Biochem_Symplice Kamgang

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Biochem_Symplice Kamgang

  1. 1. UNIVERSITE DE DOUALA FACULTE DES SCIENCES THE UNIVERSITY OF DOUALA FACULTY OF SCIENCE Matricule 97FS1461Y DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY MEMOIRE PRESENTE ET SOUTENU EN VUE DE L’OBTENTION DE LA MAITRISE EN BIOCHIMIE Par KAMGANG MBE SYMPLICE Licencié ès Sciences Option : Biochimie Directeurs : Dr. NGONO NGANE Annie Chargée de Cours Superviseur : Dr. FOTSO KUATE Honoré Pr. AMVAM ZOLLO Paul Henri Médecin Biologiste Hôpital Laquintinie de Douala Année académique 2003/2004 CCCOOONNNTTTRRRIIIBBBUUUTTTIIIOOONNN AAA LLL’’’ EEETTTUUUDDDEEE DDDEEESSS PPPLLLAAANNNTTTEEESSS MMMEEEDDDIIICCCIIINNNAAALLLEEESSS DDDUUU CCCAAAMMMEEERRROOOUUUNNN ::: EEEVVVAAALLLUUUAAATTTIIIOOONNN DDDEEESSS PPPRRROOOPPPRRRIIIEEETTTEEESSS AAANNNTTTIIIBBBAAACCCTTTEEERRRIIIEEENNNNNNEEESSS DDDEEE DDDEEEUUUXXX EEEXXXTTTRRRAAAIIITTTSSS DDDEEE GGGRRRAAAIIINNNEEESSS DDDEEE PPPIIIPPPEEERRR GGGUUUIIINNNEEEEEENNNSSSEEE SSSCCCHHHUUUMMM... &&& TTTHHHOOONNNNNN...
  2. 2. Sommaire Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE i SOMMAIRE SOMMAIRE ................................................................................................................................ i DEDICACE ................................................................................................................................iii REMERCIEMENTS ...................................................................................................................iv LISTE DES ABREVIATIONS.....................................................................................................vi LISTE DES TABLEAUX............................................................................................................vii LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. viii RESUME ...................................................................................................................................ix ABSTRACT................................................................................................................................ x INTRODUCTION GÉNÉRALE................................................................................................... 1 Chapitre I : Données bibliographiques....................................................................................... 2 I. Généralités sur les bactéries et les substances antibactériennes ...................................... 2 I.1. Les bactéries ............................................................................................................................... 2 I.1.1. Définition............................................................................................................................ 2 I.1.2. Organisation générale ......................................................................................................... 2 I.1.3. Classification générale........................................................................................................ 3 I.1.4. Croissance et reproduction.................................................................................................. 4 I.1.5. Milieux bactériens et leurs utilisations ............................................................................... 5 I.1.6. Intérêt de l’étude des bactéries............................................................................................ 5 I.1.7. Bactéries entéropathogènes................................................................................................. 6 I.2. Les substances antibactériennes.................................................................................................. 6 I.2.1. Définition............................................................................................................................ 6 I.2.2. Les principales substances antibactériennes....................................................................... 6 I.2.2.1. Les stérilisants.......................................................................................................... 6 I.2.2.2. Les antiseptiques ..................................................................................................... 7 I.2.2.3. Les désinfectants ..................................................................................................... 7 I.2.3. Quelques agents antibiotiques utilisés contre les bactéries entéropathogènes.................... 7 II. Généralités sur les principales méthodes d’évaluation de l’activité antibactérienne........... 8 II.1. Méthode de diffusion en milieu solide ....................................................................................... 8 II.1.1. Méthode des disques de papier ........................................................................................... 8 II.1.2. Méthode par incorporation à la gélose) .............................................................................. 8 II.1.3. Méthode des puits ............................................................................................................... 9 II.1.4. Méthode de microatmosphère............................................................................................. 9 II.2. Méthode de dilution en milieu liquide........................................................................................ 9 II.3. Bioautographie.......................................................................................................................... 10 II.4. Détermination des CMI et CMB : Bactériostase et Bactéricidie.............................................. 10 III. Généralités sur Piper guineense................................................................................... 11 III.1. Botanique et écologie de la plante. ....................................................................................... 11 III.2. Ethnobotanique et pharmacologie ........................................................................................ 11 III.3. Autres utilisations ................................................................................................................. 11 III.4. Travaux antérieurs ................................................................................................................ 12 Chapitre II : Matériel et méthodes............................................................................................ 13 I. Matériel............................................................................................................................. 13 I.1 Matériel végétal. ....................................................................................................................... 13 I.1.1. Extraits hexanique et hydroéthanolique............................................................................ 13 I.1.2. Préparation des extraits à tester ........................................................................................ 13 I.1.2.1. Diffusion en milieu solide ...................................................................................... 13 I.1.2.2. Dilution en milieu solide ........................................................................................ 13 I.2. Matériel biologique : les bactéries............................................................................................ 16 I.3. Milieux bactériens utilisés. ....................................................................................................... 16 I.3.1. Gélose de Mueller Hinton II (gMH)................................................................................. 16 I.3.2. Salmonella Shigella (SS AGAR)...................................................................................... 16
  3. 3. Sommaire Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE ii I.3.3. Eosin Bleu de Méthylène (EMB)...................................................................................... 16 II. Méthodes.......................................................................................................................... 16 II.1. La technique de l’extraction ..................................................................................................... 16 II.2. Essais antibactériens. ................................................................................................................ 17 II.2.1. Diffusion en milieu solide................................................................................................. 17 II.2.2. Dilution en milieu liquide................................................................................................. 17 II.2.3. Mise en évidence de la bactéricidie .................................................................................. 18 Chapitre III : Résultats et discussion........................................................................................ 19 I. Résultats........................................................................................................................... 19 I.1. Rendements des extractions...................................................................................................... 19 I.2. Méthode de diffusion en milieu gélosé..................................................................................... 19 I.2.1. Cas de l’extrait hexanique................................................................................................. 19 I.2.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique..................................................................................... 20 I.3. Méthode de dilution en milieu solide ....................................................................................... 20 I.3.1. Cas de l’extrait hexanique................................................................................................. 20 I.3.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique..................................................................................... 21 I.4. Tests de bactéricidie.................................................................................................................. 23 I.4.1. Cas de l’extrait hexanique................................................................................................. 23 I.4.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique..................................................................................... 23 II. Discussion ........................................................................................................................ 25 CONCLUSION ET PERSPECTIVES....................................................................................... 27 BIBLIOGRAPHIE..................................................................................................................... 28 ANNEXES................................................................................................................................... I ANNEXE 1: PROTOCOLE DE PREPARATION DES MILIEUX gMH, SS ET EMB....................I ANNEXE 2 : COMPTAGE DE BACTERIE.....................................................................................II
  4. 4. Dédicace Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE iii DEDICACE EN TEMOIGNAGE DE MA RECONNAISSANCE POUR TOUT L’ENCADREMENT QU’ELLE M’A DONNE SUR LE CHEMIN DE L’OBTENTION DE MA MAITRISE. PUISSE L’ETERNEL NOTRE DIEU VOUS COMBLER DE SON ASSISTANCE ET VOUS SOUTENIR DANS TOUTES VOS ENTREPRISES POUR LA SEULE GLOIRE DE SON SAINT NOM.
  5. 5. Remerciements Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE iv REMERCIEMENTS Au moment où j’engage la rédaction de ce document, je tiens tout particulièrement à remercier : L’Eternel des armées qui m’a donné de surpasser toutes les difficultés rencontrées et de pouvoir enfin présenter ce travail. Que la gloire lui revienne. Le Professeur AMVAM ZOLLO Paul Henri, ancien doyen de la Faculté des Sciences de l’Université de Douala et Recteur de l’Université de Ngaoundéré, qui a accepté de superviser ce travail et de veiller sur son bon déroulement. Le Docteur NGONO NGANE Annie qui a bien voulu diriger ce travail et se dépenser pour le voir réussir. Que le Roi de gloire veille sur ses entreprises pour les bénir et les fructifier. Le Docteur FOTSO KUATE Honoré du laboratoire central de l’hôpital Laquintinie de Douala qui a veillé sur le bon déroulement des travaux effectués au département de bactériologie du laboratoire central dont il est responsable. Je prie que l’Eternel comble tout le personnel de ce laboratoire qui a été d’une grande aide pour moi pendant les manipulations. Tous les membres du laboratoire de phytobiochimie de l’Université de Yaoundé I pour leur disponibilité et leur encadrement lors des travaux d’extraction. L’ensemble des enseignants du département de Biochimie de l’Université de Douala pour les conseils, remarques et orientations que j’ai reçu d’eux tout au long de ce travail. Je pense ici tout particulièrement au Dr. GOUADO, au Dr KANA SOUOP et à Mme EBELLE qui ont toujours été disponibles pour me venir en aide pendant mes travaux. Mes parents (Moumbé Jean Justin et Christine) ainsi que mes oncles et leurs épouses (Fotsing Thomas et Angèle ; Talla André et Christine) pour leur constance dans l’effort déployé afin de voir se réaliser chacun de mes projets. Mr et Mme Gouambé à Libreville au Gabon ; Mlles Aïssatou Seh Bouba, Aminatou Bouba, Joumukam Martine, Joukouo Moumbé Bénédicte ; Mrs Ngué Jean-Paul, Oumbé Valère Aimé et Douba Njoh Adolphe pour le soutien qu’ils ont manifesté à mon égard lors de ce travail. Les bien-aimés Tsokozo Jean-Claude, Sonwa Emmanuel, Batchami Eric, Kemami Hilaire, Dinang Jean-Claude, Téné Jonathan, Kemdom Nadège, Nkwégnia Nadine, Ngoula Basile, Nango Edouard, et Kamdem Francis pour leur assistance dans le cadre de la réalisation de ce travail. L’ensemble du corps de Christ et plus particulièrement les bien-aimés de l’assemblée du Full Gospel Mission de Bépanda-Peuple et du Groupe Biblique des Elèves et Etudiants du
  6. 6. Remerciements Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE v Cameroun (GBEEC) pour son soutien spirituel et matériel dans l’effort de réalisation de ce document. Ngounou Djamchebi Alain Simplice, Eoné Hermann, Njeundji Suzy Christelle, Gouabé Patrick, Magne Nadège, Dassie Rosette et Bouyap Joëlle pour leur amitié ayant constituée un véritable stimulant tout au long ce travail. Mme Talla Florence à Douala, Mme Tutchamo Berthe à Bafoussam ainsi que mes petits frères et petites sœurs, cousins et cousines qui par leur chaleur familiale ont contribué à créer un cadre favorable au développement de l’esprit d’entreprise ayant influencé positivement ce travail. Les bien-aimés Kamga Justin, Djomo Nelly, Noualeu Viviane, Magni Julienne, Maba Patipé Sandrine, et Epoh Billa André Luther pour tous leurs bons soins et conseils. Tous mes camarades de promotion. Que la gloire revienne au Dieu tout puisant qui s’est servi de tout ce peuple et beaucoup d’autres encore pour réaliser ce travail d’initiation à la recherche.
