1. Molecular Epidemiology of Methicillin-Resistant
Staphylococcus hominis (MRSHo): Low Clonality and
Reservoirs of SCCmec Structural Elements
Ons Bouchami, Assia Ben Hassen, Herminia de Lencastre, Maria Miragaia
Stanislav Cardona Cardona
Cielo Castro Correa
Molecular Biology
Medicine-UPB
Agosto-2011

2. INTRODUCTION
Staphylococcus
•Are gram-positive cocci
•Bunch of grapes
•Diameter of 0,5 y 1µm
•The genus includes 40 species and
24 subspecies.
•Some species normally grow in
specific niches.
•These bacteria are present
in human skin and mucous
membranes.

3. INTRODUCTION
Staphylococcus
•Grow in a medium with a high
concentration of salt
(eg sodium chloride 10%) and temperature
of 18-40 ° C.
•Key differences are: oxygen
requirements, morphology, growth
requirements (45°C and supplements)
•Is a facultative anaerobic coconut.

4. INTRODUCTION
Hominis
•S. hominis may occasionally cause
infection in patients whose immune
system is compromised, for example
by chemotherapy.
•S. hominis tends to colonize in areas
with numerous apocrine glands, such
as axillae and the pubic region.
•S. hominis cell are gram-positive cocci
and are usually 1.2 to 1.4 micrometers
in diameter.
•Colonies of S. hominis are small,
usually 1–2 mm after 24 hours.

5. INTRODUCTION
Bacterial resistance
• 1945: Alexander Fleming: Penicillin
• Bacterial resistance may have
different causes, in general,
all include changes in genetic
information, either by mutation or
by introducing new genes.
• These genetic
changes cause biological changes
in the bacteria and these
are responsible of the resistance.

6. INTRODUCTION
Methicillin
•The resistance against
the meticila bacterial penicillin are
mediated by the acquisition of a
gene (mecA).
•Methicillin inhibits the synthesis
of bacterial cell wall.
•Prevents the formation of
crosslinks between
the linear peptidoglycan polymer
chains that are an important
component of the cell wall
of gram-positive bacteria.

7. INTRODUCTION
SCCmec
• The acquisition of a gene (mecA)
that encodes a novel penicillin-
binding protein, PBP2, which does
not bind to penicillin, but retains its
enzymatic activity.
• The mecA gene is located on
chromosome mec staphylococcal
cassette (SCCmec) and five gene
sequences described in this
cassette (type).

8. INTRODUCTION
Relationship between antibiotic resistance of
Staphylococcus, the methicillin and the gene
•The methicillin resistance of the S.
hominis is determined by the
presence of mecA gene that provides
the antibiotic resistence.
•This is going to be proved by taking
isolates from diferent hospital units,
antiobiotic susceptibility testing and
gene identification.

9. GENERAL OBJECTIVE
Find molecular epidemiology of S. hominis
through the description of the diversity of clonal
types in MRSHo and MSSHo and reservoirs of
SCCmec structural elements and a detailed
analysis on the most likely contribution of S.
hominis to SCCmec evolution.

10. MATERIALES Y MÉTODOS
Ética
Declaración de ética: Aprobado por el Comité
Local de Ética Médica del Hospital de Charles
Nicolle, Túnez, Túnez.

11. MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento
Un total de 34 aislamientos nosocomiales de
pacientes neutropénicos en las unidades del
injerto o hematológicas en diferentes hospitales
de Túnez.

12. MATERIALES Y MÉTODOS
Controles
• S. aureus ATCC25923 y S. epidermidis RP62A, control de calidad.
• S. hominis ATCC27844T identificación en ITS-PCR.
• S. aureus NCTC10442, N315, 85/2082, JCSC4744, WIS y HDE288
identificacion de SCCmec tipo I, II, III, IV, V y VI.
• S. aureus cepa COL para la sonda de mecA y como control positivo de
ccrAB1 en los ensayos de hibridación.

13. MATERIALES Y MÉTODOS
Controles
• S. aureus WIS para sonda ccrC.
• S. epidermidis RP62A de control interno de PFGE y el origen de la sonda
ccrAB2.
• S. aureus 85/2082 control positivo para ccrAB3 y ccrC en los ensayos de
hibridación.
• S. epidermidis ATCC12228 control positivo para ccrAB2 y ccrAB4.
• HDE288 fuente de sonda ccrAB4.

14. MATERIALES Y MÉTODOS
Identificación ITS - PCR
El ADN fue aislado por el método de extracción
de guanidina isotiocianato utilizando los
cebadores G1 (5-GAAGTCGTAACAAGG) y L1
(5-CAAGGCATCCACCGT). Programa consistió
en un paso de desnaturalización durante 4
minutos a 25 ciclos a diferentes temperaturas.

