Programma "TB e AIDS: due storie parallele", 21-22 Marzo 2014 Milano
PPT Cirillo "La diagnosi di tubercolosi"
1. LA
DIAGNOSI
DI
TUBERCOLOSI
D
M
Cirillo
Is+tuto
Scien+fico
San
Raffaele
WHOcc
Milan
Italy
2. Outline
• Problema+che
legate
alla
diagnosi
di
TB
in
HIV
• Diagnos+ca
tradizionale:
• POC
• Raccomandazioni
dell’OMS
• Diagnos+ca
molecolare
e
analisi
delle
resistenze
3. Problema<che
legate
alla
diagnosi
di
TB
in
HIV
• Localizzazione
• Paucibacillarità
• Cri+cità
del
paziente
• Progressione
della
malaIa
4. Rapid test
Inexpensive
n Specificità per Mycobacterium spp:
>95%
n Sensibilità: 25-65% (90 % infettivi)
1st AFB smear 80-82 %
2nd AFB smear 10-14 %
3rd AFB smear 5-8 %
Fluorescence Ziehl-Neelsen staining
n Does not allow species identification
n Not applicable to all samples
Microscopia
LED raccomandato rispetto a
microscopia tradizionale e
fluorescenza
5. Il
paziente
HIV
posi+vo
è
+picamente
paucibacillare,
con
TB
non
cavitaria,
spesso
extrapolmonare
=
microscopia
nega<va
Il
paziente
HIV
posi+vo
è
soggeOo
a
infezioni
da
micobaOeri
non
tubercolari
che
non
rispondono
alla
terapia
an+tubercolare=
microscopia
posi<va
che
puo’
essere
misinterpretata
come
fallimento
terapeu<co
Microscopia
in
HIV
posi<vo
7. LAM
e
Specificità:
problemi
non
risol<
• Sensibilità
della
coltura
liquida
come
“gold
standard”
• Uso
di
campioni
respiratori,
in
par+colare
escreato
• Follow
up
in
pazien+
con
microbiologia
nega+va
• NTMs
• Contaminazione
e
crossreaIvità
degli
an+corpi
con
NTMs
8. Vantaggi
• Diagnosi certa di TB
• Aumenta del 30-50% il
numero di casi confermati
• Se liquida relativamente
rapida
• Disponibilità del ceppo
per ATB e epidemiologia
LIMITI
• costi legati alla procedura e
alla struttura di contenimento
• Tempi di risposta legati alla
lentezza di crescita
• Contaminazione
RITENUTA; FORSE ERRONEAMENTE IL GOLD STANDARD
Coltura
9. Vantaggi
• Dati sulla sensibilità in
vitro
• Permette di adottare un
regime terapeutico
presonalizzato
• Permette di raccogliere
dati dati di solveglianza
che informano regimi
empirici standardizzati
• Permette di monitorare lo
sviluppo di resistenze
Limiti
• Costi legati alla procedura
e alla struttura di
contenimento
• Complessità di esecuzione
• Tempi di risposta
incompatibili con un
trattamento rapido
• Contaminazione
• Attendibilità relativa e
legata alla complessità di
esecuzione e alle
caratteristiche delle singole
molecole
An<biogramma
10. • “gold
standard”
diagnos+co
• Tempi
di
posi+vizzazione
lunghi
lega+
alla
carica
baOerica
• ATB
disponibile
dopo
seImane
• TAT
spesso
incompa+bile
con
il
management
correOo
del
paziente
cri+co
Coltura
e
ATB
in
HIV
posi<vo
11. WHO
Global
plan
(2006-‐2015):development
and
roll
out
of
new
technologies
to
be
adopted
in
resources-‐limited
seIngs
GenoType
MTBDRplus
• Reverse
hybridiza+on,
colorimetric
reac+on
• Results
in
6-‐7
h
•
some
flexibility
(n
probes/strip:
30-‐40)
•
Technical
exper+se:
some
• Biosafety
lev
2
Xpert
MTB/RIF
• Integrated/automated
qPCR
• Results
in
2h
• Closed
system
(limited
number
of
probes:
<10)
•
Technical
exper+se:
none
Test
molecolari
commerciali
approva<
dall’OMS
per
TB/MDR
TB
16. Boehme
CC
et
al
2011.
Lancet
377(9776):1495-‐505
RIF-‐R
detec<on
Time
to
report
to
treatment
center
Xpert
MTB/RIF:
0-‐1
d
LPA:
10-‐26
d*
Culture
DST:
30-‐124
d**
Xpert
MTB/RIF:
0-‐1
d
(Microscopy:
1-‐2
d)
LPA:
27-‐53
d*
Culture
DST:
38-‐102
d**
(culture:
42-‐62
d)
Some
results
not
reported/lost
*
test
on
AFB-‐pos
clinical
specimen
+
test
on
clinical
isolate
for
AFB-‐neg
cases
**
DST
performed
by
MGIT
+
DST
performed
on
LJ
TAT
to
Rif
–R
detec<on
and
repor<ng
17. WHO/HTM/TB/2011.2
VPP
e
VPN
per
la
resistenza
della
Rif
a
diverse
prevalenze
di
resistenza
della
Rif
18. Test
commerciali
per
Fluoroquinoloni
ed
InieXabili
• I
test
LPA
commerciali
per
la
diagnosi
della
resistenza
ai
farmaci
di
seconda
linea
mostrano
un
alto
valore
di
VPP
e
un
basso
valore
di
VPN
causato
dal
numero
limitato
di
mutazioni
incluse
nei
test
• VPP
e
VPN
potrebbero
variare
con
il
backgroud
geno+pico
dei
ceppi
e/o
con
la
prevalenza
di
uno
specifico
geno+po
nella
popolazione
target
• Alta
prevalenza
di
cloni
specifici
recan+
mutazioni
selezionate
non
comprese
negli
aOuali
test
diagnos+ci
possono
modificare
i
valori
di
VPP
e
VPN
MioOo
et
al.
