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8. ANTIBIOGRAMA
Un antibiótico es una sustancia de origen biológico que inhibe el crecimiento de los
microorganismos a concentraciones muy bajas.
Un antibiograma es un estudio de la sensibilidad "in vitro" de un microorganismo patógeno
frente a las sustancias antimicrobianas.
Existen distintos métodos siendo los más importantes los de :
Difusión: Habitualmente cualitativos. Atendiendo al halo de inhibición que aparece
alrededor del disco, se clasifican los microorganismos como sensibles (S),
intermedios (I) o resistentes (R) según sea la eficacia obtenida por el agente
amtimicrobiano frente al microorganismo.
Dilución: Es un estudio cuantitativo. Se emplean una serie de tubos con distintas
concentraciones de agente antimicrobiano (4-128 g/ml).
Se observa el crecimiento de los microorganismos mediante la aparición de turbidez, o el
cambio de color del indicador incorporado al medio.
La sensibilidad de una bacteria a un antibiótico viene dada por la
C.M.I. es la concentración mínima inhibitoria, representa la mínima cantidad de
antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo.
C.M.B. concentración mínima bactericida. Es la concentración mínima que mata el
microorganismo. Normalmente, la CMI es suficiente para combatir una determinada
infección ya que los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al
microorganismo.
Detección de beta lactamasas: Algunos microorganismos son capaces de producir
estas enzimas, que destruyen los derivados del grupo de las penicilinas, hidrolizando
el anillo betalactámico. Se aplica esta prueba a los siguientes microorganismos:
Staphylococcus aureus, Haemóphilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae.
El antibiograma por el método de difusión en agar es una de las pruebas utilizadas para
determinar la sensibilidad de un microorganismo frente a un antibiótico. En esta prueba se
enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar a una solución
antibiótica absorbida en discos de papel de filtro o en pastillas.
Procedimiento:
1. Preparar 3 placas Petri con agar Müeller Hinton.
2. A partir de un cultivo fresco de las bacterias que hay que ensayar (E. coli,
Staphilococcus, ...), inocular 4-5 colonias en un tubo con 5 ml de caldo TSB.
3. Utilizando un hisopo de algodón sumergirlo en el inóculo y eliminar el exceso
presionándolo sobre la pared interna del tubo.
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4. Inocular la superficie de una placa de agar Müeller Hinton con el hisopo pasándolo
uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por ultimo, pasar el hisopo
por el reborde de la placa.
5. Dejar secar 10 min con la tapa algo abierta (junto al mechero).
6. Preparación de los discos con antibiótico. Disolver una cápsula, comprimido,
gragea o vial de antibiótico en agua destilada; elegir una presentación de antibiótico
fácilmente soluble (Calcular el volumen de dilución que precisa cada tipo de
antibiótico, según la tabla 8.1).
7. Preparar un banco de diluciones (-1, -2) con agua destilada.
8. Con micropipeta Pasteur impregnar los discos para antibiograma con 1 gota de
micropipeta (32 l) de las disoluciones de antibiótico (se puede utilizar la misma
pipeta si se realiza de menor a mayor concentración). Anotar la concentración y el
volumen de antibiótico añadido en cada disco.
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9. Colocar el disco de antibiótico (con pinzas estériles) sobre la superficie del agar y
apretarlo suavemente sobre la superficie del medio. Los discos no deben estar a
menos de 15 mm de los bordes de la placa y a unos 20 mm uno de otro para que no se
superpongan las zonas de inhibición. (No mover los discos una vez implantados).
10. Realizar la operación con:
a. Placa 1 (Staphilococcus):3 discos con las diluciones (1,-1, -2 ) de Amoxicilina.
b. Placa 2 (Staphylococcus):3 discos con las diluciones (1,-1, -2 ) de Penicilina G
c. Placa 3 (E.coli): 3 discos con las diluciones (1,-1, -2 ) de Amoxicilina,
3 discos con las diluciones (1,-1, -2 ) de Penicilina G.
1. Marcar placas y dejarlas 15' a temperatura ambiente para que difunda el antibiótico.
2. Anotar las concentraciones y el tipo de antibiótico sembrado en cada disco.
3. Incubar la placa en posición invertida a 37 ºC durante 24 h.
4. Medir los diámetros de las zonas de inhibición con una regla.
5. Interpretación: Atendiendo a los resultados obtenidos con los criterios de inhibición
aceptables indicados en la tabla 7.1., clasificar los microorganismos investigados
como S, I, R. Determinar la C.M.I.