  7. 7. Liste des abréviations Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE vi LISTE DES ABREVIATIONS CMB : Concentration Minimale Bactéricide. CMI : Concentration Minimale Inhibitrice. DMSO : Dimethyl Sulfoxyde. E. coli : Escherichia coli. EDS : Eau Distillée Stérile. EH : Extrait Hexanique. EHE : Extrait Hydréthanolique. EMB : Eosine Bleu de Méthylène. gMH : gélose de MUELLER HINTON. MH : MUELLER HINTON. P. guineense : Piper guineense. SS : Salmonella Shigella. UFC : Unité Formant Colonie.
  8. 8. Liste des tableaux Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE vii LISTE DES TABLEAUX Titres Pages Tableau 1 : Groupes et genres bactériens d’importance médicale ....................................................................3 Tableau 2 : gamme de concentrations de l’extrait hexanique...........................................................................15 Tableau 3 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur E. coli) ..............................15 Tableau 4 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur Klebsiella sp et Salmonella sp).........................................................................................................................................................15 Tableau 5 : tests de bactéricidie...........................................................................................................................18 Tableau 6: rendements des extractions...............................................................................................................19 Tableau 7: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hexanique ...........................................19 Tableau 8: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hydroéthanolique...............................20 Tableau 9 : CMI de l’EH du test d’incorporation à la gélose..............................................................................21 Tableau 10 : CMI de l’EHE du test d’incorporation à la gélose. ........................................................................21
  9. 9. Liste des figures Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE viii LISTE DES FIGURES Titres Pages Figure 1 : Coupe schématique d’une cellule bactérienne « composite »...........................................................2 Figure 2 : Protocole d’obtention des extraits hexanique et hydroéthanolique ...............................................14 Figure 3 : Disposition des disques dans les boîtes de Pétri. ............................................................................17 Figure 4: Activité de l’EH sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C).............................................20 Figure 5 : Activité de l’EHE sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C) .........................................20 Figure 6 : Test sur E. coli par l’EH........................................................................................................................21 Figure 7 : Test sur Klebsiella sp par l’EH ............................................................................................................22 Figure 8 : Test sur Salmonella sp par l’EH ..........................................................................................................22 Figure 9 : Test sur E. coli par l’EHE......................................................................................................................22 Figure 10 : Test sur Klebsiella sp par l’EHE........................................................................................................23 Figure 11 : Test sur Salmonella sp par l’EHE......................................................................................................23 Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH .........................................................................................................24 Figure 13 : Tests de bactéricidie pour l’EHE.......................................................................................................24
  10. 10. Résumé Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE ix RESUME Après les travaux d’extraction à l’hexane et à l’éthanol à partir d’une poudre de graines sèches de P. guineense, nous avons au travers des méthodes de la diffusion en milieu solide et de l’incorporation à la gélose évalué les activités antibactériennes des deux extraits obtenus. Les rendements d’extraction sont de 6,673% pour l’extrait hexanique (couleur rouge) et 8,551% pour l’extrait hydroéthanolique (couleur noire). La technique de diffusion en milieu solide a permis de mettre en évidence les activités antibactériennes des deux extraits sur E. coli, Klebsiella sp et Salmonella sp. Par la technique de l’incorporation à la gélose, nous avons trouvé que des trois souches bactériennes testées, seul Klebsiella sp est sensible aux deux extraits utilisés. L’extrait hydroéthanolique (EHE) présente une CMI à 960 mg/ml pour Klebsiella sp tandis que l’extrait hexanique (EH) est actif sur la même souche avec 400 mg/ml comme CMB. E. coli et Salmonella sp ne sont pas sensibles à l’EH même à 800 mg/ml. Néanmoins, l’EHE s’est montré bactéricide pour E. coli avec une CMB de 480 mg/ml. Le même fait est observé pour Salmonella sp en présence du même extrait avec une CMB de 960 mg/ml. Les graines de P. guineense peuvent donc servir de base pour la production industrielle de substances utilisables dans la lutte contre les infections et diarrhées infantiles causées par les entérobactéries.
  11. 11. Abstract Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE x ABSTRACT After extracting operations with hexane and ethanol from powder of the dried seeds of P. guineense, we used the methods of solid medium diffusion and agar incorporation to evaluate the antibacterial properties of the two extracts. The yields of extraction were 6.673% for the hexane extract (red color) and 8.551% for the hydroethanolic extract (black color). The solid medium diffusion technique permitted us to show out antibacterial activities of the two extracts on E. coli, Klebsiella sp and Salmonella sp. With the agar incorporation method, we found that out of the three bacteria species studied, only Klebsiella sp was sensitive to the two extracts tested. The hydroethanolic extract presented a MIC at 960 mg/ml towards Klebsiella sp while the hexanic extract is active on the same strain with 400 mg/ml as Minimal Bactericidal Concentration. E. coli and Salmonella sp are not sensitive, even at 800 mg/ml, to the hexanic extract. Nevertheless, the hydroethanolic extract shown himself bactericidal to E. coli with a Minimal Bactericidal Concentration of 480 mg/ml. The same fat was observed for Salmonella sp with the same extract with a Minimal Bactericidal Concentration of 960 mg/ml. Seeds of P. guineense can then be used for the industrial production of substances usable in fighting against infantile infections and diarrhea caused by enterobacteria.
  12. 12. Introduction générale Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE
  13. 13. Introduction générale Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 1 INTRODUCTION GÉNÉRALE La santé est un bien précieux après lequel l’homme n’a jamais cessé de courir. Ceci s’explique par le fait que toutes ses activités ne peuvent être menées que s’il est bien portant. Cette conquête de la santé est encore plus marquée quand elle concerne les nourrissons et petits enfants car ceux-ci sont vulnérables à divers maux parmi lesquels les diarrhées et autres infections bactériennes engendrées par des entérobactéries. C’est ainsi qu’on retrouve E. coli, Salmonella sp, Shigella sp, Klebsiella sp et bien d’autres bactéries du tractus gastro- intestinal au centre des infections suivantes chez les enfants : choléra (maladie épidémique intestinale), les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes, la dysenterie bacillaire et les diarrhées (Dosso & al, 1998). Dans les pays en développement comme le Cameroun, ces maux constituent un réel problème de santé publique. Dans la majorité des hôpitaux et centres de santé de ces pays, les infections entérobactériennes constituent la principale cause de morbidité et même de mortalité infantile. Le personnel médical œuvrant dans ces hôpitaux et centres de santé ne cesse de multiplier les efforts dans le but de freiner les ravages de ces maladies. Notons tout de même que ces efforts déployés par ce personnel butent, d’une part sur un développement de la résistance bactérienne chez les patients, d’autre part sur l’efficacité réduite pour certains antibiotiques actuellement présents dans nos pharmacies. La flore camerounaise comporte certainement des essences pouvant aider efficacement dans la lutte contre ces maladies dues aux entérobactéries citées plus haut. Piper guineense, plante ayant présentée des résultats remarquables dans des études antérieures (Ivbijaro, 1990 ; Tchoumbougnang, 1996 ; Dongmo, 2002 ; Ngono & al., 2003 ; etc.) est l’espèce végétale sur laquelle nous avons porté notre choix dans le cadre de cette étude. Cette plante est déjà largement utilisée de diverses manières par les populations à l’échelle mondiale et pourrait en fonction des résultats de ce travail servir de base pour la production industrielle d’antibiotiques efficaces dans la lutte contre les infections bactériennes énoncées plus haut. Il sera donc question pour nous dans un premier temps d’évaluer la sensibilité des bactéries étudiées (E. coli, Klebsiella sp et Salmonella sp) aux deux extraits de P. guineense utilisés (Extrait Hexanique : EH et Extrait Hydroéthanolique : EHE) par le moyen de la technique de diffusion en milieu solide. Puis nous procèderons de façon générale à la détermination des CMI et CMB dans les cas où l’extrait concerné est actif. Nous utiliserons pour le faire la technique d’incorporation à la gélose ou dilution en milieu solide suivi des tests de bactéricidie quand nécessaire.