ERJ
2012
19. Sanità
Pubblica
–
indagini
in
real
+me
di
outbreak
–
epidemiologia
molecolare
• Whole genome sequencing (WGS) e analisi delle resistenze
900+
mutazioni
in
~50
geni
associa+
a
farmacoresistenza
in
Mycobacterium
tuberculosis
WGS + algoritmo interpretativo
Cole
et
al.,
Nature
393
(1998)
ImpaXo
clinico
della
genomica
20. High
confidence
calls
e.g.
>85%
INHR
SNPs
in
katG
or
inhA
95%
RifampicinR
rpoB
SNPs
in
RRDR
–
codons
507-‐533
quinolones
gyrA
SNPs
in
QRDR
(D94G
vs
A90V)
Predic<ve
calls
e.g.
KANR
rrs
A1401G
&
C517T
plus
eis
promoter
G-‐10A
or
C-‐14
CAPR
rrs
A1401G,
C1402T,
G1158T
+
possible
eis
C-‐12T
AMK
R
rrs
A1401G
+
eis
promoter
Problemi:
associazione
con
MIC
e
risposta
al
farmaco
SNPs
filogene+ci
/
polimorfismie/o
sinonimi
Non
tuXe
le
mutazioni
sono
uguali:
High
confidence
calls/predic<ve
calls
21. Table
1.
List
of
M.
tuberculosis
isolates
used
in
this
study.
Malik
S,
Willby
M,
Sikes
D,
Tsodikov
OV,
et
al.
(2012)
New
Insights
into
Fluoroquinolone
Resistance
in
Mycobacterium
tuberculosis:
Func+onal
Gene+c
Analysis
of
gyrA
and
gyrB
Muta+ons.
PLoS
ONE
7(6):
e39754.
doi:10.1371/journal.pone.0039754
hOp://www.plosone.org/ar+cle/info:doi/10.1371/journal.pone.0039754
22. • gyrA:
– 7582AG
=
D94G
(mutazione
high
confidence)
– >8ug/ml
ciprofloxacin/ofloxacin/levofloxacin
– >2ug/ml
moxifloxacin
• Altre
tre
mutazioni
non
sinonime
in
gyrA
che
potrebbero
alterare
la
funzione.
• Studio
sorveglianza
WHO:
o 97
campioni
sequenzia+
o Concordanza
MGIT-‐seq
(84/97
campioni):
86,6%
(46
R-‐mut,
38
S-‐
wt)
o Discordanza
MGIT-‐seq
(13/97):
13,4%
(13
R-‐wt)
FluoroquinoloneR
-‐
Conclusioni
23. Alto
numero
di
mutazioni
in
pncA
disperse
nell’intero
gene
Necessità
di
sviluppo
di
un
test
rapido
Marker
di
resistenza
(80-‐85%)
Poliformismi
silen<
(1-‐2%)
Non
associa<
a
resistenza
(4-‐5%)
Associazione
da
chiarire
(4-‐5%)
Falsi
resisten<
(2-‐3%)
• Studio
sorveglianza
WHO:
o 874
campioni
sequenzia+
o Concordanza
MGIT-‐seq
(60/62):
96,8%
(22
R-‐mut,
38
S-‐wt)
o Discordanza
MGIT-‐seq
(2/62):
3,2%
(1
S-‐mut,
1
R-‐wt)
Solo
marker:
prom
-‐11,
cod
10-‐49-‐51-‐57-‐68-‐94
Pirazinamide
24. • E’
legata
alla
determinazione
della
presenza
di
MTB
o
sue
componen+
nel
campione,
per
questo
mo+vo
la
sensibilità
rimane
suboImale
nei
campioni
pauci
bacillari
• Futuro
approccio
all’ATB:
NGS
permeOerà
un’analisi
completa
delle
mutazioni
interpretabili
sulla
base
di
regole
chiare
e
associabili
ad
un
outcome
clinico.
La
tecnologia
permeOerà
di
sviluppare
piaOaforme
user-‐friendly
aOe
all’iden+ficazione
degli
SNPs
rilevan+
• Biomarcatori
•
Take
home
message:
Diagnosi
di
microbiologica
di
TB
25. Riccardo
Alagna
Emanuele
Borroni
Andrea
M.
Cabibbe
Lucinda
Furci
Paola
Mantegani
Paolo
MioXo
Enrico
Tortoli
Elisa
Tagliani
Ilaria
Valente
Grazie per l’attenzione
