seminário

1. Impact Factor: 3.065
Engenharia: A1
Biotecnologia: B1
Recuperação e Purificação de
Biomoléculas
Professor: Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Doutorando: Francinaldo Leite da Silva

2. Introdução
Os Sistemas de Duas Fazes Aquosas (SDFA):
• Baixa tensão interfacial;
• Alto conteúdo de água nas duas fases;
• São adequados para a separação e purificação de proteínas,
antibióticos, aminoácidos, ácidos orgânicos e produtos
naturais.

3. Introdução
Obstáculos do SDFA:
• Recuperação dos polímeros;
• Custo elevado da recuperação;
• Poluição ambiental.

4. Introdução
Como remover os obstáculos?
R: Desenvolvimento de polímeros formadores de SDFA
com potencial de recuperação.
A recuperação de polímeros de formadores de SDFA
poderia ser conseguida através do ajuste da temperatura, pH,
força iônica e potencial elétrico.

5. Introdução
Copolímeros de óxido de etileno-óxido de propileno
termossensíveis (EO-PO) foram primeiramente relatados no
início de 1990 e que poderia formar SDFA com dextrana.
( Berggren et al., 1990)
O que são copolímeros?

6. Os polímeros termossensíveis
Os polímeros com resposta térmica exibem uma transição de fase acima
de uma determinada temperatura crítica, provocando uma alteração
súbita no estado de solvatação. Assim, existem dois tipos principais de
polímeros termossensíveis, o primeiro apresenta uma temperatura crítica
da solução mínima (LCST), enquanto que o segundo apresenta uma
temperatura de solução crítica máxima (UCST).

7. Objetivo
Estudar a eficiência dois novos polímeros (PNDB e PNBAa)
termossensíveis na formação de SDFA, bem como a sua
reciclagem.

8. Metodologia
1.Síntese dos copolímeros PNBAa e PNDB.
2. Caracterização dos copolímeros (MAGNA-IR 550 e DRX500
NMR).
3. Lower Critical Solution Temperature (LCST) de
PNBAa e PNDB.
4. Teste de formação de fases.
5. O diagrama de fases.
6. Reciclagem de copolímeros
7. Efeitos de pH e sais sobre a recuperação de polímeros e
reciclagem de polímeros recuperados.

9. Metodologia
1.Síntese dos copolímeros PNBAa e PNDB
PNBAa
3,0 g de N-isopropil acrilamida (NIPA, 26,5 Mmol)
0,12 mL de butil metacrilato (BMA, 0,76 Mmol)
0,05 mL de álcool alílico (Aa, 0,74 Mmol)
PNDB
3,0 g de N-isopropil acrilamida (NIPA, 26,5 Mmol)
0,4 mL de butil metacrilato (BMA, 0,76 Mmol)
0,6 mL de 2- (dimetilamino) -etilmetacrilato (DMAEMA,
3,56 Mmol)

10. Resultado
PNBAa
ChemBioDraw Ultra 11.0.
N-isopropil
acrilamida
butil
metacrilato
Aa
Copolímero

11. Resultado
PNDB
ChemBioDraw Ultra 11.0.
N-isopropil
acrilamida
butil
metacrilato
2-(dimetilamino)
-etilmetacrilato
Copolímero

12. Metodologia
Determinação da LCST através da temperatura mínima no
ponto de nuvem. (C. Boutris et. al, 1997).
LCST: temperatura crítica da solução mínima
“A temperatura no ponto de nuvem corresponde a
temperatura em que acima dela corre a formação de duas
fases.”

13. Resultado
LCST de PNBa e PNDB
31.3 °C
25.5 °C
• Copolímeros termossensíveis
apresentam natureza
hidrofóbica/hidrofílica.
• A temperatura superior de PNDB é
atribuída a DMAEMA.