  14. 14. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE
  15. 15. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 2 Chapitre I : Données bibliographiques I. Généralités sur les bactéries et les substances antibactériennes I.1. Les bactéries (Singleton, 1994 ; Stewart & Beswick, 1977) I.1.1. Définition (Singleton, 1994) Dans la plupart des cas, la bactérie est un être unicellulaire autonome. Elle présente une organisation procaryote au niveau de sa cellule et est dans la catégorie des « micro- organismes ». Toutes les bactéries sont des micro-organismes mais tous les micro- organismes ne sont donc pas des bactéries. Toujours parmi les micro-organismes nous avons les algues, les champignons, les lichens, les protozoaires, les virus et les agents subviraux (Prions par exemple). I.1.2. Organisation générale (Singleton, 1994) Il n’existe pas de bactérie type. La figure 1 montre de façon très schématique, une bactérie « composite ». Il est important de noter que toutes les bactéries ne possèdent pas toutes les structures indiquées dans ce diagramme, et que, par contre, certaines bactéries présentent des structures qui n’y appartiennent pas. Figure 1 : Coupe schématique d’une cellule bactérienne « composite » Corps basal Crochet Filament Flagelle Membrane Cytoplasmique Paroi cellulaire Enveloppe cellulaire Cytoplasme Chromosome (nucléoïde) Ribosomes Granules De réserve
  16. 16. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 3 I.1.3. Classification générale (Stewart & Beswick, 1977) Tableau 1 : Groupes et genres bactériens d’importance médicale Groupes Genres Coccis Gram-positives Staphylococcus Streptococcus Pneumococcus Peptostreptococcus Coccis Gram-positives Neisseria Bâtonnets Gram-négatives aérobies Pseudomonas Bordetella Francisella Brucella Bâtonnets Gram-positives formant-endospores Bacillus Clostridium Bâtonnets Gram-positives non-formant-spores Lactobacillus Listeria Erysipelothrix Bacteries Gram-négatives anaérobies Bactérioïdes Fusobactérie Bactéries Gram-négatives anaérobies facultatifs Entérobactériaceae Escherichia Edwarsiella Citrobacter Salmonella Shigella Klebsiella Enterobacter Hafnia Proteus Yersinia Vibrionaceae Vibrio Non-classées Haemophilus Pasteurella Streptobacillus Calymmotobacterium Bactéries spiralées et incurvées bdellovibrio spirillum Spirochetes Treponema Borrelia Leptospira Mycoplasmes Mycoplasme Actinomycetes et organismes apparentés Cornyebactérie Actinomyces Nocardia Mycobactérie Rickettsies Rochlimaea Coxiella Chlamydia Bartonella Les bactéries sont facilement classifiables au travers de leur forme, leur taille ou leur structure, leurs activités chimiques, la nature des éléments nutritifs qui leur sont nécessaires,
  17. 17. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 4 la forme de l’énergie qu’elles utilisent, l’ensemble des conditions physiques dans lesquelles elles peuvent croître et leurs réactions à certains colorants. Elles sont également réparties en catégories hiérarchisées (familles – genres – espèces). Tout le monde s’accorde sur le fait que les bactéries doivent être classées autant que possible de la même manière que les plantes et les animaux. Mais deux difficultés majeures sont rencontrées dans cette entreprise : (a) le concept d’espèce est basé sur la sexualité, une espèce étant un groupe d’organismes qui régulièrement se croisent. Ce concept ne peut pas être appliqué directement à la taxinomie bactérienne puisque les bactéries sont normalement asexuelles et la notion d’équivalent sexuel est très restreinte pour constituer une base d’une classification compréhensive. (b) le second problème est de pouvoir classer les espèces et genres en grands groupes hiérarchiques de familles, tribus, ordres et classes. Ceci a été l’approche classique des premières éditions de Bergey (Manual of Determinative Bacteriology) qui a présenté le système de classification le plus largement adopté par les bactériologistes. Les groupes d’importance médicale, tel que décrits par Bergey, sont présentés dans le tableau 1. I.1.4. Croissance et reproduction (Singleton, 1994) La croissance d’une cellule bactérienne consiste en une augmentation coordonnée de la masse de ses parties constituantes. Habituellement, la croissance conduit à la division de la cellule en deux cellules semblables ou identiques. Ainsi chez les bactéries, croissance et reproduction sont étroitement liées, et le terme « croissance » est généralement employé pour désigner les deux processus. Pour leur croissance les bactéries ont essentiellement besoin d’une provision de nourriture, d’une source d’énergie, d’eau, d’une température appropriée, d’un pH approprié et d’une teneur appropriée en oxygène (parfois l’absence d’oxygène). Pendant que certaines bactéries satisfont tous leurs besoins nutritifs avec de simples sels inorganiques et des substances comme le dioxyde de carbone et l’ammoniaque, d’autres requièrent - à divers degrés - des composés organiques plus ou moins complexes, provenant d’autres organismes. De l’énergie sera nécessaire, pour les réactions chimiques essentielles qui se déroulent dans une cellule vivante, pour la mobilité flagellaire et pour l’absorption de diverses substances nutritives. Le pH optimal pour la croissance de la plupart des bactéries se situe aux environs de 7 et la majorité des espèces ne peuvent se développer dans des milieux très acides ou très alcalins.
  18. 18. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 5 I.1.5. Milieux bactériens et leurs utilisations (Singleton, 1994) Un milieu est une préparation solide ou liquide, spécifiquement fabriquée pour la croissance, le stockage ou le transport des bactéries. Quand il sert à la croissance, le milieu fournit généralement tous les éléments nutritifs nécessaires. Avant l’emploi, un milieu doit être stérile, c’est-à-dire qu’il ne doit pas contenir d’organismes vivants. La majorité des milieux solides ressemblent à de la gelée. Ils consistent en une solution d’éléments nutritifs « solidifiée » par de la gélose. Cet agent gélifiant est un polysaccharide complexe, extrait de certaines algues. D’habitude, le milieu solide est utilisé en boîte de Pétri en plastique dont la taille la plus courante est de 9 cm de diamètre. Le milieu à l’état liquide (fondu) est versé dans la boîte de Pétri et laissé au repos jusqu’à solidification. Pour désigner une boîte de Pétri garnie de milieu solide, on parlera en raccourci d’une « boîte ». On classe les milieux selon l’usage qu’on entend en faire : Les milieux d’enrichissement sont des milieux liquides qui contiennent des substances complexes stimulant le développement de certains microorganismes et inhibant ou tuant d’autres microorganismes. Les milieux sélectifs par leur composition chimique inhibent dans un échantillon le développement de microorganismes indésirables (l’inhibiteur contenu dans le milieu sélectif peut être un antibiotique, un sel, un colorant ou un composé chimique particulier). Les milieux différentiels permettent de distinguer des espèces de microorganismes appartenant à la même famille et présentant des caractéristiques communes. Ainsi, on fait très fréquemment appel à la gélose, à l’éosine et au bleu de méthylène (EMB) pour isoler les bactéries Gram négatif. Les milieux de propagation. La plupart des espèces microbiennes pathogènes requièrent un minimum de 18 à 24 heures pour croître sur les milieux de culture. C’est le temps nécessaire pour pouvoir observer une croissance suffisamment abondante et faire soit une première identification, soit un repiquage sur un milieu sélectif ou différentiel. I.1.6. Intérêt de l’étude des bactéries (Singleton, 1994) La lutte contre les maladies est l’une des raisons majeures de l’étude des bactéries. Les bactéries sont la cause de quelques maladies graves, ainsi que de multiples affections bénignes. Aussi importantes qu’elles puissent être, les bactéries pathogènes ne constituent qu’une petite partie de l’ensemble de la population bactérienne. La plupart des bactéries ne présentent que peu ou pas de danger et beaucoup s’avèrent indéniablement utiles à l’homme. Par exemple, certaines d’entre elles produisent les antibiotiques qui ont révolutionné la thérapeutique, tandis que d’autres fournissent les enzymes des poudres à lessiver
