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Références bibliographiques
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Références bibliographiques 28
[15] Cooks, R. G. ; Kruger, T. L. Intrinsic basicity determination using metastable ions. J...
Références bibliographiques 29
[31] Drahos, L. ; Vékey, K. Entropy evaluation using the kinetic method : is it feasible ? ...
Références bibliographiques 30
[46] Su, Z ; Cocinero E. J. ; Stanca-Kaposta E. C. ; Davis B. G. ; Simons J. P. Carbohydrat...
Conditions expérimentales
Produits et solvants utilisés :
Tous les produits ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Loui...
Préparation des solutions de travail :
Les solutions sont préparées en utilisant les proportions proposées par Augusti et ...
Schéma de fonctionnement du spectromètre de masse Qtrap 3200 [brochure 3200 Q TRAP system, Applied Biosystems]
Différents ...
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Annexes
Liste des abréviations utilisées ..................................................................................
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M2R - ECM 2009

  1. 1. MMMaaasssttteeerrr dddeee CCCHHHIIIMMMIIIEEE 222èèèmmmeee aaannnnnnéééeee RRReeeccchhheeerrrccchhheee ««« CCChhhiiimmmiiieee IIInnnfffooorrrmmmaaatttiiiqqquuueee,,, SSSpppeeeccctttrrrooommmééétttrrriiieeesss,,, AAAnnnaaalllyyyssseee»»» 222000000888---222000000999 Distinction isomérique et quantification de monosaccharides par la méthode cinétique Thierry FOUQUET 21 septembre 2009 Laboratoire Chimie Provence Spectrométries Appliquées à la Chimie Structurale Responsable du stage : Laurence CHARLES
  2. 2. A Résumé L'analyse isomérique quantitative de trois monosaccharides (D-fructose, D-galactose, D- glucose), basée sur la dissociation de complexes trimériques simplement chargés formés par electrospray, a été réalisée selon la méthode cinétique. Divers acides aminés L et cations métalliques divalents ont été testés afin de choisir les meilleurs systèmes pour la distinction isomérique et la quantification en mélange. Une forte discrimination est observée pour de nombreux systèmes, dont le couple serine/Cu2+ et acide aspartique/Mn2+ , qui a été sélectionné pour l'analyse quantitative. Des effets de compétition pour la formation/ionisation des complexes ont été mis en évidence, mais une correction par des calibrations trois points assure la justesse et la répétabilité de la quantification en mélange binaire et ternaire. Abstract Quantitative isomeric analysis of D-fructose, D-galactose and D-glucose was achieved using collision-induced dissociation of electrosprayed trimeric ions with data analysis by the kinetic method. Several L-amino acids and divalent metal cations were tested to select the best systems for isomeric distinction and quantitation of each monosaccharide. Very high distinction could be achieved for most tested systems amongst which serine/Cu2+ and aspartic acid/Mn2+ were selected for quantitative analysis. Accurate quantitative results were obtained for each analyte in binary and ternary mixtures using three-point corrected calibration curves, which account for the competition effects evidenced to occur between sugars for the formation of the trimeric complexes.
  3. 3. B Préambule Ce rapport sera sans aucun doute mon dernier écrit à caractère scolaire, tout au moins dont la portée n’excède pas le seul appât du gain pour une note honorable. Même si la forme et le fond n’imitent en rien les autres rapports que j’ai pu rédiger jusqu’ici. C’est avec un certain contentement, et une émotion certaine que je considère cet aboutissement aujourd’hui, et j’invite le noble lecteur à prendre la mesure de cette charge émotionnelle à travers ces quelques lignes, car elle ne transparaîtra fort heureusement plus dans le texte. Que l’on rassure les correcteurs, la fantaisie de cette première personne ne se prolonge que dans les remerciements ci-après, et laisse place au sérieux le plus absolu pour le reste du document. N’en déplaise aux autres lecteurs. Marseille, le 2 septembre 2009. Remerciements Mes premiers remerciements vont de toute évidence à Laurence Charles, pour la confiance accordée en me permettant de réaliser mon stage de fin d’étude dans son laboratoire, ainsi que pour l’aide précieuse apportée pour les divers travaux réalisés. Je remercie également le Spectropôle (comme le veut la formule consacrée et usitée assez largement) pour l’accès privilégié aux instruments. Quitte à choquer l’humaniste, j’adresse une pensée émue à la QTrap 3200 Applied Biosystems avant que de finir les remerciements envers les gens, mais j’aurai passé plus de temps en sa bruyante et fraîche compagnie qu’avec quiconque certains jours heureux. Montaigne me le pardonne, je saluerai aussi le QToF, dont je n’ai qu’effleuré l’utilisation. Mais enfin, boucher les deux instruments, deux capillaires, briser une seringue Hamilton et faire du caramel – le tout en six mois – sans citer ces machines serait un manque flagrant de respect, même envers un spectromètre de masse. Et sans m’étendre davantage pour ne pas détourner le rare lecteur du but premier de ce manuscrit, je remercie chaleureusement et d’une traite toutes les bonnes âmes du laboratoire que je côtoie chaque jour. Eux-mêmes ne liront pas ce texte, mais si par pure fantaisie au détour d’une pause café sans conversation, l’un d’eux venait à poser ses yeux sur cette page, je sais qu’il sera assez modeste pour ne pas s’offusquer de l’absence de son nom.
