1. III SESSIONE
LA GARA DELLA
RICERCA
II TAPPA: DA VON PIQUET AGLI IGRA,
LA DIAGNOSI DI INFEZIONE
M. BUGIANI

2. PATOGENESI

3. Different outcomes of infection with M tuberculosis, different T cell populations involved in
protection, and major anti-mycobacterial effector mechanisms of macrophages.
Kaufmann S H E Ann Rheum Dis 2002;61:ii54-ii58
©2002 by BMJ Publishing Group Ltd and European League Against Rheumatism

4. STORIA NATURALE DELLA TB

5. • Prevalence of infectious cases
• Duration of illness
• Intensity, frequency and duration of
contact Largely
endogenous
Largely exogenous Innate resistance
Form and site of TB
• Particles/volume x exposure time Performance of cell-
Age
• Production of infectious droplets mediated immunity
Patient’s susceptibility
• Clearance of air
Delay in diagnosis
• Extent of exposure Re-infection
Strain virulence
RF
RF
RF RF Infectious
Tuberculosis
Subclinical
Exposure Infection Death
Non-infectious
Tuberculosis
Modello epidemiologico
TB

6. PRIMA DI VON PIRQUET
Jenner
Pasteur
Koch 1890
• Cavie venute a contatto con MT viventi o morti acquisivano
resistenza a nuova infezione (fenomeno di Koch)
• Uso di filtrato sterile di coltura di MT (vecchia tubercolina -OT)
• Immunità ritardata
• USO A SCOPO TERAPEUTICO
Eber, Pearson1890 : uso di OT nel bestiame
• identifica infezione TB non clinicamente evidente

7. HISTORY
Robert Koch 1890: TB remedy
Clemen von Pirquet 1890s: TB
immunity
Seibert 1930s: PPD

9. LA TUBERCOLINA
Tuberculin is an extract of tubercle
bacilli

10. USO DIAGNOSTICO
1907 Clemens von Pirquet
comparsa precoce del nodulo nel fenomeno di Koch
allergia batterica
( ipersensibilità ai componenti del MT)
prima prova diagnostica della tubercolosi
Clemens Freiherr von Pirquet, Klinische Studien über Vakzination und vakzinale Allergie.
Leipzig–Wien : F. Deuticke, 1907
^ "Kutane und konjunktivale Tuberkulinreaktionen". In: Handbuch d. Technik und Method. der
Immunitätsforschung, 1st supplementary volume, Jena 1911

11. REAZIONE DI VON PIRQUET
Reazione cutanea ritardata
caratterizzata dall'insorgenza di
un'area arrossata e in rilievo che
segue, a distanza di 24-48 ore,
l'applicazione di una goccia di
soluzione della vecchia tubercolina
sulla pelle lievemente scarificata

12. Delayed-type hypersensitivity
(DTH) (e.g., tuberculin skin test)
TH1 from a previous
immunization
(memory)

13. METODI DI SOMMINISTRAZIONE
Patch test
Test percutaneo
Test congiuntivale
Test sottocutaneo
1908 Mantoux : Intradermoreazione
• Dose certa
• Lettura quantitativa (mm)

14. MIGLIORARE IL TEST
………
Sostanza (Siebert (1934)
Tuberculin is an extract of tubercle bacilli
• Molta ricerca fino agli anni 50 dedicata agli effetti terapeutici
• PPD-s (purified protein derivative)
• Maggiore specificità
• Assenza di capacità sensibilizzante
DOSE
• Da 1 a 250 TU
CUT-OFF diagnostico
• 5, 10, 15 mm

15. DOSI
Cumulative Percentage of Children Reacting to Increasing Doses
of Tuberculin, Among Healthy Children and Tuberculosis Patients
5 TU PPD-S
100
Tuberculosis patients
Per cent reacting
80
60
Healthy children
40
20
0
10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0
Dose of tuberculin (mg)
Furcolow ML, et al. Public Health Rep 1941;56:1082-1100