  19. 19. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 6 « biologiques », d’autres encore servent d’ « insecticides microbiens » et protègent les cultures de certains insectes nuisibles. Certaines espèces bactériennes sont employées pour la production alimentaire. Enfin, mais ce n’est pas le moindre de leurs mérites, les bactéries assurent des rôles essentiels dans les cycles géochimiques donc, en définitive, toute vie dépend. Il ressort clairement de ce bref résumé que mieux nous connaîtrons les bactéries, plus efficacement nous pourrons en limiter les potentialités nocives et en exploiter les activités utiles. I.1.7. Bactéries entéropathogènes (Singleton, 1994) Il s’agit de bactéries Gram-négatifs, non-sporulants, anaérobies facultatifs (habituellement 0,3-1 x 1-6 µm). Elles sont le plus souvent courtes, droites, immobiles ou mobiles par une ciliature péritriche et de culture aisée car croissent habituellement bien sur les milieux de base. Il s’agit d’une très vaste famille qui représente près des ¾ des isolements d’un laboratoire de bactériologie médicale. Ce sont pour la plupart des hôtes du tractus digestif mais certaines, telles les Serratia sont rencontrées d’une manière prépondérante dans le milieu extérieur. Elles sont responsables de deux grands types de manifestations pathologiques : pathologie spécifique telle la typhoïde avec Salmonella typhi ou d’une pathologie opportuniste avec pour certaines une notion d’hospitalisme infectieux marquée. Les genres incluent Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Yersinia et Shigella. I.2. Les substances antibactériennes (Singleton, 1994) I.2.1. Définition Il s’agit de substances aidant dans la lutte contre les bactéries. Chacune d’elles a son mode d’action et une utilisation spécifique. Selon les cas, ces substances peuvent faire l’objet d’une utilisation in vivo ou in vitro. I.2.2. Les principales substances antibactériennes I.2.2.1. Les stérilisants Tout procédé dont on est sûr qu’il tue tous les organismes vivants – y compris les endospores – constitue une stérilisation. Idéalement les méthodes de stérilisation devraient être efficaces, rapides, simples et bon marché et elles devraient pouvoir s’appliquer à une grande variété de matériels. La stérilisation s’effectue habituellement par des méthodes
  20. 20. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 7 physiques – le plus souvent par la chaleur. On peut recourir à une stérilisation par la chaleur (le feu, le four à air chaud et l’autoclave), par les radiations ionisantes, par filtration et par les agents chimiques tel que l’oxyde d’éthylène (C2H4O). I.2.2.2. Les antiseptiques L’antisepsie est la désinfection des tissus vivants. Elle peut être appliquée de façon prophylactique ou thérapeutique. Parmi les antiseptiques nous pouvons citer : le Dettol qui ici doit être dilué, l’hexachlorophène qui est un savon antiseptique beaucoup plus actif contre les bactéries Gram-positives que contre les Gram-négatives, le mélange éthanol/eau (70/30) qui peut servir d’antiseptique général pour la peau, les composés d’ammonium quaternaire comprenant le bromure de cétyltriméthylammonium qu’on introduit dans les crèmes antiseptiques et l’iode qui est un puissant antiseptique bactéricide et sporicide. I.2.2.3. Les désinfectants Par ces agents on détruit, inactive ou élimine les microbes potentiellement nuisibles – sans nécessairement affecter les autres organismes présents. Ils n’ont généralement que peu ou pas d’effet sur les endospores bactériennes. Souvent le terme « désinfection » fait spécifiquement référence à l’usage de certains produits chimiques (désinfectants) pour le traitement de surfaces ou d’objets inertes, mais on l’emploie aussi dans le sens d’antisepsie. Bien que la désinfection chimique soit très répandue, les méthodes physiques conviennent mieux dans certains cas. Parmi les nombreux désinfectants chimiques en usage, nous ne citerons ici que quelques-uns des plus communs à savoir : le phénol, le chlore, les composés d’ammonium quaternaire, et les hypochlorites. L’utilisation des rayons ultraviolets et la pasteurisation sont des méthodes de désinfection par les agents physiques. I.2.3. Quelques agents antibiotiques utilisés contre les bactéries entéropathogènes Les entérobactéries sont le plus souvent, dans le cadre médical, isolées à partir de prélèvements urétraux, vaginaux et de selles et urines. Après l’identification de la bactérie, un antibiogramme est fait afin de définir les antibiotiques utilisables dans le traitement du patient concerné. En ce qui concerne les entérobactéries, les antibiotiques généralement utilisés sont : les aminoglycosides, les polymyxines et les sulfamides. Dans leur mode d’action, ces antibiotiques peuvent inhiber la synthèse protéique, augmenter la perméabilité de la membrane ou encore interférer dans les réactions du métabolisme.
  21. 21. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 8 II. Généralités sur les principales méthodes d’évaluation de l’activité antibactérienne A côté de la méthode de diffusion en milieu solide on trouve la méthode de dilution en milieu liquide et la bioautographie. II.1. Méthode de diffusion en milieu solide (Leclerc, 1975 ; Alcamo, 1984 ; Rios & al. 1988) A cause de la simplicité de sa réalisation, cette méthode est régulièrement utilisée pour la recherche préliminaire. La substance antibactérienne à tester est mise en présence du germe étudié après que les boîtes de Pétri contenant le milieu gélosé soient ensemencées. L’activité de cette substance est évaluée à plusieurs concentrations. Après environ 18 heures de culture à 370 C on observe s’il y a inhibition dans les boîtes afin de déterminer si la substance est active ou non. Plusieurs facteurs conditionnent la formation du diamètre de la zone d’inhibition parmi lesquelles on peut citer la vitesse de diffusion de la substance à tester dans la gélose et sa concentration, la composition du milieu utilisé, la densité de l’inoculum, la sensibilité des microorganismes et les conditions d’incubation. L’inhibition se manifeste par la formation d’une auréole d’inhibition autour du lieu de dépôt de la substance. En plus du fait que cette méthode ne permet pas de quantifier les résultats, elle est également limitée dans les cas où on a une mauvaise diffusion de la substance testée sur le milieu gélosé. II.1.1. Méthode des disques de papier (Leclerc, 1975 ; Alcamo, 1984 ; Rios & al., 1988) On imprègne une certaine quantité de la substance antibactérienne à tester sur des disques de papier Whatman stériles qu’on dépose ensuite à la surface de la gélose ensemencée par le germe étudié. Les boîtes sont alors incubées dans les conditions optimales en fonction du germe testé. Au terme de l’incubation, si la substance est active vis- à-vis du germe étudié, on note la formation d’une auréole d’inhibition autour du disque. Dans le cas contraire le germe pousse normalement à la surface de la gélose. II.1.2. Méthode par incorporation à la gélose (Taudou, 1990 ; Dwivedi & Dubey, 1993) Dans les boîtes de Pétri, on introduit une quantité du produit à tester et de la gélose liquéfiée et maintenue en surfusion au bain- marie à 450 C. Après solidification de ce mélange, une suspension appropriée du germe étudié est ensemencée (en nappe de préférence). Après
  22. 22. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 9 incubation on note la plus petite concentration de la substance testée qui inhibe les germes étudiés. II.1.3. Méthode des puits (Rios & al., 1988) Cette méthode consiste à creuser des puits d’environ 6 mm de diamètre dans la gélose à l’aide d’un emporte-pièce. Les souches sont ensemencée comme précédemment. Après l’étape de pré-incubation, on introduit dans les puits, une quantité de la substance à tester qu’on laisse diffuser pendant le temps d’incubation. On note alors soit la croissance, soit l’inhibition de la souche étudiée et on mesure le diamètre d’inhibition des germes sensibles. II.1.4. Méthode de microatmosphère (Kellner & Kobert, 1954 ; Amvam & al., 1998) Pour sa réalisation, on ensemence le germe sur milieu solide dans une boîte de Pétri. Ensuite un disque de papier saturé en solution à tester est déposé au centre du couvercle de la boîte de Pétri qui est mise à incuber en position renversée. La substance à tester s’évapore et la phase volatile exerce une activité inhibitrice sur le germe testé. Une variante de cette méthode consiste à ensemencer de façon radiale plusieurs germes. Ceci permet de comparer l’activité de plusieurs germes testés dans les mêmes conditions. On pourra ainsi déterminer les zones d’extension d’inhibition sur la surface de la gélose. II.2. Méthode de dilution en milieu liquide (Alcamo, 1984 ; Torrez-Rodriguez & al. 1993) Cette méthode consiste à réaliser une gamme de plusieurs concentrations du produit à tester, dans le même volume d’un milieu de culture reparti dans des plaques à microcupules ou dans des tubes, en présence de la souche bactérienne. Après l’incubation on observe la croissance du germe dans les micro-cupules ou les tubes. La plus petite concentration qui empêche totalement la croissance visible du germe représente la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI). Cette méthode a pour avantage de mettre directement le microorganisme et la substance à tester en contact et de permettre une bonne quantification des résultats. Suivant que l’on travaille avec les plaques ou des tubes on parle respectivement de micro méthode et macro méthode de dilution. Un prolongement de cette méthode, la réalisation du test de bactéricidie, permet de mesurer la Concentration Minimale Bactéricide (CMB). Dans ce cas on effectue une subculture sur un milieu gélosé à partir des tubes ou cupules ne présentant pas de croissance.
