Genové inženýrství je soubor technik, kterými lze cíleně upravovat genetickou informaci.Tyto metody se zdají být uměle vytvořené, ale ve skutečnosti jsou přírodou hojně používané. Co všechno jsme od virů, bakterií i našich buněk odkoukali a k čemu nám to může sloužit?

1. Genové inženýrství

2. Genové inženýrství
● Genové inženýrství je
soubor technik určených k
cílené manipulaci
genetické informace
● Cílené manipulaci?
– alternativně: aplikace
genetických poznatků na
křížení zvířat a rostlin

4. Centrální „dogma“ molekulární
biologie

5. Úvod
Struktura DNA
● Určena 1953
● Primární sekvence: pořadí bazí
● Dvoušroubovice tvořená dvěma
antiparalelními vlákny
● Hlavní nositel genetické informace
(spolu s RNA a epigenetickou
informací)

6. Úvod
Co je gen
● Definováno každým oborem jinak
● Pro genové inženýrství – úsek DNA kódující
protein+příslušné regulační oblasti
● Pro klasického genetika - „vloha“
● Identifikace genu:
– Genetické metody (mutace+mapování)
– Biochemické metody – nalezení proteinu =>
zpětné určení zodpovědného genu

8. Univerzální genetický kód
● Všechny organismy používají stejný genetický
kód (několik výjimek, hlavně obsazení
nekódujících pozic)
● DNA z různých organismů je vzájemně
kompatibilní

9. Základy
vztah genotypu a fenotypu
● Gen kóduje protein, který má nějakou funkci
● Monogenní znaky
● Polygenní znaky
– Výška, inteligence, hmotnost, krevní tlak
– Většina chorob
– Neléčitelné genovou terapií

10. Inspirace přírodou
Mobilní elementy
● Transpozomy a retroelementy
● Úseky DNA, které jsou schopné se množit v
rámci genomu
– Nosí informaci pro svou replikaci a často selekční
výhodu – resistenci nebo vyvolávají patogenitu
– Často se nesprávně vloží
● Inaktivace rozrušeného místa => rakovina
● Při vyštěpení mohou vzít část hostitelské DNA
– Genová duplikace
● Bakteriální integrativní plasmidy

12. Restrikčně modifikační systém

14. Inspirace přírodou
Selekční znaky
● Využívání resistence na antibiotika
● Obnova poškozených biosyntetických drah
● Umožňují vybrat jednotlivé buňky, které si
osvojily vnesenou DNA
● Poznámka – existující resistence
bakterií proti těžkým kovům (stříbro)

15. Nová metoda
Sekvenace

16. Nová metoda
PCR
● Vyžaduje znalost sekvence

17. Izolace „speciální“
DNA
● Forenzní analýza
– Mitochondriální DNA, DNA pro určení identity
– aDNA maximálně sto (stovky?) tisíc let (izolace DNA z
dinosaurů nepotvrzena)
● DNA musí být rychle zmražena nebo vysušena (mumie)
● Izolace DNA pro potřeby genového inženýrství
● Praktická ukázka izolace DNA z rostlinného vzorku dnes
večer!

18. Bezpečnost
● Biohazard I – běžná laboratoř, bakterie a viry
neinfekční pro člověka
● Biohazard II – málo infekční (obtížně šiřitelné)
● Biohazard III – nebezpečné a exotické
choroby
● Biohazard IV – choroby
smrtelné, neléčitelné
a bez známé prevence
Otázka – zařaďte: ebola chřipka (běžná), SARS,
salmonela, tuberkulóza, HIV, GMO

19. Hlavní využití
primární výzkum
● Knock-out
● Knock-down
● Knock-in
● Zkoumání lokalizace a exprese
● Úpravy pro usnadnění biochemických analýz

20. Bakteriální
beta-svorka+GFP

21. Zeleně:
Tubulin+GFP
Otázka:
Jak se liší uspořádání
tubulinu v buňkách s
průduchy a bez nic?

22. Zeleně:
14-3-3-
φ/GFP
transgene
Červeně:
Autofluoresc
ence
chlorofylu

24. Využití:
produkce proteinů ve velkém
● První – inzulin v bakteriích (1977)
● Rostlinné očkování
● Produkce enzymů
– Vylepšení produkce „přírodních“ enzymů
● Hypoteticky možnost libovolný protein
produkovat ve velkém množství
– Protein pavoučího vlákna => lepší, než kevlar