16. DISTRIBUZIONE DELLE RISPOSTE
Distribution of Reaction Sizes to 5 TU Tuberculin PPD-S
in 5,544 Tuberculosis Patients, United States
20
Per cent reacting
15
10
5
0
0 5 10 15 20 25 30
Induration (mm)
Edwards LB, et al. Am Rev Respir Dis 1969;99(4, part 2 of 2):1-132

17. SPECIFICITA’
Tuberculin Skin Test Reaction Size Distribution
in Two Tuberculin Surveys, Korea 1965 and 1995
0.06 1965
Fraction reacting
0.04
0.02
0.00
0 5 10 15 20 25 30
0.06
1995
Fraction reacting
0.04
0.02
0.00
0 5 10 15 20 25 30
Induration (mm)
Korean Institute of Tuberculosis 1966:1-181
Korean National Tuberculosis Institute 1996:1-180

18. IL CUT-OFF
Frequency Distributions of Tuberculin Skin Test
Reaction Sizes in Surveys in Tanzania and Djibouti
0.10
Tanzania
0.08
0.06
Fraction reacting
0.04
0.02
0.00
0 5 10 15 20 25 30 35
0.10
0.08 Djibouti
0.06
0.04
0.02
0.00
0 5 10 15 20 25 30 35
Induration (mm)
Styblo K. TSRU Progress Report 1998;1:31-66
Data courtesy Djibouti: Trébucq A, IUATLD, 1995

19. VACCINAZIONE CON BCG
Distribution of Tuberculin Skin Test Reactions 2 1/2 Months to
4 to 5 Years After BCG Vaccination in Madras and in Puerto Rico
30 At 2 1/2 months
Chingleput
At 4
20 years
Per cent reacting
10
0
0 5 10 15 20 25 30
20
Induration (mm) to 5 years
At 4
Puerto Rico
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Induration (mm)
Tuberculosis Prevention Trial, Madras. Indian J Med Res 1980;72(suppl):1-74
Comstock GW, et al. Am J Public Health 1974;64:283-91

20. EFFETTO DEL TEMPO DI LETTURA
0 150
100%
90%
Spec
80% Sens
70%
24 48 72 96 120
Ore dall’inoculo
24 vs 48 ore (GS)
71% sensibilità; 81% specificità
Menzies chp. 12 in Reichman 2000

21. CORRELAZIONE TRA REAZIONE CUTANEA AL
PPD E RISCHIO DI SVILUPPARE TB ATTIVA
20
N. casi di TB nel follow-up
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
5 10 15 20 25
Reazione PPD (mm)

22. Rischio di tubercolosi dopo l’infezione
Horsburgh CR, NEJM 2004;350:2060-7

23. USO LONGITUDINALE
Variazioni somministrazione, lettura, casuali
• 2/3 mm (5 mm =1.96 sd)
Boosting (Richiamo di immunità in assenza di nuova infezione)
• Rischio TB < 0,05%
• Fino a 2 anni dal I test
• 1-10% (dipende da NTM e BCG)
• 90% < 10 mm
Conversione (nuova infezione)
• Rischio TB > 5% anno
• Incremento di 10 mm (5 mm in CT) se il
precedente <10 mm