  23. 23. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 10 Après incubation, on note la concentration d’antibactérien chez laquelle la subculture est négative (Ngono 1999). II.3. Bioautographie (Rahalison, 1994) Elle consiste à réaliser une chromatographie sur couche mince (CCM) du mélange de composés antimicrobiens à tester et à utiliser des microorganismes comme révélateurs. Après culture dans les conditions optimales, on observe la croissance des microorganismes, et on note s’il y a ou pas inhibition. Plusieurs variantes de cette méthode sont connues. Dans le cas de la bioautographie par contact la plaque de CCM est mise en contact avec la surface d’une gélose ensemencée dans une boîte de Pétri. Les produits qui auront diffusé depuis la couche mince vont agir sur les microorganismes. On observe les zones d’inhibition après incubation. Pour ce qui concerne la bioautographie directe, la CCM est directement révélée à l’aide d’une suspension de microorganismes en milieu liquide ou semi solide. Les zones d’inhibition sont observées après incubation. La CCM dans la bioautographie par immersion est immergée dans une suspension de microorganismes dans un milieu liquide. Des révélations supplémentaires peuvent être faites pour visualiser les zones d’inhibition. II.4. Détermination des CMI et CMB : Bactériostase et Bactéricidie (Carbonnelle & al., 1987 ; Ngono, 1999) Différentes techniques d'évaluation de l'activité antibactérienne peuvent être mises en oeuvre au laboratoire de bactériologie. Elles reposent sur les mesures de CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) : plus faible concentration de la substance antibactérienne capable d’interrompre, dans un milieu et à des concentrations parfaitement définies, toute croissance visible d’une souche bactérienne donnée. Selon que la substance antibactérienne inhibe la croissance bactérienne ou détruise les bactéries, il y a bactériostase ou bactéricidie. On définit également la CMB (Concentration Minimale Bactéricide) qui est la plus faible concentration de la substance antibactérienne ne laissant subsister qu’un nombre de survivants inférieur ou égal à 104 bactéries de l’inoculum (soit un survivant sur 10 000) après 18 heures de culture et à 370 C. Ce chiffre est estimé suffisant en pratique médicale. Pour certains antibactériens, la concentration permettant d’obtenir un effet bactéricide important (CMB) est proche de leur CMI et facilement atteinte dans l’organisme. Ces substances sont dites « bactéricides ». Parmi elles nous avons les bêta-lactamines (pénicillines et céphalosporines), les aminoglycosides, les polymyxines et les quinolones.
  24. 24. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 11 Pour d’autres antibactériens au contraire, leur CMB est très supérieure à leur CMI et difficile à atteindre in vivo, ils sont dits « bactériostatiques », car ils auront en clinique le plus souvent un effet bactéricide limité (102 survivants), soit un survivant sur 100 ; ce sont : les tétracyclines, le chloramphénicol et les macrolides et synergistines. III. Généralités sur Piper guineense III.1. Botanique et écologie de la plante (Noumi, 1984). P. guineense communément appelé poivre de guinée et poivre noir d’Afrique tropicale est connu sous les noms vernaculaires : Abomedjang en Bulu ; Abomedjang nkol & ondodo en Ewondo ;.Soup, Sop en Bamiléké ; C’est une plante appartenant à la famille des Pipéracées. Elle est décrite comme étant une liane à nombreuses tiges grêles flexibles ramifiées atteignant 10 à 12 m de haut en s’appuyant et en s’enroulant sur les arbres. Les feuilles sont alternes, ovales, à base élargie et arrondie. Les fleurs sont jaune verdâtres et produisent des fruits sphériques de 4 à 5 mm de diamètre, rouges à maturité. III.2. Ethnobotanique et pharmacologie Les fruits de cette plante sont utilisés dans l’assaisonnement du « Nkui » et de la sauce jaune dans la région Bamiléké. En Côte d’Ivoire, elle est très souvent associée à d’autres plantes comme condiments. Au Bénin, on associe les graines de cette plante à de nombreuses préparations médicinales comme aromatisants. (Noumi, 1984 ; Adjanohoun & al., 1989). P. guineense est utilisé dans le traitement de la toux, des maladies intestinales, des bronchites, des maladies vénériennes, du rhume et du rhumatisme. On l’utilise encore comme insecticide non toxique (Amusan & Okorie, 2002). III.3. Autres utilisations Les graines de P. guineense sont des épices qui à faible dose, sont toniques et stomachiques : elles font accroître les secrétions gastriques et pancréatiques. L’essence des racines est douée de propriétés carminatives (Noumi, 1984). Fruits et feuilles sont utilisés comme condiments. Les cendres de la plante servent à préparer un sel alimentaire. Bien qu’importés en Europe dès le XVe siècle, les fruits n’y ont pas connu une large utilisation (Busson & al., 1965).
  25. 25. Chapitre 1 : Données bibliographiques Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 12 III.4. Travaux antérieurs Ivbijaro (1990) met en évidence l’activité insecticide de l’huile de graines de P. guineense contre Callosobruchus maculatus. Cette activité est manifeste au niveau des œufs produits par l’insecte. Tchoumbougnang (1996) par ses travaux conclu que les huiles essentielles des feuilles et des fruits ont la même activité antifongique, elles sont dans tous les cas très actives vis-à- vis de M. gypseum et très peu active sur les autres germes et que l’activité de l’essence issue des feuilles serait due principalement au linalol (4,5%) alors que celle de l’huile des fruits serait liée en plus du linalol (3,5%), au p-cymène (0,3%) et γ- terpinène (0,3%). Semacumu & Kouahou (1996) trouvent que l’extrait éthéré de P. guineense est actif à des pourcentages considérables vis-à-vis de C. maculatus. A l’égard de S. oryzae cet extrait présente encore une activité très acceptable et exploitable dans la protection post-récolte de graines contre la bruche du niébé et le charançon du riz. Kamtchouing & al. (2002) confirment par leurs travaux, en faisant des tests sur des rats, l’utilisation traditionnelle de P. guineense comme stimulant sexuel. Amusan & Okorie (2002) découvrent que l’extrait éthanolique de graines de P. guineense peut être utilisé dans la protection du poisson sec contre Dermestes Maculatus. Ils concluent également que cet extrait est hautement toxique pour les insectes mais sain pour une consommation humaine. Les travaux de DONGMO (2002) révèlent que P. guineense a une activité considérable dans la lutte contre Fusarium Pallidoraseum sans toutefois montrer une inhibition totale même à 0,5 g/ml. Ngono & al. (2003) obtiennent un effet antifongique significatif avec l’extrait hydroéthanolique des graines de P. guineense.
  26. 26. Chapitre 2 : Matériel et méthodes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE
  27. 27. Chapitre 2 : Matériel et méthodes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 13 Chapitre II : Matériel et méthodes I. Matériel. I.1 Matériel végétal. I.1.1. Extraits hexanique et hydroéthanolique Les graines de P. guineense ont servi de base pour l’obtention des deux extraits étudiés. Ces graines furent achetées au marché de Bafoussam en Novembre 2002 et l’extraction a suivi en Juillet 2003 et fut exécutée d’après le protocole de la Figure 2. I.1.2. Préparation des extraits à tester I.1.2.1. Diffusion en milieu solide Cas de l’extrait hexanique Après l’opération de pesée à l’aide d’une balance de précision, l’extrait est solubilisé de façon appropriée dans du DMSO 2%. 100 mg/ml, 200 mg/ml et 400 mg/ml sont les concentrations préparées. Cas de l’extrait hydroéthanolique Ici c’est l’éthanol 50% qui est utilisé pour solubiliser l’extrait préalablement pesé. La quantité de l’extrait pesée est fonction du volume de préparation désiré. Les concentrations suivantes ont été préparées et utilisées dans les manipulations : 120 mg/ml, 240 mg/ml et 480 mg/ml. I.1.2.2. Dilution en milieu solide Une solution mère (8000 mg/ml pour l’EH et 9600 mg/ml pour l’EHE) devant servir de base pour la réalisation des gammes de concentrations dans la gélose est préparée à partir de l’extrait brut. A la suite de ceci on apprête la quantité de gélose nécessaire pour la manipulation. Cas de l’extrait hexanique Pour les tests effectués sur les trois souches bactériennes étudiées (E. coli, Klebsiella sp et Salmonella sp), la gamme de concentrations utilisée ici est la suivante : 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 400 mg/ml et 800 mg/ml. Pour arriver à cette fin le tableau 2 a été réalisé :