14. Metodologia
Teste de formação de fases:
• Diferentes concentrações de PEG 1000, PEG 20000, Dextran 20000,
polipropileno glicol (PPG), (NH4) 2SO4, PNBC, PNNC, PABC e PADB
foram usadas para testar possibilidade de formação de ATPS com
os dois copolímeros.
• Estes copolímeros foram dissolvidos em tampão Na2HPO4 / NaH2PO4
(pH 7,0) ou água destilada.
• A concentração inicial de copolímero escolhida foi 10%.

15. Resultado

16. Metodologia
O Diagrama de Fase
• Medição da composição do sistema ternário PNBAa, PNDB e água
por APLC;
• Coluna C18 da Phenomenex.
• Fase móvel: metanol/tampão fosfato (1:1), fluxo de 1 mL/min.
• Cromatogramas detectados por UV a 210 nm.
• 20 amostras foram injetadas na HPLC.
• Séries de misturas foram mantidas em temperatura ambiente entre
4-6h até formar a fase clara.
Amostras do fundo e da parte superior foram coletadas para
determinar as concentrações dos polímeros PNDB e PNBAa.
Diferentes concentrações de PNDB e PNBAa foram testas em HPLC.

17. Resultado
Curva de equilíbrio/binodal
M: Total da composição de
copolímeros
T: Concentração na fase de topo
B: Concentração na fase de fundo
I
II

18. Metodologia
Reciclagem dos copolímeros
Foi observado que os polímeros são recicláveis a quase 10 °C acima da
temperatura crítica da solução mínima (LCST), 40 ° C:
• Centrifugação a 8000 rpm, 30 min;
• Secagem a vácuo ;
• Quantificação dos dois polímeros;
• Reciclagem 5 vezes para estimar a recuperação .
Análise do efeito do pH e de sais na recuperação foram investigados.

19. Resultados
Reciclagem dos copolímeros
• A natureza
hidrofóbica/hidrofílica dos
copolímeros termossensíveis
permitiram a precipitação.
• Os polímeros tornam-se
insolúveis por causa das ligações
de H.
• Se mantida a recuperação acima
95% os copolímeros teoricamente
podem ser reciclados até 60
vezes.

20. Resultado
Influência do pH e de sais na recuperação dos copolímeros
• Recuperação aumenta em certa de 1% entre o pH de 4 a 10. Pode ser atribuído às
cargas positivas do grupo amina do PNDB.
• Os copolímeros tem recuperação de 1 a 2% com a adição de 40mM de sais do que
quando comparado sem ao sistema sem adição de sal.

21. Metodologia
Separação de democlociclina em PNBAa – PNDB SDFA
Democlociclina - Antibiótico derivado da tetraciclina. Anfotérico e
estável em condição ácida
• Foi estudado pH de 4 a 8, e diferentes sais no coeficiente de
partição.
• As duas fases foram separadas com uma seringa e os copolímeros
recuperados induzidos por temperatura.
• Os copolímeros foram novamente dissolvidos para formar SDFA e
repetido o processo anterior.
• A concentração de democlociclina inicial foi de 2mg/mL.
• Medição por UV: democlociclina (362 nm), PNBAa (210nM) e PNDB
(217).

22. Resultado
Partição de democlociclina em diferentes pH e tipos de sais.
• pH influenciou na partição de moléculas carregas no SDFA com polímeros
termossensíveis (pH: 5,5, K=2,23).
• O coeficiente de partição foi melhorado para K=2,61 a 80 Mmol/L de sulfato de
amônio.

23. Conclusões
• Dois novos copolímeros termossensíveis PNDB e PNBAa foram
sintetizada no presente estudo.
• Eles podem formar SDFA uns com os outros.
• Ambos polímeros são termossensíveis, e pode ser reciclado por uma única
condição de temperatura, com a recuperação de mais de 97%.
• Democlociclina foi separada nos sistemas de SDFA com PNBAa / PNDB.
O coeficiente de partição K de democlociclina atingiu 2,61 com 80 mM (NH4) 2SO4.
• O trabalho foi só uma investigação preliminar. Muito trabalho precisa ser feito no
futuro. Acredita-se que a reciclagem de SDFA termossensível têm potenciais
aplicações na indústria.