Articulo Limpieza in situ durante un Inmunoensayo: un método simple para la detección rápida de aflatoxina B1 en muestras de alimentos

1. Limpieza in situ durante un Inmunoensayo: un método simple para la detección rápida de aflatoxina B1 en muestras de alimentos (Aflatoxinas en alimentos) ARINDAM PAL, DEBOPAM ACHARYA, DEBJANI SAHA, DIPIKA ROY, AND TARUN K. DHAR* Immunobiology Division, Indian Institute of Chemical Biology, May 2005 LA DMM 295 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓNFacultad de Ciencias Biológicas

2. Grupo de metabolitos secundarios Aspergillusflavusy Aspergillusparasiticus materias primas de agricultura AFB2, G1, y G2 naturalmente predominantes  > AFB1 Potentes caracteristicasmutagenicas y carcinogenicas (animales y humanos) Es posible disminuir el riesgo a la exposición x programas riguroso de control y vigilancia de esta toxina en el suministro de alimentos. Aflatoxinas productos básicos para el consumo No > 20 µg/kg. AFB1 FoodanDrugAdministration U.S.

3. Varios métodos son comúnmente usados para la cuantificación de AFB1. Cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) Cromatografía en capa fina Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) El mayor problema asociado con la mayoría de los métodos utilizados para la determinación de AFB1 es la presencia de sustancias co-extraidasque interfieren en las muestras, las cuales requirieron de múltiples extracciones y pasos de limpieza antes de la cuantificación. AFLATOXINAS

4. La limpieza de la muestra por métodos de extracción manual son una labor intensiva y requieren de tiempo. Técnicas “minicolumn” Están basadas en cartuchos extracción en fase solida trajo una mejora significativa en estos ensayos. Simple y 3 pasos: 1) carga de la muestra (en columnas con anticuerpos inmovilizados) 2) lavado de las impurezas (con soluciones de limpieza suaves ) 3)(la elución) extracción de la toxina para ser determinada V: limpieza de extractos debido a la alta especificidad de los anticuerpos, la rapidez de la etapa de purificación, y el consumo reducido de disolventes peligrosos. D: cada muestra debe ser manipulada manualmente, cada muestra requiere de secuencias de elución complejas, las sustancias inestables pueden descomponerse durante la evaporación de disolventes orgánicos, cartuchos caros o columnas con vida útil limitada, la cuantificación realizada por técnicas cromatográficas o inmunoquimicasaumenta el tiempo y costo del análisis. AFLATOXINAS

5. Procedimientos automatizados Limpieza por inmunoafinidad Cuantificación simultanea por HPLC, cromatografía de gases o electroforesis D: requieren de equipos costosos, laboratorios bien equipados, personal capacitado y varias horas en completarse. (2004) Dispositivo de análisis para llevar a cabo una un ensayo basado en la inmunofiltracion para la detección de AFB1 en muestras de alimentos condiciones de campo. 12 muestras dentro de 12 minutos mediante una tarjeta de prueba. muestras diluidas y un método Súper-CARD* para obtener la sensibilidad requerida. AFLATOXINAS * deposición catalizado de reportero

6. Súper-CARD Utiliza proteínas sintetizadas ricas en electrones que contienen múltiples grupos fenolicos para bloquer los sitios disponibles de la membrana. Estas mejora notablemente la deposición de moléculas de Tiraminabiotinilada por la actividad peroxidasa, el cual no solo amplifica la señal, pero también aumenta la sensibilidad cuando se compara con el método de deposición por catálisis de reportero. AFLATOXINAS

7. OBJETIVO fue explorar la manera fácil de simplificar el procedimiento de ensayo de varios pasos y superar las interferencias de la matriz para mejorar los limites de detección de AFB1 en matrices de varios alimentos. Este método utiliza un paso de limpieza in situ, durante el ensayo. sin el uso de la tecnología de amplificación. AFLATOXINAS

8. Material y quimicos. MATERIAL Y METODOS

9. Densitometria. Escaner de imagen (AmershamPharmaciaBiotech, Piscataway, N.J.) Magic Software (version 4.5) para la digitalizacion y el ImageMaste Total laboratory software (version 1.11) para la cuantificación. Preparación de la muestra. MATERIAL Y METODOS 5 ml de metanol (80%) Maní Maíz trigo Soja proce. Chile Alimento aves sobrenadante diluido 10-1 buffer de ensayo Muestras enriquecidas fueron preparadas añadiendo la cantidad apropiada de la solucion AFB1 en metanol 37°/ 24h .