Tabla 8.1. Halos de inhibición aceptables según las normas
de la NCCLS para los antibiogramas de difusión
Halos de inhibición (mm)
Antibiótico /carga E. coli S. aureus P. aeruginosa
del disco (g) ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 27853
Amicacina/30 19-26 20-26 18-26
Amoxicilina-clavulánico/20/10 19-25 28-36 NA
Ampicilina/10 16-22 27-35 NA
Cefazolina/30 23-29 29-35 NA
Cefotaxima/30 29-35 25-31 18-22
Ceftazidima/30 25-32 16-20 22-29
Cefuroxima/30 20-26 27-35 NA
Cloranfenicol/30 21-27 19-26 NA
Ciprofloxacina/5 30-40 22-30 25-33
Clindamicina/2 NA 24-30 NA
Doxiciclina/30 18-24 23-29 NA
Eritromicina/15 NA 22-30 NA
Gentamicina/10 19-26 19-27 16-21
Imipenem/10 26-32 NA 20-28
Ácido nalidíxico/30 22-28 NA NA
Nitrofurantoína/300 20-25 18-22 NA
Norfloxacina/10 28-35 17-28 22-29
Oxacilina/1 NA 18-24 NA
Penicilina G/10 NA 26-37 NA
Piperacilina/100 24-30 NA 25-33
Tobramicina/100 18-26 19-29 19-25
Trimetoprim/Sulfametoxazol/ 24-32 24-32 NA
1,25/23,75
Vancomicina/30 NA 15-19 NA
NA = No aplicable
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Clasificación de las sustancias antimicrobianas
La evaluación de sensibilidad permite seleccionar el compuesto más adecuado para el
tratamiento de una infección bacteriana.
1. Inhibidores de la síntesis de la pared celular( Betalactámicos)
Comprende un nutrido grupo de
antibióticos naturales y
semisintéticos que tienen en común
presentar en su estructura química
un anillo -lactámico (Penicilinas,
cefalosporinas...). Su mecanismo de
acción se basa en la inhibición de la
formación del peptidoglucano,
componente esencial de la pared
celular (mureína).
El esqueleto de la pared celular bacteriana está constituido por un heteropolímero, el
glucopéptido mureína1. En su composición intervienen sustancias que no se presentan ni en
plantas ni en animales. Estos elementos estructurales singulares, constituyen un tendón de
Aquiles para la terapia médica.
La penicilina evita la formación de la mureína, impidiendo la formación de uniones
transversales por transpeptidación entre aminoácidos.
Las bacterias se diferencian esencialmente de los animales y plantas en los componentes, la
estructura, así como en las reacciones implicadas en la síntesis de la pared celular.
Los agentes terapéuticos que afecten específicamente sólo a la pared celular bacteriana y a su
síntesis, deben ser inocuos para el organismo superior hospedador.
La presencia de una capa de glucopéptido en las paredes celulares es una característica
general de todas las eubacterias dentro de las procariotas. Tan solo las arqueobacterias
(metágenas, termófilas extremas, halófilas extremas) y otros pequeños grupos (micoplasmas)
no forman glucopéptidos del tipo descrito.
1.1 Penicilinas
Desde el descubrimiento de la penicilina en 1928, se han desarrollado una multitud de
compuestos de esta familia, cuyo compuesto base es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA).
Por reacciones de sustitución con ácidos clorados pueden sintetizarse cientos de penicilinas.
1
Mureína: Heteropolímero formado por cadenas en las que se alternan N-acetilglucosamina
(G) y el ácido N-acetilmurámico (M), unidos mediante enlaces -1,4 glucosídicos. Entre los
aminoácidos de estas cadenas rectas, se forman enlaces peptídicos.
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Muchas penicilinas semisintéticas no se abren por la acción de la penicilinasa2 y pueden
administrarse por vía oral gracias a su estabilidad frente a los ácidos.
Penicilinas naturales:
Penicilina G. Activa frente a Gram (+). No actúa sobre enterobacterias.
Penicilina V. Permite la administración oral por su mayor resistencia a pH ácidos.