  4. 4. 1 Sommaire Table des illustrations et des tableaux....................................................................... 2 Introduction ................................................................................................................. 3 Principes de la méthode cinétique.............................................................................. 5 Méthode cinétique pour la thermochimie.........................................................................................5 Méthode cinétique pour la distinction chirale..................................................................................7 Méthode cinétique pour la distinction isomérique ...........................................................................9 Résultats et discussion...............................................................................................11 Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique ..............................................................11 Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique : variante en ligand fixe .......................16 Quantification en mélange..............................................................................................................18 DĠůĂŶŐĞ ďŝŶĂŝƌĞ͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘ ϭϴ DĠůĂŶŐĞ ƚĞƌŶĂŝƌĞ͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘ Ϯϰ Conclusion..................................................................................................................26 Références bibliographiques ....................................................................................27
  5. 5. 2 Table des illustrations et des tableaux Figures : Figure 1 : Structure cyclique à six chaînons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés. Figure 2 : Spectres ESI-MS/MS des deux clusters trimériques [M(réf)2(A)-H]+ avec le système Cu/Pro, pour la distinction énantiomérique des acides aminés L et D-Tyrosine. Figure 3 : Spectres ESI/MS-MS des trois clusters [M(réf)2(A)-H]+ des sucres étudiés pour le système Cu/Ser. Figure 4 : Comparaison des spectres ESI-MS/MS des clusters trimériques [Fe(Asn)(Thr)(sucre)-H]+ et [Fe(Thr)2(sucre)-H]+ quant à la fragmentation secondaire. Figure 5 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire liquide Ƚ୧ ୪ d’un des sucres. Figure 6 : Abondance ionique du cluster trimérique [Cu(Ser)2(fru)-H]+ en fonction de la concentration en D-fructose, pour différentes concentrations en D-glucose (13 C1) exprimées en mM. Figure 7 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire liquide Ƚ୧ ୪ d’un des analytes. Tableaux : Tableau 1 : Acides aminés L utilisés comme références dans le cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+ . Tableau 2 : Récapitulatif des comportements observés pour une série de références et de métaux en ESI-MS. Tableau 3 : Récapitulatif des systèmes potentiellement discriminants pour les trois sucres. Tableau 4 : Résultats de quantification des fractions molaires en mélange binaire, par une calibration deux points (standard) et trois points (corrigé) pour les trois monosaccharides étudiés. Tableau 5 : Résultats de quantification obtenus pour les mélanges ternaires I, II et III, par la méthode cinétique corrigée.
