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M1 Pierre FENET

  1. 1. Université Paris Descartes MASTER 1 BIOLOGIE CELLULAIRE PHYSIOPATHOLOGIE Marqueurs biochimiques de l’insuffisance cardiaque aigue Rapport de stage : Juin-Juillet 2012 INSERM U942 - Hôpital Lariboisière Pierre FENET Maitre de stage : jane-lise.samuel@inserm.fr
  2. 2. Remerciements Je tiens à adresser mes remerciements au Dr Jane-lise SAMUEL mon maître de stage pour son accueil, son soutien ainsi que son aide pour la rédaction de ce rapport de stage. Je souhaite remercier le Professeur Philipe Manivet ainsi que Jerôme Denis pour le temps qu’ils ont pu m’accorder pendant ce stage. Je tiens à remercier Alexandre MEBAZAA pour m’avoir bien accueillie au sein de l’unité en tant que stagiaire et le Professeur Cohen Solal directeur de l’Unité 942, ainsi que Claude Delcayre pour son accueil. Je souhaite remercier également Malha Sadoune pour son aide précieuse et sa disponibilité et Loubina pour son gout à transmettre les techniques de manipulation sur la paillasse. Aussi je ne saurais oublier le reste de l’équipe et tous les collègues du laboratoire. 2
  3. 3. INTRODUCTION Dans le cadre de mon master 1 « Biologie cellulaire, physiologie et pathologie », j’ai eu la chance et l’opportunité de réaliser mon stage à l’unité 942 de l’Inserm à l’hôpital Lariboisière. Cette unité a pour principal sujet la recherche de nouveaux biomarqueurs des maladies cardiaques notamment dans l’insuffisance cardiaque et ceci grâce à une équipe multidisciplinaire composée de cardiologue, réanimateur, biochimiste, urgentiste mais aussi des scientifiques pour la recherche fondamentale et de pharmaciens biologistes experts dans la détection de biomarqueurs. Ces professionnels sont en liaison avec la PRB (plateforme de ressources biologiques) du site qui permet la conservation de banques d’échantillons biologiques tels que le plasma. Les principaux thèmes sur lesquels travaillent actuellement l’U942 sont : - L’identification de marqueurs diagnostiques et/ou prédictifs du risque évolutif (décès, insuffisance cardiaque) dans l’insuffisance cardiaque aigue, testés à la fois chez l’animal et chez le patient - La validation de ces biomarqueurs d’intérêt identifiés, et en comparaison avec ceux utilisés actuellement en clinique sur des cohortes de patients. - La compréhension des mécanismes d’action de certains désordres hormonaux comme l’aldostérone ou métaboliques (diabète) qui influencent l’évolution de la défaillance cardiaque. 3
  4. 4. 1. Epidémiologie, définition Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité des pays développés soit plus de 40%. Il y a environ 1 million de malades d’insuffisants cardiaques en France avec un pronostic qui reste grave pour la survie à 5 ans : 25% pour les hommes et 38% pour les femmes. La fréquence de cette maladie a doublé en 10 ans notamment en raison du vieillissement de la population et de la meilleure prise en charge des maladies cardiaques, qui à long terme peuvent entrainer une insuffisance cardiaque. 