24. FOLLOW.UP
Una volta positivo =sempre positivo ?
Una volta documentato positivo
non è più utile

25. LIMITI DEL TST (MANTOUX TEST)
Somministrazione e LETTURA
• Personale addestrato
• Ritorno del testato
• Non ritorni >30%. Chaisson et al 1996, Serwint et al 1997, Malotte et al 1999, Tanke et al 1994
Soggettività e variabilità
• Interpretazione stratificata per livello di rischio (5,10, 15 mm).
• NTM e BCG. Huebner et al 1993, Lalvani et al 2001, Delgado et al 2002
• Cross reactività con BCG
• >10% falsi + per BCG; 10% NTM +, di cui 30% con TST +. Margileth 1994,
Huebner et al 1993, Von Reyn et al 2001
• Variazione PPD tra produttori e batch
• Villarino et al 2000, Chaparas et al 1985
Riproducibilità scarsa
• Kendig et al 1998
Boosting–
• Test ripetuti danno falsi positivi (Conversioni)(BCG)
Poco sensibile in TB attiva
• 20 to 40% of active TB patients are TST negative.Pathan et al 2000, Fietta et al 1985, ATS/CDC
Diagnostic guidelines
Anergia & HIV
• > 50% di coinfettati TB/HIV sono TST -

26. MODERNE MISURE DIAGNOSTICHE
PER TB: IFN- Γ IN VITRO
Purified lymphocyte techniques
• PBMC culture
• Flow cytometry
• Elispot
Whole blood culture
• QuantiFERON
• Diluted whole blood

27. IN VIVO AND IN VITRO
DIAGNOSTIC TESTS
IFN-γ"
Presentation of"
mycobacterial antigens" TNF-α" IL-8, etc."
IFN-γ"
Antigen" Memory"
TNF-α" IL-8, etc."
presenting" T-cell"
cell"
Andersen P, et al. Lancet 2000;356:1099"

28. IGRA
ELISPOT
• T-Spot
WHOLE BLOOD CULTURE
• PPD
• QuantiFERON)
• Quantiferon
• Quantiferon-Gold
• Quantiferon –Golf in Tube

29. SPECIE SPECIFICITÀ
DI ESAT-6 E CFP-10 (TB7.7 IN TUBE)
TB Complex Antigens Environmental Antigens
strains ESAT CFP
ESAT CFP
M abcessus - -
M avium - -
M tuberculosis + +
M branderi - -
M africanum + + M celatum - -
M bovis + + M chelonae - -
BCG substrain M fortuitum - -
M gordonii - -
gothenburg - -
M intracellulare - -
moreau - - M kansasii + +
tice - - M malmoense - -
tokyo - - M marinum + +
M oenavense - -
danish - -
M scrofulaceum - -
glaxo - - M smegmatis - -
montreal - - M szulgai + +
pasteur - - M terrae - -
M vaccae - -
M xenopi - -

30. EFFETTO DELLA VICINANZA
Effetto della vicinanza
30
25
20
15
OR
10
5
0
4 3 2 1 4 3 2 1
ESAT6 PPD
-5
Test/Distanza
Ewer K, et al. . Lancet 2003; 361: 1168-73

31. VALORE PREDITTIVO VERSO
SVILUPPO DI TBA
• Doherty et al (JCM 2002)
• 2-year follow up of 24 household contacts in Ethiopia
RR TBA with 95% CI vs Test +
6
5
4
3
2
1
0
ESAT6 PPD

32. Mantoux vs test IFN-γ
Clinical Organismo T-cell Mantoux IFN- γ
presente
TB guarita No M Pos Neg ?
TB attiva Si E Pos Pos
LTBI Si E Pos Pos
BCG Vac No M Pos/Neg Neg
Esposizione a ? NTM M +/ -E Pos (?) Neg
NTM

33. VANTAGGI OPERATIVI DI TEST IFΓ
Specificità è Riduce Da studiare l’impatto
trattamenti inutili
Non necessita di una visita Resta la necessità di
di ritorno per la lettura del comunicare i risultati
test
Personale ? (counceling)
Minore variabilità Da studiare
nell’esecuzione e nella
lettura dei risultati
Standardizzazione per In sviluppo
quanto riguarda i reagenti
Nessun rischio di possibili Vero
effetti collaterali sistemici
Non è affetto da effetti di Vero
potenziamento (booster).