10. Reactivo del inmunoensayo. Un anticuerpo policlonal contra AFB1 se obtuvo de conejos . Es altamente especifico para AFB1. El conjugado AFB1-HRP* fue sintetizado por el metodo NHS-ester . MATERIAL Y METODOS Muestras infectadas secar en papel filtro suspensión acuosa de esporas de A. parasiticus 30°C / 48 hr Precipitación sulfato de amonio (50% sat.) Dialisis vs.PBS Columna BSA- sepharosa Remover Ac anti- BSA Anti-AFB1 purificar * Peroxidasa de rábano.

11. Preparacion de tiras la de membrana. MATERIAL Y METODOS Tiras nitrocelusosa (1.4 x 7 cm) 0.4 % de buffer de caseina en carbonato-bicarbonato (50mM, pH 9.6) 5 μL de Anti- AFB1+Buffer Tris sol. Sal. 1: 100. Conteniendo BSA [10 μg/mL] en el centro. Bloqueo Sitios libr. lavado Recubrir Buffer Tris-HCL, + 2.9 % de NaCl+ 0.05 % Tween 20). Almacenar T°A oscuridad secadas a 37° C por 30 min

12. Procedimiento del inmunoensayo con la limpieza in situ de la muestra. MATERIAL Y METODOS *** TFA Ac.propionico NaHCO3 TMAH KSCN Papel filtro humedecido tarjeta de polietileno - agregue 50 μL de ***solución limpiadora sobre las aéreas de inmunoabsorción - lavar con 50 μL de la solución PBS. Añada estandares (0,10,50 y 100 pg/ 25 μL en buffer de ensayo) o muestras (25 μL) a el centro de las zonas marcadas de anticuerpo en. Retirar exceso de líquidos Remueva el aire Agregar 25 μLAFB1-HRP Buffer Tris-HCL, + NaCl+ BSA + Thimerosal - Vierta solución DAB (2.5 ml por tira) superficie e incubar durante 1 min. - Detener la reacción mediante el lavado agua. -Remueva el papel filtro -lave las tiras a flujo de buffer. Medir la intensidad de los sitios y por densitomeria.

13. HPCL. Fraccionar los compuestos de interes Localizar y para cuantificar la AFB1 en las muestras infectadas. Fase movil: metanol (50%) Velocidad de flujo : 0.4 mL/min Longitud de onda: 363 nm. Muestra inyectada: 10 μL de mani y maiz, y 5 μL para los extractos de chile. Las fracciones de elucion se colectaron, evaporaron en baño a vapor, y diluyeron a su volumen original con un buffer de ensayo para el ensayo de AFB1. Bajo condiciones selectivas, todas las 4 aflatoxinas –B1,B2, G1 y G2- fueron obtenidas con tiempos de retencion de 8.5, 7.2, 6.2 y 5.6 min. El area del pico fue medida, la cual fue proporcional a la cantidad conocida para AFB1. MATERIAL Y METODOS

14. Tira de membrana después de la prueba. El limite de detección visual de AFB1 fue considerado de 5pg (0.2 ng/ml). RESULTADOS Figura 1. Ensayos competitivos de AFB1 en buffer de ensayo. Los estandares de AFB1 usados por area fueron a) 0, b) 5pg, c) 10 pg, 4) 25 pg, e) 50 pg, f) 75 pg, g) 100 pg; y h) control ( sin el anticuerpo inmovilizado). Las diluciones de anticuerpo y de AFB1-HRP conjugado utilizadas en este ensayo fuero 1:100 y 1: 1000 respectivamente. DAB fue usado como el sustrato para la vizualizacion.