300 000 à 400 000 ont des difficultés à mener une « vie normale » à cause de la maladie. Aussi avec 150 000 hospitalisations par an, l’insuffisance cardiaque est la première cause d’hospitalisation en France chaque année (avec une durée moyenne de séjour de 11 jours). Plus de 32 000 décès annuels sont attribuables à l’IC. Les dépenses liées à cette maladie représentent plus de 1% des dépenses médicales totales. L’insuffisance cardiaque (IC) est l’incapacité du cœur à assurer le débit sanguin nécessaire aux besoins métaboliques et fonctionnels de l’organisme. Deux formes principales, qui aboutissent toutes les deux à une diminution du débit cardiaque : - L’insuffisance cardiaque systolique avec un défaut d’éjection du sang par le ventricule gauche et une altération de la fonction systolique (FEVG) - L’insuffisance cardiaque diastolique avec un défaut de remplissage du VG qui chasse bien et une conservation de la fonction systolique La conjonction des deux formes est possible : IC systolo-diastolique L’IC peut apparaître à n'importe quel âge et elle peut avoir plusieurs causes ; chez les adultes, elle est le plus souvent due à un rétrécissement des artères qui alimentent le muscle cardiaque (coronaropathie ou ischémie cardiaque), à une hypertension artérielle non traitée ou à des lésions des valves cardiaques. Chez environ un tiers des insuffisants cardiaques, les artères coronaires sont normales et aucun antécédent d'hypertension n'est retrouvé ; cette pathologie s'appelle la cardiomyopathie congestive (CMC). Le cœur ne propulsant pas correctement le sang vers les organes comme les reins ou le cerveau, ils reçoivent moins d'oxygène. Certains patients souffrant d'insuffisance cardiaque présentent un asynchronisme cardiaque ; les deux cavités inférieures du cœur (appelées ventricules gauche et droit) ne battent pas en même temps ou les différentes parties du ventricule se contractent de façon non synchrone. Ceci conduit à une altération de l'efficacité de la pompe cardiaque et peut contribuer à une majoration des symptômes d'insuffisance cardiaque.1 Il existe une classification (NYHA= New York Heart Association) qui permet de diviser en catégories les malades atteint de la maladie : 4
  5. 5. Les différents signes cliniques de l’IC sont les suivants : 2. Les différents biomarqueurs Les médiateurs neuro-hormonaux : 3 types de peptides majeurs, le peptide atrial natriurétique ANP, le peptide natriurétique de type C qui est d’origine endothéliale et le plus connu le brain natriuretic peptide BNP d’origine cardiaque. L’excrétion de ces molécules résulte de l’étirement des cardiomyocytes due à une élévation du stress pariétal par surcharge en pression ou volume. Le BNP est synthétisé par secreté par le VG, sous effet de stimuli mécaniques (étirement des cardiomyocytes) après clivage du pro-BNP en NT-pro-BNP inactif et BNP actif. Ce BNP vient se fixer sur ses récepteurs NRP A et B (pour natriuretic peptide receptor), ce qui active la guanylate cyclase et ensuite le GMPc. Il inhibe les effets vasoconstricteurs du SRAA (système rénine angiotensine aldostérone), et augmente ainsi l’excretion du sodium dans le rein et donc de l’eau (diminue donc la volémie). Le BNP diminue chez ces malades 5
  6. 6. la pré charge (étirement des fibres myocardiques avant la contraction ce qui correspond au degré de remplissage du ventricule, volume télé diastolique VTD) et la post charge (la force contre laquelle s’oppose l’éjection du sang dans la circulation c'est-à-dire la pression artérielle). Ce peptide permet de stratifier la sévérité de l’IC, il a un intérêt diagnostique. C’est un biomarqueur de l’insuffisance cardiaque et de la dysfonction du ventricule gauche. Aussi sa diminution témoigne de l’efficacité thérapeutique et est corrélé au pronostic de l’IC. Son taux plasmatique est corrélé à la pression de remplissage du VG. Depuis quelques années, le dosage plasmatique des peptides natriurétiques (BNP et NT- proBNP) aux urgences et en cardiologie a permis de mieux distinguer l’origine cardiaque de celle non cardiaque (par exemple infection pulmonaire) des dyspnées aigues. Aussi plusieurs causes non cardiaques peuvent entrainer une augmentation des peptides natriurétiques : pathologies non cardiaques qui entrainent un stress myocardique, HTAP (hypertension artérielle pulmonaire), insuffisance rénale (par baisse de la clairance), BPCO (broncho-pneumopathie chronique obstructive), pneumonie, SCA (syndrome coronarien aigue). Il faut savoir aussi que le niveau de peptides natriurétiques augmente significativement avec l’age. Il peut y avoir de grandes variations de ces valeurs chez une même individu.2 6
  7. 7. Face à cette zone grise (entre 100 et 400pg/ml pour le BNP), le besoin d’autres biomarqueurs est apparu nécessaire et c’est pourquoi des recherches ont été engagées. Ainsi le laboratoire où j’effectue mon stage (inserm U942) a publié en Mai 2012 un article dans le prestigieux journal « European heart journal » : les auteurs présentent la protéine QSOX1 (Quiescin sulfhydryl oxydase), en concentration dosable dans le plasma, comme un possible nouveau biomarqueur dans le diagnostic de l’insuffisance cardiaque aigue. QSOX1 est hautement spécifique et sensible dans le diagnostic de l’ICA pour des patients présentant des dyspnées avec des performances qui égalent le BNP et le NT-proBNP.3 3. QSOX1 : Les sulfhydryl oxydases sont des enzymes qui catalysent la réaction d’oxydation de résidus thiols par l’oxygène moléculaire pour former des ponts disulfures. Cette réaction s’accompagne d’une libération de peroxyde d’hydrogène (H2O2). 7
  8. 8. Les groupements thiols (SH) de peptides et de protéines réduits sont des substrats potentiellement oxydables par ces enzymes. Au cours de la réaction, l’oxygène moléculaire est réduit en peroxyde d’hydrogène. Deux grandes classes d’enzymes à activité sulfhydryl oxydasique ont été étudiées depuis le début des années 70 : les métalloprotéines dépendantes du cuivre ou de fer, et les flavoprotéines dépendantes du FAD (pour flavine adénine dinucléotide). Les flavoprotéines sont réparties en deux groupes, la famille des protéines ERV1/ALR (pour essential for respiration and viability/ augmenter of liver regeneration) et la famille QSOX (pour quiescine suflhydryl oxydase). La sulfhydryl oxydase bovine a été isolée à partir du lait.4 En présence de cette enzyme, la RNase A et le chymotrypsinogène A acquièrent leur conformation fonctionnelle plus rapidement qu’en son absence. Ce résultat suggère que les sulfhydryl oxydases pourraient être impliquées dans la maturation des protéines en intervenant dans leur repliement grâce à la formation de ponts disulfure. Elles ont pour rôle d’oxyder le DTT (dithiotréiol), la NAC (N-acétyl cystéine), et la cystéamine. La famille des protéines ERV1/ALR comprend les protéines ERV1 et ERV2 qui ont été identifiées chez la levure Saccharomyces cerevisiae5. ERV1 pourrait jouer un rôle dans le cycle cellulaire, le maintien du génome mitochondrial et l’assemblage des protéines fer-soufre cytosoliques6. ERV2 est localisée dans le réticulum endoplasmique et oxyde la protéine disulfure isomérase (PDI) en parallèle de l’action de la protéine Ero1p7. Le gène ALR est l’orthologue chez les mammifères du gène ERV18. Le gène QSOX1 humain est localisé sur le chromosome 1 dans une région potentiellement impliquée dans une forme héréditaire de cancer de la prostate.9 Chez l’homme, un site d’épissage alternatif au sein de l’exon 12 entraine la formation de deux transcrits.10 Les protéines codées par les deux ARN messagers ont été désignés par Thorpe et al en 2002, QSOX1-L (long) et QSOX1-S (short). 8