  28. 28. Chapitre 2 : Matériel et méthodes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 14 Figure 2 : Protocole d’obtention des extraits hexanique et hydroéthanolique Filtration Extrait hydroéthanolique 85,51 (g) Evaporation au Rotavapor Filtration Poudre végétale 1000g Macération dans l’hexane 72 h à l’obscurité avec des agitations fréquentes (Agitation continue pendant la première heure) Macération dans l’éthanol 90% 72 h à l’obscurité avec des agitations fréquentes (Agitation continue pendant la première heure) Résidu solide (Sécher à l’air libre quelques minutes) Phase hexanique Evaporation au Rotavapor Extrait hexanique 66,73 g)
  29. 29. Chapitre 2 : Matériel et méthodes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 15 Tableau 2 : gamme de concentrations de l’extrait hexanique N0 de la boîte de Pétri 1 2 3 4 5 T - T+ Volume de la gélose en ml 9,9375 9,875 9,75 9,5 9 10 8,75 Volume de la solution mère en ml (8000 mg/ml) 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 / / Volume de la gentamicine en ml (80µg/ml) / / / / / / 1,25 Concentration finale de l’extrait (mg/ml) ou de gentamicine (µg/ml) 50 100 200 400 800 0 10 Cas de l’extrait hydroéthanolique Deux séries de gammes de concentrations ont été utilisées dans ce cas afin d’optimiser l’action de l’extrait sur les souches bactériennes étudiées. C’est ainsi que pour le test sur E. coli la gamme suivante fût réalisée : 30 mg/ml, 60 mg/ml, 120 mg/ml, 240 mg/ml et 480 mg/ml. Les concentrations suivantes : 60 mg/ml, 120 mg/ml, 240 mg/ml, 480 mg/ml et 960 mg/ml sont celles exploitées pour les tests sur Klebsiella sp et Salmonella sp. Les tableaux 3 et 4 donnent le détail sur les manipulations faites à cette occasion : Tableau 3 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur E. coli) N0 de la boîte de Pétri 1 2 3 4 5 T- T+ Volume de la gélose en ml 9,96875 9,9375 9,875 9,75 9,5 10 8,75 Volume de la solution mère en ml (9600 mg/ml) 0,03125 0,0625 0,125 0,25 0,5 / / Volume de la gentamicine en ml (80µg /ml) / / / / / / 1,25 Concentration finale de l’extrait (mg/ml) ou de gentamicine (µg/ml) 30 60 120 240 480 0 10 Tableau 4 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur Klebsiella sp et Salmonella sp) N0 de la boîte de Pétri 1 2 3 4 5 T- T+ Volume de la gélose en ml 9,9375 9,875 9,75 9,5 9 10 8,75 Volume de la solution mère en ml (9600 mg/ml) 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 / / Volume de la gentamicine en ml (80µg /ml) / / / / / / 1,25 Concentration finale de l’extrait (mg/ml) ou de gentamicine (µg/ml) 60 120 240 480 960 0 10
  30. 30. Chapitre 2 : Matériel et méthodes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 16 I.2. Matériel biologique : les bactéries. L’activité de nos deux extraits a été testée sur les souches d’Escherichia coli, Klebsiella sp et Salmonella sp. Des échantillons de selles de nourrissons ont servi de base pour l’isolement et la purification de ces entérobactéries. Escherichia coli et Klebsiella sp ont été conservés sur le milieu EMB en pente dans des tubes à vis. Salmonella sp par contre était conservé sur le milieu SS également en pente dans des tubes à vis. Ces différentes souches étaient repiquées sur de nouvelles pentes après une période de 7 jours quant elles ne sont pas utilisées afin d’en assurer une bonne conservation. I.3. Milieux bactériens utilisés. I.3.1. Gélose de Mueller Hinton II (gMH) La gélose ordinaire ou gélose de Mueller Hinton II est le milieu que nous avons le plus utilisé dans les manipulations. Il s’agit d’un milieu qui se solidifie après sa préparation et est utilisé pour la réalisation des antibiogrammes et également dans la recherche. Son mode d’emploi et sa formulation se trouvent en annexe 1. I.3.2. Salmonella Shigella (SS AGAR) Il s’agit là d’un milieu différentiel hautement sélectif et servant pour l’isolation de Salmonellae et Shigellae à partir des échantillons cliniques ou alimentaires. Pour l’occasion ce milieu a été utilisé pour Salmonella sp. Sa composition ainsi que son mode de préparation se trouvent en annexe 1. I.3.3. Eosin Bleu de Méthylène (EMB) C’est un milieu de prédilection pour la croissance et l’identification des organismes coliformes donc les entérobactéries. Pour cela ce milieu fût utilisé pour identification, isolement et conservation de Escherichia coli et Klebsiella sp. En annexe 1 nous trouvons également des informations sur sa composition et sa préparation. II. Méthodes. II.1. La technique de l’extraction Les deux extraits ont été obtenus à partir d’un Rotavapor ou Vaporateur Rotatif qui sépare le solvant d’extraction de l’extrait. Le point de fusion du solvant est l’élément capital expliquant ce phénomène de séparation. Elle est définie comme la température à laquelle, sous pression atmosphérique ou toute autre pression spécifique, un liquide est transformé en vapeur ; c’est-à-dire la température à laquelle la pression de vapeur du liquide est égale à celle du gaz environnant ou vapeur. (Hackh’s Chemichal Dictinary, 1944).
  31. 31. Chapitre 2 : Matériel et méthodes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 17 La concentration des extraits étaient faite à l’aide d’un Rotavapor Heidolph. Chacun des extraits possède des substances solubles dans son solvant d’extraction. Ainsi on rencontre des substances apolaires dans l’extrait hexanique et des substances polaires dans l l’extrait hydroéthanolique. II.2. Essais antibactériens. II.2.1. Diffusion en milieu solide Dans cette technique l’extrait peut être sur des disques comme support ou peut avoir des puits comme points de départ pour la migration. Dans le cadre de ce travail les disques ont été utilisés. Lorsqu’une bactérie est sensible à un extrait donné, on note la formation d’une auréole d’inhibition autour du disque ou puits concerné. Le dépôt des cinq disques sur le milieu ensemencé a été fait de la manière suivante : G : disque imprégné de10 µl de gentamicine. S : disque imprégné de 10 µl de solvant de dilution. C1, C2 et C3 : disques imprégnés de 10 µl d’une préparation d’extrait (concentrations croissantes et doublées de C1 à C2). Figure 3 : Disposition des disques dans les boîtes de Pétri. II.2.2. Dilution en milieu liquide Dans cette méthode on permet à la souche bactérienne étudiée d’être en contact direct avec une concentration donnée de l’extrait. Lorsque l’extrait est actif ou la bactérie sensible, on notera une inhibition de la croissance de cette dernière. Les différentes préparations de 10 ml chacune des tableaux 2, 3 et 4 sont coulées dans des boîtes de Pétri et on laisse l’ensemble se solidifier à la température ambiante mais hors de portée de toute contamination microbienne. Il faut ensuite préparer l’inoculum à tester (voir Annexe 2). L’ensemencement en nappe est alors faite à la surface des boîtes. Enlever l’excès de liquide à l’aide d’une pipette Pasteur. L’incubation à 37°C est faite pendant environ 18 heures de temps. Il faut alors lire et interpréter les différents résultats. S C1C3 G C2
  32. 32. Chapitre 2 : Matériel et méthodes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 18 Quand on trouve un extrait actif à l’égard d’une souche donnée, on poursuit le travail dans le but de déterminer sa CMI et sa CMB. II.2.3. Mise en évidence de la bactéricidie Les surfaces de boîtes d’essais où il n’y a pas eu de croissance visible de bactéries sont prélevées en y promenant une anse. L’inoculum prélevé est utilisée pour ensemencer directement une nouvelle boîte de gélose. Ces dernières boîtes sont incubées 18 heures à 37° C. S’il n’y a pas de croissance, on note la concentration de la boîte prélevée comme une CMB. Elle sera notée comme une CMI s’il y a reprise de la croissance (Carbonelle & al, 1987 ; Ngono 1999). Après les résultats de la méthode de dilution en milieu solide, les tests de bactéricidie tels que présentés dans le tableau suivant ont été effectués : Tableau 5 : tests de bactéricidie Concentrations testées (mg/ml) EH EHE E. coli NT 480 Klebsiella sp 400 800 960 Salmonella sp NT 960 NT : Non Testé.