  6. 6. 3 Introduction Les sucres constituent la classe la plus riche et la plus complexe de la grande famille des biomolécules, et leurs rôles variés concernent de nombreux domaines, du transport et stockage de l’énergie dans le métabolisme des êtres vivants à la reconnaissance cellulaire, en passant par la structuration de tissus végétaux [1-3]. Leur capacité générale à former avec des métaux de transitions des complexes polydentates, propriété largement utilisée dans la suite de ce travail, les rend particulièrement utiles pour le transport de métaux ou de complexes métalliques à travers la membrane cellulaire [4]. Certains sucres peuvent également être utilisés comme vecteur ou comme base pour un principe actif, tel que l’acide shikimique (base de fabrication du Tamiflu, antiviral utilisé dans le traitement de certaines souches de la grippe) ou l’héparine (anticoagulant puissant). Ces propriétés parmi d’autres motivent la mise en place de techniques d’identification et de quantification de sucres natifs isomères ou énantiomères, dont les monosaccharides qui constituent les molécules de base des sucres complexes, en particulier les hexoses et pentoses, formes les plus représentées. Les techniques de Résonance Magnétique Nucléaire sont irremplaçables pour la détermination structurale des saccharides, des équilibres forme ouverte/forme cyclique et anomériques mais sont rapidement limitées par la complexité des signaux obtenus en mélange. Les méthodes chromatographiques sont quant à elle très efficaces pour séparer des sucres isomères [5,6] ou énantiomères [7] mais sont longues à mettre en œuvre. En revanche, la spectrométrie de masse peut distinguer et/ou quantifier avec succès des sucres en mélange. La discrimination purement qualitative de pentoses et d’hexoses par comparaison du profil de fragmentation induite par collision (CID) d’adduits métalliques [8,9], azotés [10,11] ou plus complexes [12] est une méthode déjà largement utilisée, mais la quantification d’isomères en mélange binaire ou ternaire nécessite la comparaison de l’abondance de plusieurs ions fragments dans le spectre MS/MS couplée à un développement d’algèbre matricielle [13]. Une autre méthode, basée sur des réactions ion/molécule en phase gazeuse, permet de distinguer des composés énantiomères en comparant la cinétique d’échange d’un ligand entre un adduit chiral et un gaz neutre, qui varie avec la chiralité de l’analyte inclus dans l’adduit [14]. Toutes ces opérations peuvent être effectuées grâce à la méthode cinétique développée par Cooks [15] et déclinée sous de nombreuses formes. Cette méthode, dont les bases sont développées dans la première partie de ce
  7. 7. travail, permet de distinguer et quantifier des composés énantiomèr l’étude des cinétiques de fragmentation de complexe d’un ion central, d’une molécule de référence succès à la distinction et quantification la distinction isomérique et quantification pour la distinction isomérique de monosaccharides. donc une nouvelle application de la méthode cinétiq en mélange binaire et ternaire de monosaccharides isom galactose (Figure 1). Figure 1 : Structure cyclique à six chaî Les objectifs de cette étude sont dans un discriminant les trois monosaccharides, sucres en mélange binaire et ternaire possible. de distinguer et quantifier des composés énantiomères ou isomères en mélange l’étude des cinétiques de fragmentation de complexes dimériques [16] ou trimériques, central, d’une molécule de référence et d’un des analytes considérés et quantification chirale d’acides aminés [17] et de sucres [ t quantification de peptides [20], la méthode cinétique a été évaluée ici pour la distinction isomérique de monosaccharides. Le travail présenté dans ce rapport démontre donc une nouvelle application de la méthode cinétique permettant la distinction et la quantification mélange binaire et ternaire de monosaccharides