Penicilinas semisintéticas. Poseen cadenas laterales en el anillo betalactámico, que
les proporciona una relativa resistencia a las penicilinasas.
Oxacilina, Cloxacilina. Son penicilinas resistentes a la penicilinasa, presente en
microorganismos como el S.aureus.
Amoxicilina (Clavumox, Ardine, Clamoxil...). Amplio espectro. Actúan sobre
algunas enterobacterias. La resistencia va en aumento, 40 % de cepas E.coli.ç
Inhibidores de beta-lactamasa. Su actividad antibacteriana es reducida, pero sus
unión con algunas -lactamasas impide que éstas destruyan a los antibióticos -
lactámicos, proporcionándoles un aumento de espectro (ácido clavulánico)
1.2 Cefalosporinas
Productos de fermentación del hongo Cephalosporium, cuyo anillo base es el 7-ACA,
ácido 7-aminocefalosporánico. Los derivados semisintéticos de las cefalosporinas se
clasifican por generaciones. Las cefalosporinas de 3ª generación son efectivas frente
a penicinilasas, microorganismos Gram negativos y enfermedades graves como:
menngitis, neumonía y la septicemia.
2
Penicinilasas: Enzimas producidas por ciertas cepas bacterianas resistentes a las penicilinas
mediante la destrucción del anillo beta-lactámico (beta-lactamasas).
Porcentaje de cepas S.aureus resistentes a penicilina G: 1940- 3%, 1948-58%, 1990-90%
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2. Inhibidores de la síntesis de proteínas. Extenso y heterogéneo grupo de antibióticos.
Su actividad se centra en el ribosoma bacteriano3 70S, aunque cada grupo actúa en distintos
puntos del proceso de síntesis de las proteínas.
Actinomicetos y streptomicetos son grupos bacterianos que se caracterizan por
crecer formando micelio. Tienen una gran significación industrial como productores
de antibióticos muy activos: estreptomicina (tuberculosis), tetraciclina..
Cloranfenicol. Se encontró, en primer lugar, en cultivos de Streptomyces venezuelae,
pero actualmente se obtiene por síntesis química. Es extraordinariamente estable y
actúa contra muchas bacterias Gram negativas, también contra espiroquetas,
rickettsias, actinomicetos, anaerobios y virus de gran tamaño. No obstante, se suele
reservar para infecciones graves, debido a su toxicidad.
3. Inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos.
Quinolonas: Productos de síntesis química (quimioterápicos). Su mecanismo de
acción inhibe la formación de la enzima ADN girasa, necesaria para la duplicación del
ADN. Son bactericidas.
4. Inhibidores de la síntesis del ácido fólico.
Sulfamidas. Son antibióticos químicos de síntesis. Actúan bloqueando la síntesis de
ácido fólico, imprescindible para la producción de proteínas. Antibióticos de amplio
espectro. Se utilizan en infecciones leves.
Inhibición competitiva: El ácido paraaminobenzoico (PABA) es un componente
preciso para la síntesis del ácido fólico. Dos moléculas, sulfamida y PABA compiten
por el mismo sitio activo.
Los organismos animales no son capaces de sintetizar ácido fólico, así que toman la
coenzima (vitamina) completa en los alimentos.
3
Estos antibióticos actúan también sobre los ribosomas (70 S) de las mitocondrias y
cloroplastos de las eucariotas. Pero ya que la membrana externa de las mitocondrias, es muy
poco permeable a las moléculas de antibiótico, apenas tienen efecto sobre las células
eucariotas, a las bajas concentraciones en que se utilizan con los procariotas.
7. 8 - ANTIBIOGRAMA 125
Cuestionario
1. Explica las causas de la resistencia que presentan ante la acción de la mayoría de
antibióticos de eficacia antibacteriana:
a. Los hongos
b. Los micoplasmas
c. Los virus
2. ¿Qué es la CMI?, ¿ y la CMB?
3. ¿Cómo se clasifican los microorganismos según el grado de crecimiento alcanzado frente
a un antibiótico?
4. ¿Qué diferencia existe entre un antibiótico y un quimioterápico?
5. Clasifica los antibióticos citados en este capítulo, según sean naturales, de síntesis o
semisintéticos.
6. Recopilar en una tabla los datos siguientes:
Agente Lugar de la célula Mecanismo de Espectro de
antimicrobiano en que actúa actuación aplicación