34. SVANTAGGI OPERATIVI IGRA
Il campione di sangue deve essere processato in
temi rapidi
Costi elevati
• QF tube 30 € per test
Elevata massa critica di test per una ragionevole
economia di scala, con possibile ritardo nell’esame
e nei provvedimenti conseguenti
Necessita di un laboratorio con attrezzatura
minima
Rischio per prelievi ematici in popolazioni con
elevato rischio di infezione HIV e da HBsB e C
• Rifiuto del prelievo da parte di gruppi di soggetti a rischio

35. % REVERSIONI PER CUT-OFF
25% 24%
20%
15%
10% QFTB
10%
8% TST
5% 5%
3%
0% 2%
5 mm/.35
10 mm/.7
15 mm/1

36. TEST SERIALI
UNA VOLTA POSITIVO
SEMPRE POSITIVO ?
NON E’ UTILE RIPETERE

37. KEY QUESTIONS
What are appropriate cut-off points for different
groups?
What is the normal variation in T-cell responses?
What is the risk of active disease in those with
positive and negative IGRA results? How does this
relate to risk associated with positive TST?
Is there a cut-off point that will predict incipient
active TB?
How should conversions and reversions be defined
(incrementally), and how often do they occur?
Pai, M et al, Lancet Infect Dis 2007; 7: 428-38
CDC 2010

38. PROBLEMI APERTI
Infezione TB o TB latente
• persistenza di micobatteri della tubercolosi nell’organismo
in assenza di evidenza clinica, batteriologica e radiologica di
malattia tubercolare
L’assenza di GOLD standard non permette di valutare sensibilità
e specificità verso la
VERA CONDIZIONE DA CERCARE E TRATTARE
Specificità e VP+ dei test verosimilmente molto più bassa di
quanto stimato
IL TEST TUBERCOLINICO (E GLI IGRA) E’ UN TEST
NON UNA CONDIZIONE

39. PROBLEMI APERTI
Che cosa cerchiamo ?
Infezione TB o TB latente
• persistenza di micobatteri della tubercolosi nell’organismo in
assenza di evidenza clinica, batteriologica e radiologica di
malattia tubercolare
Che cosa misuriamo ?
• persistente risposta delle cellule T specifiche per i micobatteri
in assenza di evidenza clinica di malattia tubercolare

40. All Theories of
memory cell
development would
suggest that memory
T cell formation is a
function of
withdrawal of antigen
(Kaech et al 2002)
?????????????

41. CAMBIAMENTI CON IL
TRATTAMENTO
Ø Modello 1:
• Il trattamento eradica l’antigene
è Riduzione IFγ
Ø Modello 2
§ Il trattamento stimola l’immunità
è Aumento IFγ
Ø Modello 3: Nessun effetto
• LA RISPOSTA AI TEST DOPO L’ERADICAZIONE
DELL’ANTIGENE SCOMPARE
• IN TEMPI NON NOTI (anni)
• IN UNA PROPORZIONE NON DETERMINATA DI SOGGETTI

42. LATENT TUBERCULOSIS INFECTION
OR LASTING IMMUNE RESPONSES
TO M. TUBERCULOSIS?
• Latency, as assayed by TST and IGRA, is a:
• state of persistent mycobacteria-specific T-cell
responses in the absence of clinical evidence for
tuberculosis disease (A).
• Whether latent tuberculosis infection depends on the
presence of living mycobacteria is presently unclear
( A).
• The tuberculin skin test and IGRAs measures:
• “lasting tuberculosis immune responses”
• not “latent tuberculosis infection” (A).
• can not discriminate active from latent infection (A).
Mack, U., et al. (2009). TBNET consensus statement." Eur Respir J 33(5): 956-973

43. NUOVI TEST
DIRETTI
Identificazione dei micobatteri quiescenti
(GOLD STANDARD)
INDIRETTI
Isolamento di AG (o relazioni tra risposte ai
diversi AG) specifici per la latenza

44. GRAZIE PER L’ATTENZIONE
M.Bugiani
44