15. MATERIALES Y MÉTODOS
Protocolos de pruebas de sensibilidad para antimicrobianos
Penicilina G Gentamicina Cloranfenicol
Oxacilina Kanamicina Rifampicina
Cefoxitina Tobramicina Ofloxacina
Cotrimoxazol Eritromicina Ciprofloxacina
Estreptomicina Pristinamicina Vancomicina
Amoxicilina Lincomicina Teicoplanina
Amoxicilina y Tetraciclina y Ácido Fosfomicina
Ácido Clavulánico fusídico

16. MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación del DNA
• El DNA fue preparado
mediante el PFGE: Similar
a la electroforesis en gel
estándar, pero la tensión
se cambia periódicamente
entre el eje central y los
dos n ángulos de 120
grados a cada lado. PFGE
se puede utilizar para
determinar el genotipo o la
huella genética.

17. MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación del DNA
• El DNA para PCR preparado mediante ITS-PCR es una técnica
de amplificación enzimática en este caso necesitaban hacer la
identificación de los genes de resistencia que estaban
asociados con el staphylococcus.

18. MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación del DNA
• Los fragmentos de DNA digeridos en Xhol que se encontraban
en los geles de PFGE, fueron trasladados al vacío Blot, e
hibridado con una sonda de ADN para mecA usando ECL, este
sistema permite detectar la presencia de una secuencia de
ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico.

19. MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación del DNA
• El análisis de complejos mec y ccr fue analizado mediante
reacción de PCR.
• Los tipos de SCCmec en el S. hominis fue definido por la
combinacion del complejo ccr y complejo mec.
• Los complejos ccr y mec no fueron tipificados cuando la
amplificación PRC no se produjo con los primers usados.

20. MATERIALES Y MÉTODOS
Southem blotting
• Southern blot o hibridación Southern, es un método permite
detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla
compleja de este ácido nucleico. Se emplea la electroforesis en gel
de agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los
fragmentos de ADN, después, una transferencia a una membrana
en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.

21. RESULTADOS
Optimización del método de marcado PFGE para S. hominis
• La enzima SmaI genera un patrón de 4-5 sólo fragmentos,
utilizando el protocolo definido por S. aureus.
• Al utilizar la enzima XhoI y cambiar las condiciones de
funcionamiento se logró la obtención de perfiles
de bandas claras, reproducibles, separadas, que
contienen fragmentos que van desde 18 a 20 aproximadamente
y de 6 a 165 Kb de tamaño.

22. RESULTADOS
La diversidad genética y clonalidad de MRSHo:
•Se presenta una alta diversidad genética, ya que de las 34 cepas de
S. hominis que se tomaron se clasificaron 28 tipos de PFGE (A-AA)
Se presentan 6 PFGE contenidas en 2 cepas cada uno, por ejemplo:
• Las cepas 5162a y 3030a compartían el PFGE tipo C.
• Las cepas 6074ae y 4488 compartían el PFGE tipo A.
•Además de esto se halló que los que MRSHo pertenecientes al
mismo tipo de PFGE fueron encontrados en un mismo hospital en un
periodo de 3 años. Ejemplo X1 y X2.

23. RESULTADOS
Patrones de susceptibilidad antibiótica
• La sensibilidad a los antibióticos a un panel de 22 antibióticos y la
MIC de oxacilina se determinó para los 34 mecA positivos
MRSHo.
• Un total de 28 de los 34 aislamientos (80%) expresó
fenotípica resistencia a la meticilina (1,5 mg / ml). Sin embargo, seis
de los aislados fueron sensibles a la oxacilina y Etest a pesar del
hecho de que llevaban mecA.

24. RESULTADOS
Distribución de SCCmec en S. hominis
Presencia de:
•SCCmec VI (4B) se encontraba en 6 cepas. Ej. 6074aé, 4488 y 2772.
•SCCmec VIII (4A) se encontraba en 5 cepas. Ej. 4842, 2916 y 2730.
•38% de las cepas contenían una variante única nueva entre el complejo
mec y complejo ccr. Ej. 5162a, 3140aé, etc.
•En el 27% de las cepas se encontró el complejo mec con dos diferentes
alotipos de ccr en la misma cepa. Ej. 3030a, 4793a, 1781, etc.

25. RESULTADOS
Distribución de SCCmec en S. hominis
•2 cepas con complejo mec tipo A pero sin gen de ccr. Ej. 5265b y 2060.
•2 cepas no se halló complejos ccr ni complejos mec a pesar de la presencia
de mecA.
•Las cepas que compartían los tipos PFGE A, O y R, comparten SCCmec
4B, 1A y 4A, respectivamente, pero también se encontró que cepas con
diferente PFGE también los compartían. Ej. SCCmec 1A en 12 cepas
diferentes, SCCmec 4A en 4 cepas diferentes, esto demuestra la presencia
de clon con gran capacidad de adaptación y diversidad.