15. La selección de las soluciones para la limpieza que eliminen las sustancias que interfieren, sin afectar el anticuerpo inmovilizado, es uno de los pasos mas criticos en el metodo actual. Se examinaron efectos de varias soluciones como los solventes acuosos organicos y acidos, basicos y soluciones salinas de fuerzas variables. Las estimaciones se hicieron basados en los cambios de las intensidades de las areas en la membrana de nitrocelulosa. Se indican las soluciones consideradas seguras para su utilización: metanol 10% DMSO 5% acido acético, TFA y el acido propionico (todos hasta 100 mM); NaHCO3 (hasta 250 Mm) TMAH (hasta 50 mM) urea y KSCN (ambas hasta 1 M) NaCL ( hasta 4 M) los buffers variados (50 mM) (pH de 4.0 a 9.6) RESULTADOS

16. A continuación se estimo la interferencia de los constituyentes de la muestra distintos a las aflatoxinas en matrices de diversos alimentos. Las variaciones de estos valores podrían interferir marcadamente con el ensayo de AFB1. RESULTADOS + interferentes

17. RESULTADOS Figura 2. Comparación de la recuperación obtenida para los diferentes matrices blancos enriquecidos con AFB1 a una concentración de 50μL /kg. Los extractos fueron diluidos sin limpiar 1) y con soluciones limpiadoras de TFA ( 100 mM) 2), acido propionico (100 mM) 3), NaHCO3 (100 Mm) 4), TMAH (50 Mm) 5), (KSCN (1M) 6) , PBS (7). TFA Ac. Prop. NaHCO3 TMAH KSCN PBS

18. Se determino que 50 μL de la solución de limpieza debían usarse todos los experimentos posteriores. La solucion de limpieza que no dio una diferencia significativa en la intensidad de los puntos de la muestra blanco en comparación con el valor del buffer blanco fue considerada como la mas eficiente. La presencia de interferencias leves en algunas muestras de alimentos fue casi completamente eliminada con un lavado adicional con la solucion de PBS (50 μl) en vez de agua. RESULTADOS Y DISCUSION “”presencia de sustancias que se unen a la aflatoxina no especifica. “”

19. Ya determinado se evaluo la eficacia de limpieza por comparacion de las curvas dosis-respuesta con los niveles conocidos de AFB1. No hubo diferencias significativas n las intensidades de los puntos, los cuales indican una limpieza eficaz de las muestras. RESULTADOS FIGURA 3. Efecto de las diferentes matrices sobre la curva estándar de AFB1 obtenida con (triangulo) o sin ( circulo) métodos de limpieza. Los estándares AFB1 se prepararon por dilución además con buffer de ensayo (circulo vacio) o no infectado a) maní, b) maíz, c) chile . En todos los caso la solución PBS fue usada para el lavado final.

20. RESULTADOS No infectado Infectado + enriquecido Para investigar la presencia de sustancias inmunologicamente interferentes en los extractos acuosos metanolicos de el mani infectado, maiz y AFB1-añadido chile, las muestras fueron fraccionadas por HPLC. Muestra la presencia de materiales capaces de hacer una reactividad cruzada con el anticuerpo AFB1 ( Fig. 4ª a 4c). con la limpieza inmunoreactividades fueron casi completamente eliminadas. 4d a 4f demuestra la presencia de cantidades considerables de material inmunoreactivo distintos a AFB1. Los materiales principales interferentes(eluidos entre 2 y 8 min) fueron mas polares que el AFB1. Con lavado casi completamente eliminadas.

21. ANALISIS DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS La sensibilidad del método fue suficiente para satisfacer las necesidades de las agencias reguladoras. Se analizo otros parámetros analíticos la recuperacion analítica de AFB1 de los extractos de muestras no infectadas enriquecidas con AFB1 en diferentes niveles, ensayados y cuantificados por densitometria. Las recuperaciones promedio dentro del rango de la adición inoculo de 5 a 100 μg/ kg fueron de 99 a 105% . DISCUSION

22. Para evaluar la exactitud del método. …………… ….. excelente precisión! DISCUSION

23. Niveles de AFB1 de las 48 muestras de mani, maiz infectado con A. parasiticusfueron luego comparados con los valores obtenidos para HPLC. El analisis de regresion lineal (Analyse-It Software Ltd, Leed, UK) sobre los datos dieron un correlacion excelente (R2= 0.98) entre los metodos. DISCUSION

24. El método descrito: Posee un limite de detección de 5 μg/kg** y de 10 μg/kg chile. La recuperacion media de las diferentes muestras fueron entre 99 y 105%. Es aplicable para el ensayo de otras micotoxinas y contaminantes ambientales. Recuperación, eliminación sust. interf. y determinación cuantitativa de AFB1 en el mismo sistema. Permiten un ahorro financiero considerable. Simplifica la manipulación de las muestras. CONCLUSIONES