  9. 9. QSOX1 est présent de manière ubiquitaire, mais il existe toutefois une variation d’expression entre les tissus mais surtout entre les différents types cellulaires. Objectif général : Notre objectif a été durant ce stage de tester les approches ELISA pour doser QSOX1 comme biomarqueur dans l’insuffisance cardiaque aigue. Matériel et méthode : a)Dosage de QSOX1 à l’aide d’un kit ELISA Ce dosage a été effectué sur une soixantaine d’échantillons de plasma humains (obtenu grâce à la PRB) présentant une dyspnée d’origine 9 les séquences polypeptidiques des membres de la famille QSOX1 présentent plus de 70% d’identité entre elles, et moins de 50% d’identité avec les protéines QSOX2, entre espèces ou au sein d’une même espèce11. Des caractéristiques structurales propres aux membres de la famille QSOX émergent de ces homologies de séquences. Trx : domaine thiérodoxine. D’après Coppock et Thorpe, 2006 Les protéines QSOX1 possèdent une séquence d’adressage au réticulum endoplasmique à l’extrémité amino-terminale mais pas de séquence de rétention (K,H)DEL pour ce compartiment cellulaire. Le premier domaine Trx1 contient le motif WCGHC typique des PDI. Le domaine Trx2 ne contenant pas de motif CxxC, parait inactif du point de vu rédox12. Les protéines QSOX1 possèdent un domaine espaceur qui pourrait intervenir dans la liaison du
  10. 10. cardiaque (ICA) (=AHF) ou non (non AHF). Aussi des témoins ont été intégrés dans ces échantillons ainsi qu’une gamme fournie par le fabriquant. Brièvement, la solution standard de 20 ng/ml est diluée de manière à fournir 7 solutions à 10 ; 5 ; 2.5 ; 1.25 ; 0.625 ; 0.312 et 0 ng/ml servant d’étalon. Les échantillons doivent être dilué au 1/500e dans du PBS, puis adjonction de 100 µL des ces échantillons ou standard dans chaque puits et incubation pendant 2 heures à 37°C. Après lavage, adjonction de 100 µL d’anticorps « Detection Reagent A » puis incubation pendant 1h à 37°C. Puis après 3 lavages réalisés à l’aide de la solution Wash 1X fournie par le fabriquant, adjonction de 100 µL « Detection Reagent B » et incubation 30 mn à 37°C. Enfin après 5 lavages à l’aide de la même solution que précédemment, adjonction de 90 µL de la solution TMB, incubation 15-25min à 37°C à l’abri de la lumière et ajout du substrat qui rend la solution bleu, ajouter 50 µL de la solution Stop et mesurer immédiatement l’absorbance à 450 nm. 10
  11. 11. Protocole ELISA qSOX1 (USCN E92759Hu) Préparation des réactifs Tous les réactifs être à TA avant utilisation (environ 1 heure). - Standard : à reconstituer avec 0,5 mL de Standard Diluent. Laisser 15 minutes à TA en remuant doucement sans faire mousser. La concentration du Standard est de 20 ng/mL. - Assay Diluent A et Assay Diluent B : diluer 6 mL d’Assay Diluent A ou B avec 6 mL d’eau milliQ. - Detection Reagent A et Detection Reagent B : remuer brièvement puis diluer au 1/100e avec l’Assay Diluent A ou B. - Wash Solution : diluer 20 mL de Solution Wash concentrée (30X) avec 580 mL d’eau milliQ pour préparer 600 mL de Solution Wash 1X. - TMB Substrate: prêt à l’emploi. Pipeter le volume nécessaire sans remettre l’excédent dans le flacon. Les réactifs reconstitués (Standard, Detection Reagent A et B) ne peuvent être utilisés qu’une seule fois. Protocole - Préparer la gamme d’étalonnage : 11