26. RESULTADOS
Identificacion de genes ccrAB y ccrC en cepas mecA-negativo de
S. hominis
• La presencia de genes ccr entre los aislados MSSHo fue probado por
hibridación de Southern seguido por marcado ccr .
• Entre los mecA negative 11cepas analizadas, tres albergaba CCRC,
dos realizadas ccrAB1, dos ccrAB4, y un
aislamiento realizado ccrAB2.
• También se encontró una cepa que demostró que llevan los
genes ccr por hibridación de Southern, pero que no
fue marcada por ccr marcación por PCR.

27. RESULTADOS
Homología de nucleótidos entre ccrB de S. hominis y otras especies de
Staphylococcus
•Alto grado de homología entre las muestras de estudio y de base de datos:
• ccrB1 de S. hominis y los ccrB1 de otros de S. hominis.
• ccrB1 del S. hominis y el ccrB1 de S. epidermidi.
• ccrB4 del S. hominis y el ccrB4 de S. aureus
•13 de las cepas no tenían tipificación con marcador ccrB por la presencia
de superposiciones que podían significar la presencia de alelos de ccr en el
mismo alotipo.
•En 4 cepas se detectó por PCR el gen ccrAB1, pero la secuenciación con la
ccrB indicaba la presencia de ccrAB4 sugiriendo la presencia de los dos
alotipos ccrB1 y ccrB4.

28. RESULTADOS
Homología de nucleótidos entre ccrB de S. hominis y otras especies de
Staphylococcus
•Un total de cuatro diferentes ccrB1 y 10 alelos diferentes ccrB4 se
encontraron en las 34 cepas, por lo que podría ser un alotipo ccrAB
determinado.
•Los alelos de ccrB4 se agruparon en tres ramas: el ccrB4 de la SCCpbp4
de S. epidermidis, SCCmec, S. aureus, S. aureus.
•El análisis filogenético demostró que ccrAB1 y ccrAB4 de S. hominis y que
se encuentran en SCCmec S. aureus son muy similares y debe haber tenido
un origen común.

29. FIGURA N° 1

30. FIGURA N° 2

31. DISCUSSION
AUTHOR WHAT THE SAYS YES OR
NOT
Another interesting feature of S.
Hanssen hominis molecular epidemiology was
AM. the finding of a high frequency of Yes
SCCmec types containing ccrAB4,
Kjeldsen G.
ccrAB1 and mec complex A in its
Sollid JU. composition, like VI (4B), SCCmec
VIII (4A) and a new SCCmec type
with mec complex class A associated
to ccrAB1 (1A), and the complete
absence of SCCmec structures
containing ccrAB2, ccrAB3, ccrC and
mec complex C. Previous studies
where SCCmec was characterized for
only a few S. hominis isolates also
showed that S. hominis
predominantly carried, ccrAB1,
ccrAB4 and mec complex A [18,46].

32. DISCUSSION
AUTHOR WHAT THE SAYS YES OR NOT
Hanssen AM. The prevalence of specific mec complex Yes
Sollid JU. classes and ccr allotypes observed in this
Miragaia M. study was previously detected in other
Couto I. CoNS species like mec complex C in S.
De Lencastre H. haemolyticus and mec complex B and
ccrAB2 in S. epidermidis [46,47].
This fact may turn this staphylococcal
Kloos WE. species into a particularly privileged Yes
reservoir and donor for other pecies
sharing the same ecological niche, like S.
pidermidis, S. haemolyticus and S. aureus
[45].

33. DISCUSSION
AUTHOR WHAT HE SAYS YES OR
NOT
Katayama Y. However, the involvement of S. hominis in
Takeuchi F. the assembly of SCCmec I was previously Yes
Ito T. suggested due to the finding of a SCC
Ma XX. non-mec element in MSSHo with high
Ui-Mizutani Y.
homology with the SCCmec I from S.
et al.
aureus [12].

34. CONCLUSIONS
• The deep research of existing strains could lead to the elaboration of
even more potent antimicrobial agents to help eliminate possible
causes of sepsis in hospitals and create new dosage parameters to
prevent the emergence of new resistant strains.
• Due to the repeated presence of the same strain over time (3 years) in
the same place, should be more comprehensive tracking about why
this happens, despite the cleanup code that must be managed in
hospitals and implements that are used in it.

35. CONCLUSIONS
• The characteristics shown different species
of staphylococcus to conduct investigations like this, succeed in
identifying important parameters for the realization of accurate
diagnosis and consistent with the efficacy of antimicrobial treatment.
• Techniques and laboratory methods used in this research unveiled the
features and important aspects
of the S.hominis estrucctura perimiter so know the mechanism of
action of antimicrobials used in the treatment of these pathogens.

36. MAPA CONCEPTUAL Stanislav Cardona Cardona
Stanislav Cardona Cardona

37. MAPA CONCEPTUAL Cielo Cristina Castro Correa

38. GRACIAS