25. GMO Plodiny
● Cílené úpravy, technicky stejné, jako ty probíhající
přirozeně, které jsou ale velmi nepravděpodobné
● Plodiny nesoucí Bt toxin – v „běžných podmínkách“
(využívání pesticidů) srovnatelný výnos, bez použití
pesticidů výnos +80 %
– Budoucí uplatnění GMO hlavně v rozvojových zemích
● Možný přenos DNA na člověka?
– „Rostliny mají geny ?!?“
● Pokud je GMO riziko, pak hlavně pro životní prostředí (ryby)
● 25 let zkoumání, 130 nezávislých týmů, konsenzus –
bezpečné při dodržení předběžné opatrnosti

26. Únik resistence na antibiotika
● Horizontální genový transfer
– Běžný jev, hlavně prokatyota a nižší eukaryota
– Genom bakterie Wolbachia (endosymbiont) se v
evoluci přenesl do některých druhů hmyzu
– Separovaná germinální linie u zvířat
● Používané selekční znaky se běžně vyskytují
– Resistence na ampicilin nese 10 % půdních
bakterií
– Přenos resistence

27. Výhody
● Omezení využití pesticidů a zvýšení
resistence
– Využitelné pro rozvojové země
– „Obsahuje GMO x 12x povrchově ošetřeno
pesticidy“
● Úprava obsahu živin
– Zlatá rýže, sója s upraveným obsahem
aminokyselin

28. Nevýhody
● Mezinárodní korporace
● Závislost zemědělce na výrobci (i u konvenčních –
heterózní efekt)
● Možnost vzniku resistence u příbuzných plevelů (x
DNA jako DNA – stejně dobře se může přenést i
„přirozená“ resistence)
● Možnost úniku GMO do prostředí => ekologická
katastrofa?
● Bt toxin a ničení včelstev? Úhyn motýla monarch?
● Setkání s látkami, se kterými se člověk v evoluci
nesetkal? (x kiwi, mechanismus trávení)

29. Nechvalně známý
Pusztai affair
● Jedna z prvních velkých nezávislých studií o bezpečnosti
GMO (1998)
● Lektin ze sněženky do brambor
=> imunodeficience u potkanů a pomalejší růst
● Špatný pokus
– Kontrolní brambory obsahovaly +20 % proteinů a potkanům byly
podávány především brambory
– Dalším skupinám se výsledky nepodařilo zopakovat
– Peer Review: „experiments were poorly designed, contained
uncertainties in the composition of diets, did not have a large enough
number of rats, used incorrect statistical methods and lacked
consistency within experiments“
● Hysterie ze strany tisku, předtím snad snaha umlčet
Puszataiho

30. Nová plodina musí být testována
● Výzkum vložené DNA a syntetizovaných proteinů
● Analýza chemického složení plodiny, měření
obsahu živin (ptáci preferují GMO před BIO),
přítomnost známých toxinů a alergenů (vnesení
genu může změnit jejich regulaci)
● Určení, jestli nevznikají nové alergeny
– Odhad průměrné spotřeby
– Test na zvířatech: krátkodobý (několik dní),
dlouhodobý (několik málo generací)
● Lepší kontrola, než u konvenčních metod

31. „přírodní experimenty“
● Experimenty s blokací myostatinu
● Vychází z přirozeně vzniklých mutantů
– Stovky let testování konzumenty

33. Využití:
Genová terapie
● Úprava genetické informace za účelem opravit
existující chybu
● Odpůrci: velmi emocionální apokalyptické
vize, „pokoušení osudu a hraní na boha“
● Zastánci: zázračná léčba umožňující vymýcení
nemocí
● Reálně: poměrně omezená metoda na pouze
některé cíle, v současnosti stále
experimentální procedura

34. Nosiče DNA
● Stabilní/dočasná
● Vnesení nahé DNA
● Lipozomy
● Virové
– Odvozené od (vykuchaných) virů
– Integrativní – nebezpečí vzniku rakoviny (x
chemoterapie, imunosuprese, rengen/CT)
– Stabilně přítomné

36. Čas na diskuzi
● Aplikované flebotonium

37. Děkuji za pozornost
Mgr. Josef „Faskal“ Novák
faskal@seznam.cz