΔCTCT
63. Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
• Avaliada a conformidade de todos os outros
parâmetros, a única informação útil será o CT
• Exemplo:
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4
Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1
Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8
Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9
Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9
66. Extração e manuseio de ácidos nucléicos
• RNA = extremamente lábil!
• Armazenamento correto
• Dosagem e normalização das amostras
• A260/280 e A260/230 > 1,8
• Contaminação com DNA genômico
Confecção de cDNA
• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 2 µg) de
RNA para todas as amostras;
• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;
• Ciclos de congelamento/descongelamento;
67. Escolha do gene de referência
• É necessário ter opções!
• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem
ter a expressão do gene constitutivo alterada;
•Preparar um pool com amostras-controle
• 6 diluições em triplicata
• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0
•Algoritmos gratuitos na internet
•NormFinder: macro para Excel
70. PCR digital (dPCR)
Baseada na compartimentalização da amostra
• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos
• Chips com nanopoços
Individualização das moléculas!
Distribuição de Poisson
Aplicações
• Quantificação absoluta sem curva-padrão
• Expressão gênica
• Detecção de alelos raros e/ou mutações
• Discriminação de baixas diferenças para CNV
77. O que é importante saber?
• Teoria e suas diferenças entre as técnicas
• Vantagens e desvantagens de cada uma
• Como aplicar a PCR ao seu projeto
• Aplicações gerais e específicas
• Boas práticas laboratoriais
TODAS AS OBSERVAÇÕES SÃO VÁLIDAS PARA REAL TIME!!!!!!!
Concentração normal de K+ no tampão: 50 - 100 mM
BAIXA ESPECIFICIDADE LEVA À FORMAÇÃO DE PRODUTOS INESPECÍFICOS
DICA: DESCONGELAR E VORTEXAR BASTANTE O MgCl2!!
Remoção dos fosfatos beta e gama dos dNTPs para associação à fita de DNA
Thermus aquaticus = termofílica Gram Negativa
ENZIMAS ANTIGAS: KLENOW ou T4 DNA Pol
TAQ = MEIA-VIDA DE 40 MINUTOS a 95º C
AUMENTAR A QTDE DE ENZIMA NÃO MELHORA O RENDIMENTO!!!
ERROS DE PIPETAGEM DEVIDO AO GLICEROL!
PROOFREADING = BLUNT
NON-PROOFREADING = OVERHANGING (A)