  12. 12. ! - Préparer les échantillons : ils doivent être dilués au 1/500e dans du PBS. Par exemple : première dilution (au 1/20e) : 10 µL de plasma dans 190 µL de PBS puis deuxième dilution : 20 µL du plasma dilué au1/20e dans 480 µL de PBS. - Déposer 100 µL d’échantillon dilué ou de standard dans chaque puits. Incuber 2h à 37°C. - Retourner la plaque pour jeter le liquide et bien l’égoutter sur du papier absorbant pour tout enlever complètement. - Ajouter 100 µL de Detection Reagent A à chaque puits. Coller un film transparent sur la plaque. Incuber 1h à 37°C. point de
 gamme volume de Standard volume de Standard Diluent concentratio n
 (en ng/mL) P1 500 µL 0 20 P2 250 µL de P1 250 µL 10 P3 250 µL de P2 250 µL 5 P4 250 µL de P3 250 µL 2,5 P5 250 µL de P4 250 µL 1,25 P6 250 µL de P5 250 µL 0,625 P7 250 µL de P6 250 µL 0,312 P8 0 250 µL 0 12
  13. 13. - Aspirer la solution et laver avec 350 µL de solution Wash 1X à l’aide d’une pipette multicanaux et laisser 1-2 minutes. Retirer complètement le liquide de chaque puits en retournant la plaque et en l’égouttant sur du papier absorbant. Au total, laver 3 fois. - Ajouter 100 µL de Detection Reagent B à chaque puits. Coller un film transparent sur la plaque. Incuber 30 minutes à 37°C. - Aspirer la solution et laver avec 350 µL de solution Wash 1X à l’aide d’une pipette multicanaux et laisser 1-2 minutes. Retirer complètement le liquide de chaque puits en retournant la plaque et en l’égouttant sur du papier absorbant. Au total, laver 5 fois. - Ajouter 90 µL de Substrate Solution TMB à chaque puits. Coller un film transparent sur la plaque. Incuber 15-25 minutes à 37 °C (ne pas dépasser 30 minutes !). Protéger la plaque de la lumière : l’ajout de Substrate Solution rend le mélange bleu. - Ajouter 50 µL de Solution Stop à chaque puits : le liquide devient jaune. Mélanger le liquide en tapotant la plaque sur le côté. - Mesurer immédiatement l’absorbance à 450 nm. ! 13
  14. 14. Résultats : 1.Dosage de QSOX1 à l’aide du kit ELISA Les résultats des dosages à l’aide de ce kit commercialisé par l’entreprise « Uscn Life Science Inc. » ne donnent pas de différences significatives entres les échantillons de plasma de patients ayant fait un épisode d’ICA et des autres ayant présenté une dyspnée d’origine non cardiaque. qSox1 qSox-1enng/mL 0,000 175,000 350,000 525,000 700,000 sains non AHF AHF 610,8452593,1845 334,0512 14
  15. 15. Cependant il faut nuancer ces résultats car la gamme d’étalonnage fournie par le fabriquant dans le kit ne semble pas infaillible : en effet il est d’usage d’effectuer pour un même dosage deux gammes pour s’assurer qu’il n’y ait pas trop de différences entre celle- ci et donc de leurs exactitudes. On observe en effet des différences significatives pour les densités optiques (DO) pour les points P3, P4, P5, et surtout P6. qSOX1 moyenne sem ecart type sains 334,051 63,957 90,449 non AHF 593,185 33,419 224,178 AHF 610,845 42,404 212,02 gamme DO moyenne c en ng/ mL P1 2,360 2,409 2,385 20 P2 1,213 1,375 1,294 10 P3 0,725 1,172 0,949 5 P4 0,524 0,611 0,567 2,5 P5 0,506 0,622 0,564 1,25 P6 0,390 0,523 0,457 0,625 P7 0,356 0,378 0,367 0,3125 P8 0,369 0,387 0,378 0 ♂ sain 0,358 0,528 0,443 0,66 ♀ saine 0,356 0,994 0,675 3,00 15