  33. 33. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE
  34. 34. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 19 Chapitre III : Résultats et discussion I. Résultats I.1. Rendements des extractions. Les rendements d’extraction ont été calculés par rapport au poids de matière végétale sèche en utilisant la formule suivante : L’extrait hexanique obtenu est rouge tandis que l’extrait hydroéthanolique est noir. Tableau 6: rendements des extractions Date et lieu d’achat des graines Date d’extraction Rendements Extrait hexanique Extrait hydroéthanolique Novembre 2002 au marché de Bafoussam Juillet 2003 6,673% 8,551% I.2. Méthode de diffusion en milieu gélosé Sur la base de tests préliminaires effectués, les concentrations d’extraits, de Gentamicine et de solvants de travail dans les tableaux 2, 3 et 4 ont été utilisées. Les diamètres d’inhibition représentent la moyenne de trois essais effectués. Les figures 1 et 2 donnent un aperçu des résultats obtenus. I.2.1. Cas de l’extrait hexanique Tableau 7: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hexanique Concentrations (mg/ml) Extrait hexanique 100 200 400 Gentamicine 10µg/ml DMSO (2%) E. coli 0 2 1 11 0 Klebsiella sp 1 2 3 12 0 Salmonella sp 1 3 4 11 0 Masse d’extrait X 100 Rendement (%) = Masse de matière végétale
  35. 35. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 20 I.2.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique Tableau 8: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hydroéthanolique Concentrations (mg/ml) Extrait hydroéthanolique 120 240 480 Gentamicine 10µg/ml Ethanol (50%) E. coli 1 2 7 12 0 Klebsiella sp 1 1 1 11 0 Salmonella sp 2 4 4 11 0 Figure 4: Activité de l’EH sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C) Figure 5 : Activité de l’EHE sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C) I.3. Méthode de dilution en milieu solide Les concentrations utilisées ici découlent de celles utilisées dans la méthode de diffusion en milieu gélosé. Les essais ont été repris deux fois pour confirmation de résultats. I.3.1. Cas de l’extrait hexanique Les résultats obtenus pour cet extrait sont résumés dans le tableau 9: A B C A B C
  36. 36. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 21 Tableau 9 : CMI de l’EH du test d’incorporation à la gélose. Concentrations de l’extrait (mg/ml) T- 50 100 200 400 800 T+ E. coli + + + + + + - Klebsiella sp + + + + - - - Salmonella sp + + + + + + - T- : Témoins négatif (DMSO 2%). T+ : Témoins positif (10µg/ml de gentamicine). - : Pas de croissance bactérienne (inhibition). + : Croissance. I.3.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique Les résultats obtenus pour cet extrait sont résumés dans le tableau 10 : Tableau 10 : CMI de l’EHE du test d’incorporation à la gélose. Concentrations de l’extrait (mg/ml) T- 30 60 120 240 480 960 T+ E. coli + + + + + - NT - Klebsiella sp + NT + + + + - - Salmonella sp + NT + + + + - - T- : Témoins négatif (Ethanol 50%). T+ : Témoins positif (10µg/ml de gentamicine). NT : Non Testée. - : Pas de croissance bactérienne (inhibition). + : Croissance. Les figures 6, 7, 8, 9, 10 et 11 illustrent les différents résultats précédents : Figure 6 : Test sur E. coli par l’EH Gentamicine 10 µg/ml EH 200 mg/ml EH 100 mg/ml EH 50 mg/ml EH 800 mg/ml EH 400 mg/ml DMSO 2%
  37. 37. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 22 Figure 7 : Test sur Klebsiella sp par l’EH Figure 8 : Test sur Salmonella sp par l’EH Figure 9 : Test sur E. coli par l’EHE EH 400 mg/ml EH 800 mg/ml EH 100 mg/ml EH 50 mg/ml EH 200 mg/ml DMSO 2% Gentamicine 10 µg/ml EH 50 mg/ml EH 100 mg/ml EH 400 mg/ml EH 800 mg/ml EH 200 mg/ml Gentamicine 10 µg/ml DMSO 2% EHE 800 mg/ml EHE 400 mg/ml Ethanol 50% EHE 50 mg/ml EHE 100 mg/ml EHE 200 mg/ml Gentamicine 10 µg/ml
  38. 38. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 23 Figure 10 : Test sur Klebsiella sp par l’EHE Figure 11 : Test sur Salmonella sp par l’EHE I.4. Tests de bactéricidie Ces tests ont également été repris deux fois afin de garantir la qualité scientifique des résultats. I.4.1. Cas de l’extrait hexanique Pour les boîtes 400 et 800 mg/ml (concentrations utilisées contre Klebsiella sp) on ne note aucune reprise de croissance. Dans ce cas nous avons CMB = 400 mg/ml. I.4.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique E. coli : On ne note aucune reprise de croissance pour la boîte 480 mg/ml. La CMB ici est de 480 mg/ml. Klebsiella sp : La boîte 960 mg/ml présente une reprise de croissance. On aura pour CMI ici 960 mg/ml. Salmonella sp : Dans la boîte 960 mg/ml il n’y a pas de croissance bactérienne. CMB = 960 mg/ml EHE 50 mg/ml EHE 400 mg/ml EHE 800 mg/ml EHE 100 mg/ml EHE 200 mg/ml Gentamicine 10 µg/ml Ethanol 50% EHE 50 mg/ml EHE 400 mg/ml EHE 800 mg/ml EHE 100 mg/ml EHE 200 mg/ml Gentamicine 10 µg/ml Ethanol 50%
  39. 39. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 24 Les figures 12 et 13 illustrent les résultats obtenus par ces tests de bactéricidie. Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH kj Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’ Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH Figure 13 : Tests de bactéricidie pour l’EHE A C B A : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EH 400 mg/ml (test sur Klebsiella sp)’’ dans la technique de dilution en milieu solide B : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EH 800 mg/ml (test sur Klebsiella sp)’’ dans la technique de dilution en milieu solide C : Gentamicine 10 µg/ml A C B D A : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EHE 480 mg/ml (test sur E. coli)’’ dans la technique de dilution en milieu solide B : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EHE 960 mg/ml (test sur Klebsiella sp)’’ dans la technique de dilution en milieu solide C : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EHE 960 mg/ml (test sur Salmonella sp)’’ dans la technique de dilution en milieu solide D : Gentamicine 10 µg/ml
  40. 40. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 25 II. Discussion Le rendement d’extraction pour l’extrait haxanique (6,673%) est comparable à celui obtenu par Ngono qui toujours avec les graines de Piper guineense a eu pour l’extrait hydroéthanolique des rendements variant entre 7,11 et 8,96% (Ngono, 1999). Pour ce qui est de l’extrait hydroéthanolique, son rendement (8,551%) est dans la gamme de ceux de Ngono (1999) et est également proche de celui obtenu par Rosario & al. (2003) lors de l’extraction des graines de Croton ruizianus (8,2%), plante utilisée dans le traitement de blessures et comme antiseptique. Au terme de l’évaluation de l’activité antibactérienne des deux extraits de graines de P. guineense étudiés, il ressort clairement que l’extrait hydroéthanolique est le plus actif. Cet extrait présente une CMB pour E. coli (480 mg/ml), une autre pour Salmonella sp (960 mg/ml) et une CMI pour Klebsiella sp (960 mg/ml). La technique de diffusion en milieu solide prouve que l’extrait hexanique possède des substances pouvant agir sur les trois souches bactériennes étudiées. Malheureusement, il était impossible d’aller jusqu’à certaines concentrations élevées dans la méthode de dilution en milieu solide. Des concentrations en extrait d’une certaine valeur empêchent en effet la gélose de jouer son rôle de gélifiant lors de la consolidation du milieu. Ainsi, seule la CMB de l’extrait pour Klebsiella sp a été obtenue (400 mg/ml). Lorsque l’analyse est faite sous un autre angle, on trouve que Klebsiella sp est la bactérie la plus vulnérable parmi les trois étudiées ici. Dans la méthode de diffusion en milieu solide, on note pour le cas de l’extrait hexanique (test sur E. coli), que le passage de la concentration 200mg/ml à 400mg/ml se traduit par une baisse du diamètre d’inhibition. On constate également que ces diamètres restent constants dans le cas de l’extrait hydroéthanolique quand le test est fait sur Klebsiella sp. Ces constats peuvent s’expliquer par plusieurs raisons. La diffusion en milieu solide des substances antibactériennes est influencée par plusieurs facteurs parmi lesquels, la concentration de la substance sur le disque. Cette concentration doit être inférieure ou égale à la CMI qui sera obtenue en dilution. On note l’impossibilité de la diffusion quand la concentration de la substance antibactérienne est deux à quatre fois la CMI. La seconde raison est le temps critique ou temps minimal de préincubation. Lorsque ce temps est débordé on ne peut plus noter une activité de la substance antibactérienne. Une autre raison est le dépassement de la population critique qui traduit la concentration de l’inoculum bactérien à partir de laquelle ne se forme plus de plage d’inhibition. On peut finalement faire mention ici du fait que la diffusibilité de la substance testée est également importante. Ces différentes raisons sont soutenues dans leur intégralité par Carbonnelle & al. (1987) et évoquées en partie par Ngono (1999). Pour ce
  41. 41. Résultats et discussion Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 26 qui est des deux faits observés dans ce travail et mentionnés en début de ce paragraphe, nous pensons, à la vue des conditions de travail, que la charge du disque en serait la cause principale si non unique. Il faut donc toujours tenir compte de la charge du disque dans de telles manipulations. Pour ce qui concerne les autres diamètres obtenus, on peut noter que l’antibiotique de référence utilisé ici a montré une bonne activité avec des diamètres d’inhibition oscillant entre 10 et 11mm. Le DMSO et l’éthanol utilisé comme témoins négatifs n’ont eu d’effet sur la croissance bactérienne. Les valeurs de CMI et CMB obtenues pour les deux extraits sont inférieures à 1000 mg/ml. Elles sont ainsi très petites devant celles trouvées par Ahmad & al. (2000) au terme de l’étude des activités antimicrobiennes de l’extrait éthanolique de T. bellirica sur Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Salmonella typhimurium, E. coli et Candida albicans (4000 à 7000 mg/ml). Il faut également noter que ces mêmes valeurs obtenues pour les deux extraits de P. guineense dans ces travaux sont largement supérieures à celles obtenues par Ngono (1999) pour l’extrait éthanolique et ses fractions. Les concentrations actives alors trouvées variaient entre 100 et 1000 µg/ml. Signalons que les fractions dérivées de cet extrait alcoolique étaient très activent sur les champignons étudiés. Nous pouvons comprendre que les activités présentées par P. guineense sur E. coli, Klebsiella sp et Salmonella sp sont liées aux diverses substances contenues dans chacun des deux extraits.