  16. 16. Aussi il est difficile de conclure quant à l’exactitude de ces résultats. Cette réserve est due à la faible sensibilité du kit de dosage. Néanmoins, il est à noter qu’un dosage de la molécule d’adhésion CD146 a aussi été effectué sur les mêmes échantillons, à l’aide d’un kit fournie par une autre compagnie. Suite à l’approche protéomique effectuée (pour réaliser l’article parue en Mai dans European heart journal), la protéine CD146 faisait figure aussi de biomarqueur potentiel. Cette molécule est décrite dans la littérature comme biomarqueur de cellules endothéliales. Elle est exprimée dans toutes les cellules endothéliales chez l’humain, sur tous les types d’endothélium avec une localisation préférentielle dans la jonction intercellulaire. Elle est détectable dans le sérum humain et son niveau est modulé dans différentes pathologies comme l’insuffisance rénale chronique, les maladies intestinales ou inflammatoires. Toutefois son rôle exact est encore largement inconnu. Les gammes d’étalonnages sont ici beaucoup plus proches en terme de DO avec quasiment les mêmes valeurs pour les différentes dilutions. qSox1 - gamme DO 0,000 0,750 1,500 2,250 3,000 [qSox1] en ng/mL 0 5 10 15 20 y = 0,0992x + 0,3778 R² = 0,9936 Dilution Moyenne DO450 nm corrigées logDO450 nm corrigées sCD146 (ng/mL) logsCD146 D1 0,860 0,852 0,796 0,790 0,793 -0,101 160 2,204 D2 0,600 0,602 0,535 0,540 0,538 -0,269 80 1,903 D3 0,388 0,370 0,324 0,308 0,316 -0,500 40 1,602 D4 0,252 0,231 0,188 0,169 0,178 -0,749 20 1,301 D5 0,154 0,152 0,090 0,090 0,090 -1,046 10 1,000 D6 0,064 0,062 0 0 0 - 0 - DO450 nm brutes DO450 nm corrigées 16
  17. 17. On obtient avec cette gamme d’étalonnage des différences significatives entre les échantillons AHF et non AHF avec en ordonné la concentration de CD146 en ng/ml Gamme d'étalonnage CY-QUANT ELISA sCD146 log(DO450nmcorrigée) -1,1 -0,8 -0,6 -0,3 0,0 log sCD146 0,0 0,6 1,3 1,9 2,5 y = 0,7873x - 1,7943 R² = 0,9903 0 400 800 1200 1600 sain non AHF AHF 1430,7 375,5330,06 CD146 moyenne sem ecart type sain 330,058 non AHF 375,5 18,7 125,4 AHF 1430,7 171,8 858,8 17
  18. 18. Annexe : histogramme représentant les valeurs du BNP chez des patients AHF et non AHF. Discussion & Conclusion : Il est possible que le premier test ELISA dosant le qSOX1 ne donne pas les résultats attendus pour un raison simple : l’anticorps utilisé dans le test mis en place par l’entreprise « Uscn » n’est pas ou est peu spécifique de qSOX1 mais reconnait les qSOX et donc se lie à qSOX1 ainsi qu’à qSOX2. Ceci expliquerait la faible différence observée dans le tableau entre les AHF et les non AHF (en effet en partant du principe que la concentration qSOX2 dans le plasma ne soit pas modifiée dans la maladie, la différence entre les sommes qSOX1 et 2 seraient plus ténues). Aussi il aurait été intéressant de doser l’activité enzymatique de qSOX1 pour savoir si la protéine, qui est relâchée au cours de l’insuffisance cardiaque aigue, est active au cours de cet épisode ou alors est juste présente en concentration importante. Ceci nous amène vers la question des rôles cellulaires possibles de qSOX1 : plusieurs lui ont potentiellement été définis dans la littérature. Comme on l’a vu précédemment, qSOX1 permet entre autre la formation de ponts disulfures dans les protéines secrétées. Aussi la protéine catalyse la production de peroxyde d’hydrogène qui n’est pas sans conséquences pour l’organisme car il peut jouer des rôles bénéfiques et délétères ; en effet outre son rôle anti microbien, il participe aussi au stress oxydant. Enfin, qSOX1 aurait un rôle dans le contrôle négatif du cycle cellulaire : la découverte de qSOX1 dans des fibroblastes quiescents est un premier argument. L’augmentation de l’expression des messagers de qSOX1 dans des cellules décollées des boites de cultures et dans les cellules confluentes corroborent cette hypothèse. En effet dans ces situations les cellules envoient et reçoivent des signaux inhibant la prolifération. QSOX1 pourrait jouer un rôle dans les voies de signalisation afin de ralentir le cycle cellulaire. Mais les 0 400 800 1200 1600 non AHF AHF 18