  42. 42. Conclusion et perspectives Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE
  43. 43. Conclusion et perspectives Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 27 CONCLUSION ET PERSPECTIVES En réalité il est clair qu’un travail de recherche ne peut être déclaré complètement achevé. On arrive toujours juste à des conclusions partielles qui ouvrent de nouveaux horizons pour la recherche. Le présent document ne saurait se soustraire à cette réalité. Faire une contribution dans la résolution des difficultés que pose dans beaucoup de pays du monde les diarrhées et autres infections infantiles causées par les entérobactéries est l’objectif principal qui était assigné à ce travail. Les résultats obtenus ont permis de dire aujourd’hui que l’extrait hexanique tout comme l’extrait hydroéthanolique des graines de P. guineense présentent des activités antibactériennes. Klebsiella sp est l’espèce sensible à la fois pour les deux extraits. E. coli quant à lui s’est montré sensible à l’action de l’extrait hydroéthanolique. A son égard, l’extrait hexanique a eu une activité en demi-teinte car elle ne s’est limitée qu’à la technique de diffusion en milieu solide. Ce fut le même cas de figure pour Salmonella sp. Plusieurs projets de recherche se dégagent de ce travail à la vue des éléments qu’il faut encore élucider et voir même explorer. Cette étude n’a pris en compte que les extraits hexanique et hydroéthanolique. Une investigation peut donc être faite sur les entérobactéries responsables d’infections et de diarrhées infantiles, mais utilisant un extrait total des graines de P. guineense. D’autres tests encore peuvent se faire en utilisant des fractions obtenues de ces différents extraits du poivre de guinée. Ceci permet de se faire une idée plus claire sur les substances agissant sur les bactéries étudiées. Notons pour terminer qu’on peut également mener ces mêmes recherches en utilisant la technique de dilution en milieu liquide. P. guineense, malgré ses diverses utilisations dans le monde par les peuples et les organisations à travers les civilisations, se montre par ce travail comme une ressource de substances aux propriétés antibactériennes et tout particulièrement les entérobactéries responsables de diarrhées et infections infantiles.
  44. 44. Bibliographie Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE
  45. 45. Bibliographie Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 28 BIBLIOGRAPHIE 1. Adjanohoun E.J., Adjakidje V., Anyi M. R. A., Ake A. L., Akoegninou A., d’Aleida J., Apovo F., Bouke F. K., Chadare M., Cusset G., Dramane K., Eyme J., Gassita J. N., Gbaguidi N., Goudote E., Guinko S., Hounson P., Issa Lo, Keita A., Kiniffo H. V., Konebamba D., Musampa N. A., Saadou M., Sodo-Gandji Th., De S. S., Tchabi A., Zinsou D. C. et Zohoun T.; Médecine traditionnelle et pharmacopée : Contribution aux études ethnobotaniques et floristiques de la République populaire du Bénin; A.C.C.T., Paris; 274-282, 305 (1989). 2. Ahmad I., Mehmood Z., Mohammad F. et Ahmad S.; antimicrobial potency and synergistic activity of five traditionally used Indian medicinal plants. Journ. of Med. and Aromatic Plant Sci.; 22 (1): 34 (2000). 3. Alcamo E. I.; Fundamentals of microbiology; Addison-Wesly publishing company, London; 310-341, 617-699 (1984). 4. Amusan A.A.S. et Okorie T.G.; The use of P.guineense fruit oil (PFO) as protectant of dried fish against Dermestes Maculatus (Degeer) infestation; Glob. J. of P. and App. Sci. ; 8 (2): 197-201 (2002). 5. Amvam Z. P. H., Biyiti L., Tchoumbougnang F., Menut C., Lamaty G. and Bouchet P.; Aromatic plants of tropical Central Africa. Part XXXII Chemical composition and antifungal activity of thirteen essential oils from aromatic plants of Cameroon; Flavour Fragrance J.; 13: 107-114 (1998). 6. Busson F., Jaeger P., Lunven P. et Pinta M.; Plantes Alimentaires de l’Ouest Africain ; Etude botanique, Biologique et chimique ; Marseille Leconte ; 126 (1965). 7. Carbonnelle B., Denis F., Marmonier A., Pinon G., Vargues R. ; Bactériologie médicale, Techniques usuelles ; 3ème tirage, SIMEP S.A.-Paris, France, 231 – 250 (1987). 8. Dongmo A. M. E. ; Evaluation de l’activité antifongique des huiles essentielles extraites de huit épices vis-à-vis de Fusarium Pallidoroseum ; Mémoire de maîtrise Biochimie à l’Université de Douala, 28 (2002). 9. Dosso M., Coulibaly M. & Kadio A., Place des diarrhées bactériennes dans les pays en développement, (1998).
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  47. 47. Bibliographie Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE 30 23. Semacumu G. et Kouahou F. ; Effet d’extraits de plantes sur la bruche du niébé (Callosobruchus maculatus Fab) et le charançon du riz (Sitophilus oryzae L.) ; Cahier Agricultures ; 5 :39-42 (1996). 24. Singleton P. ; Bactériologie, 2e édition ; Masson ; 1-224 (1994). 25. Stewart F. S. et Beswick T. S.; Bacteriology, Virology and Immunity for Students of Medicine, Tenth edition, 201-203 (1977). 26. Taudou A. ; Activité antifongique des Labiatae; Données bibliographiques; Etudes in vitro de treize huiles essentielles (Intérêt de la microémulsion) ; Thèse de Doctorat d’Etat ès-Sciences pharmaceutiques ; Université Paul Sabatier- Toulouse ; 1-245 (1990). 27. Tchoumbougnang F. ; Contribution à la détermination des teneurs, des caractéristiques chimiques et des activités antifongiques des huiles essentielles de quelques plantes aromatiques, condimentaires et médicinales du Cameroun ; Thèse de Doctorat 3e Cycle en Biochimie, Université de Yaoundé I ; 168-171, 224-240 (1996) 28. Torres-Rodriguez J. M., Carrillo-Munoz A. et Madrenys-Brunet N.; Minimal inhibitory concentrations of Sertaconazole, Miconazole and Clotrimazole against 14 strains of Scopulariopsis brevicaulis isolated from onychomycoses ; J. Mycol. Méd.; 4: 225-228 (1993).
  48. 48. Annexes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE I ANNEXES ANNEXE 1: PROTOCOLE DE PREPARATION DES MILIEUX gMH, SS ET EMB. GELOSE MUELLER HINTON II (gMH). Base servant pour réalisation de l’antibiogramme par la technique des disques (diffusion en gélose). Mode d’emploi : Mettre 38 g de poudre en suspension dans un litre d’eau distillée stérile. Bien mélanger. Chauffer sous agitation fréquente et laisser bouillir pendant une minute de manière à dissoudre parfaitement la poudre. Placer l’ensemble à l’autoclave à 121° C pendant 15 minutes. Ne pas surchauffer. Formule approximative par litre Extrait de bœuf……………………….2,0 g Hydrolysat acide de caséine ……….17, 5 g Fécule de maïs………………………1,5 g Gélose…………………………………17,0 g pH définitif …………………………….7,3 ± 0,1 EOSINE BLEU DE METHYLENE (EMB). Milieu différentiel pour l’isolement et l’énumération des organismes coliformes Indications: Peser 37,5 g de poudre et les disperser dans un litre d’eau distillée stérile. Laisser tremper 10 minutes. Remuer pour mélanger et stériliser en portant à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes. laisser refroidir jusqu’à 47°C et agiter légèrement pour assurer une distribution uniforme des composés précipités avant de couler dans des boîtes de Pétri. Apparence : Bleu/pourpre. Formulation grammes/litre Peptone équilibrée N°1………………………10,0 Lactose…………………………………...……10,0 Phosphate Dipotassique………………………0,7 Phosphate Monopotassique…….……………1,3 Eosin Y…………………………………….……0,4 Bleu de Méthylène……………….…………0,065 Agar N°2………………………………………15,0 pH …………………………………………6,8±0,2
  49. 49. Annexes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE II SALMONELLA SHIGELLA (SS AGAR) Directions : Peser 60 g de poudre et y ajouter 1l d’eau distillée stérile. Laisser trempé 10 minutes. Remuer pour mélanger et porter l’ensemble à l’ébullition. Laisser refroidir à 47°C, bien homogénéiser et couler les boîtes. Sécher la surface avant inoculation. Ne pas porter ce milieu à l’autoclave. Il s’agit d’un milieu hautement sélectif pour l’isolement de Salmonella et Shigella à partir d’échantillons alimentaires ou cliniques. Formulation grammes/litre Extrait de Bœuf 5,0 Peptone équilibrée 5,0 Citrate de Sodium 8,5 Thiosulphate de Sodium 8,5 Agar Agar 13,5 Lactose 10,0 Lamelle de bile n°3 8,5 Citrate ferrique 1,0 Vert Brillant 0,00033 Rouge Neutre 0,025 pH 7,0 ± 0,1 ANNEXE 2 : COMPTAGE DE BACTERIE (Singleton, 1994) Avant l’utilisation des différentes souches bactériennes il fallait faire leur comptage afin d’avoir 106 UFC (Unités Formant Colonie). Voici le procédé employé pour cela : Une colonie purifiée et gardée en pente sur le milieu approprié est mise en solution à l’aide de quelques ml d’EDS. Prélever ensuite un ml par exemple de cette préparation qu’on dilue dans environ 20 ml d’EDS. Monter l’échantillon sur une cellule de Mallassez (ou toute autre cellule de comptage disponible) et laisser l’ensemble reposer 30 minutes. A l’aide d’un compteur et d’un microscope, compter les bactéries visibles sur tout le quadrillage de la cellule. Si le résultat du comptage donne par exemple n’, utiliser la formule suivante pour déterminer la concentration de la préparation en bactéries :
  50. 50. Annexes Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE III N=n x 105 . Ici n= n’/25 et N est le nombre de bactéries par ml de préparation. Dans le cas où N est supérieur à 106 UFC, faire une dilution appropriée pour retrouver la concentration désirée. Il faudra reprendre toute l’opération si jamais on trouvait N inférieur à 106 UFC.

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