  19. 19. mécanismes mis en jeu dans la régulation de l’expression de qSOX1 et son rôle dans ce processus ne sont pas connus. Bibliographie 1. http://www.parlonsinsuffisancecardiaque.com/heart-failure/what/index.htm 2. Januzzi JL Jr, camargo CA, Anwaruddin S, Baggish AL, Chen AA, Krauser DG, Tung R, Cameron R. The N-terminal Pro-BNP investigation of dyspnea in the emergency department (PRIDE) study. American journal of cardiology (2005) 3. Mebazaa A, Vanpoucke G, Thomas G, Verleysen K, Cohen-Solal A, Vanderheyden M, Bartunek J, Mueller C, Launay JM, Van Landuyt N, D'hondt F, Verschuere E, Vanhaute C, Tuytten R, Vanneste L, De Cremer K, Wuyts J, Davies H, Moerman P, Logeart D, Collet C, Lortat-Jacob B, Tavares M, Laroy W, Januzzi JL, Samuel JL, Kas K. Unbiased plasma proteomics for novel diagnostic biomarkers in cardiovascular disease: identification of quiescin Q6 as a candidate biomarker of acutely decompensated heart failure. European heart journal (2012) 4. Janolino V.G., Swaisgood H.E. Isolation and characterization of sulfhydryl oxidase from bovine Milk. J Biol Chem (1975) 250,2532-8 5. Lisowsky T. Dual function of a new nuclear gene for oxidative phosphorylation and vegetative growth in yeast. Mol Gen Genet (1992) 232,58-64 6. Lisowsky T. ERV1 is involved in the cell-division cycle and the maintenance of mitochondrial genomes in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet (1994) 26, 15-20 19
  20. 20. Sevier C.S., Cuozzo J.W., Vala A., Aslund F., Kaiser C.A. A flavoprotein oxidase defines a new endoplasmic reticulum pathway for biosynthetic disulphide bond formation. Nat Cell Biol (2001) 3, 874-82 7. Sevier C.S., Cuozzo J.W., Vala A., Aslund F., Kaiser C.A. A flavoprotein oxidase defines a new endoplasmic reticulum pathway for biosynthetic disulphide bond formation. Nat Cell Biol (2001) 3, 874-82 8. Polimeno L., Lisowsky T., Francavilla A. From yeast to man--from mitochondria to liver regeneration: a new essential gene family. Ital J Gastroenterol Hepatol (1999) 31, 494-500 9. Coppock D.L., Cina-Poppe D., Gilleran S. The quiescin Q6 gene (QSCN6) is a fusion of two ancient gene families: thioredoxin and ERV1. Genomics (1998) 54, 460-8 10. Thorpe C., Hoober K.L., Raje S., Glynn N.M., Burnside J., Turi G.K., Coppock D.L. Sulfhydryl oxidases: emerging catalysts of protein disulfide bond formation in eukaryotes. Arch Biochem Biophys (2002) 405, 1-12 11. Hoober K.L., Thorpe C. Egg white sulfhydryl oxidase: kinetic mechanism of the catalysis of disulfide bond formation. Biochemistry (1999) 38, 3211-7 12. Thorpe C., Hoober K.L., Raje S., Glynn N.M., Burnside J., Turi G.K., Coppock D.L. Sulfhydryl oxidases: emerging catalysts of protein disulfide bond formation in eukaryotes. Arch Biochem Biophys (2002) 405, 1-12 13. Coppock D.L., Thorpe C. Multidomain flavin-dependent sulfhydryl oxidases. Antioxid Redox Signal (2006) 8, 300-11 14. Benayoun B., Esnard-Feve A., Castella S., Courty Y., Esnard F. Rat seminal vesicle FADdependent sulfhydryl oxidase. Biochemical characterization and molecular cloning of a member of the new sulfhydryl oxidase/quiescin Q6 gene family. J Biol Chem (2001) 276, 13830-7 20
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