isomères, le D-glucose, tructure cyclique à six chaînons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés Les objectifs de cette étude sont dans un premier temps d’obtenir un en les trois monosaccharides, puis de tester ces systèmes pour quantifier ces mêmes sucres en mélange binaire et ternaire, dans une gamme de fractions molaires Introduction 4 es ou isomères en mélange par ] ou trimériques, composés et d’un des analytes considérés. Déjà appliquée avec sucres [18,19], ainsi qu’à la méthode cinétique a été évaluée ici Le travail présenté dans ce rapport démontre la distinction et la quantification glucose, le D-fructose et le D- nons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés. premier temps d’obtenir un ensemble de systèmes ces systèmes pour quantifier ces mêmes de fractions molaires aussi large que
  8. 8. 5 Principes de la méthode cinétique Méthode cinétique pour la thermochimie La méthode cinétique standard développée par Cooks [15] dans les années 1970 est une méthode approchée pour la détermination de propriétés thermochimiques, basée sur la mesure des cinétiques de dissociation compétitive d’un ion cluster. Dans sa forme première, le cluster simplement chargé est formé d’un ion central monovalent (noté C) coordinant une molécule de référence (notée réf) dont on connait une propriété thermochimique, et l’analyte considéré (noté A) pour qui ladite propriété thermochimique est inconnue. La fragmentation de ce cluster est supposée limitée aux pertes compétitives de la référence et de l’analyte. Dans le cadre d’une expérience ESI-MS/MS, où le cluster est soumis à dissociation induite par collision, ce processus peut être décrit comme suit : Ϊ ǡ ”±ˆ ”±ˆ ǦǦǦ Ϊ ǦǦǦ
  9. 9. ͳ ʹ ”±ˆ ǦǦǦ Ϊ ǦǦǦ Ϊ φ ‰ƒœ (1) Les constantes de vitesse de dissociation k1 et k2 reflètent l’affinité de l’analyte et de la référence pour le cation central C, l’intérêt du spectre MS/MS tenant du fait que ces constantes peuvent être imagées par l’abondance des ions fragments associés, soit : ଵ ଶ ؆ ሾ െ ାሿ ሾ”pˆ െ ାሿ (2) Un développement thermodynamique approché [21] permet d’écrire : ο‫ܩ‬ș ൌ െܴீ௉ ȉ ܶ ‫ڄ‬ ݈݊ሺ݇ሻ (3) où RGP est la constante des gaz parfaits, T la température et ο‫ܩ‬ș l’énergie libre d’activation. Soit dans le cas de deux cinétiques de dissociation, à partir de l’équation (3) : ݈݊ ൬ ݇ଵ ݇ଶ ൰ ൌ ο‫ܩ‬ଵ ș െ ο‫ܩ‬ଵ ș ܴீ௉ ȉ ܶ ൌ οο‫ܩ‬ș ܴீ௉ ȉ ܶ (4) En supposant qu’il n’existe pas de barrière d’activation (οο‫ܩ‬ș ൌ οο‫)ܩ‬ et que les phénomènes entropiques sont négligés (cf. plus bas), on obtient : ݈݊ ൬ ݇ଵ ݇ଶ ൰ ൌ οο‫ܪ‬ ܴ ȉ ܶ ՜ ݈݊ ൬ ݇ଵ ݇ଶ ൰ ൌ οο‫ܪ‬ ܴ ȉ ܶ௘௙௙ (5)
  10. 10. Méthode cinétique pour la thermochimie 6 La température effective (notée Teff), insérée ici artificiellement pour contourner le fait que les clusters en phase gazeuse sont des espèces isolées, donc ne sont en équilibre thermodynamique à aucune température [22], peut trouver un sens plus fondamental en la considérant comme l’énergie interne d’une population de clusters activés, homogène à une température [23-26], et une origine plus formelle en utilisant le formalisme de la physique statistique pour obtenir les équations précédentes, réalisé par Ervin [22] dans le cas microcanonique. Prenons pour exemple de propriété thermochimique à déterminer pour un analyte A l’affinité ionique AI pour un ion C+ , que l’on définit comme l’enthalpie de la réaction suivante : ‫ܥܣ‬ା ՜ ‫ܣ‬ ൅ ‫ܥ‬ା (a) ‫ܫܣ‬ሺ‫ܣ‬ሻ ൌ ο‫ܪ‬௥ሺࢇሻ ൌ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܣ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ‬ାሻ െ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥܣ‬ାሻ (6) On définit de la même façon l’affinité ionique d’une référence pour l’ion C+ : ‫ܥ݂±ݎ‬ା ՜ ‫݂±ݎ‬ ൅ ‫ܥ‬ା (b) ‫ܫܣ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻ ൌ ο‫ܪ‬௥ሺ࢈ሻ ൌ ο‫ܪ‬௙ሺ‫݂±ݎ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ‬ାሻ െ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ݂±ݎ‬ାሻ (7) Le logarithme népérien du rapport des constantes de vitesses k1 et k2 peut s’écrire : ݈݊ ൬ ݇ଵ ݇ଶ ൰ ൌ οο‫ܪ‬ ܴீ௉ ȉ ܶ௘௙௙ ൌ ο‫ܪ‬௥ሺͳሻ െ ο‫ܪ‬௥ሺʹሻ ܴீ௉ ȉ ܶ௘௙௙ ൌ ൣο‫ܪ‬௙ሺ‫݂±ݎ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥܣ‬ାሻ൧ െ ൣο‫ܪ‬௙ሺ‫ܣ‬ሻ ൅ ο‫ܪ‬௙ሺ‫ܥ݂±ݎ‬ାሻ൧ ܴீ௉ ȉ ܶ௘௙௙ (8) L’expression (8) peut se réécrire en terme d’affinité ionique d’après les équations (6) et (7) : ݈݊ ൬ ݇ଵ ݇ଶ ൰ ൌ ‫ܫܣ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻ െ ‫ܫܣ‬ሺ‫ܣ‬ሻ ܴீ௉ ȉ ܶ௘௙௙ (9) Si l’affinité ionique du composé de référence est connue, et si l’on dispose d’une série de références d’affinité ionique AI(réf) distinctes, le tracé du logarithme népérien du rapport des constantes de vitesse mesuré pour chaque mélange analyte/référence en fonction de ces même affinités ioniques AI(réf) apporte l’affinité ionique inconnue AI(A) de l’analyte A (en tant qu’ordonnée à l’origine). Il est à noter que la non-implication des phénomènes entropiques, argumentée par l’absence de réarrangement pré-dissociatif et d’isomères du cluster, est une approximation simple et assurément simpliste du problème. Des exemples de non linéarité et d’erreurs conséquentes dans la détermination de propriétés thermochimiques lui ont d’ailleurs été attribués [27] (ainsi qu’à la mesure de la température effective), et des premiers pas dans la modélisation des clusters ont
  11. 11. Méthode cinétique pour la thermochimie 7 pointé l’existence d’isomères des clusters et de réarrangements pré et post-dissociation. D’autres versions de la méthode cinétique (isentropique, étendue) ont d’ailleurs été développées pour tenter d’inclure l’entropie dans le traitement des données [27-30], malgré les doutes de certains auteurs quant à leur réelle faisabilité et justesse [31-33]. Méthode cinétique pour la distinction chirale La méthode cinétique appliquée à la reconnaissance chirale fait bien évidemment appel au même formalisme que la méthode cinétique standard. Dans ce cas, le cluster utilisé est un complexe trimérique simplement chargé, composé d’un ion central (noté M), le plus souvent un métal de transition divalent coordinant deux molécules de référence (notées réf) et l’analyte chiral (noté A), cluster que l’on notera par la suite [M(réf)2(A)-H]+ . Le principe, similaire à celui de la chromatographie chirale [34], consiste à créer un environnement asymétrique susceptible de discriminer deux molécules énantiomères par la différence d’interactions que leur conformation propre impose. Ici, l’ion central crée cet environnement asymétrique en imposant une proximité entre les molécules de référence, chirales elles aussi, et l’analyte. Des interactions analyte/référence, analyte/métal et référence/métal sont ainsi établies et seront, si le système est bien choisi, de force ou de nature différentes selon l’énantiomère considéré. La fragmentation de ce cluster conduit (dans des conditions appropriées) aux seules pertes compétitives d’une molécule de référence et de l’analyte. Les constantes de vitesse associées, imagées par les abondances des ions fragments (notés [M(réf)(A)-H]+ et [M(réf)2- H]+ ) dans le spectre MS/MS, seront fonction de la stabilité de ces mêmes ions fragments, qui dépend des interactions précitées et donc de l’énantiomère lui-même. Si l’on note Ai un des énantiomères de l’analyte A, le schéma global de fragmentation s’écrit : ‹ ʹΪ ǡ ”±ˆ
  12. 12. ͳ ʹ Ǧ Ϊ ”±ˆ ʹΪ ”±ˆ ‹ Ϊ ”±ˆ ʹΪ ‹ Ǧ ”±ˆ ʹΪ ”±ˆ Ϊ Ǧ (10)
  13. 13. La mesure de l’abondance d’un des ions fragments re caractéristique d’un énantiomère pour un système Par analogie avec le développement thermodynamique effe on peut relier ce ratio Ri à la variation d’enthalp Si l’on note Aj un énantiomère de Ai, son ratio Rj s’écrira de la même façon Figure 2 : Spectres ESI-MS/MS des deux la distinction énantiomérique des acides aminés L et D On observe bien sur les spectres MS/MS relative de l’ion fragment m/z 358 fragment m/z 292 issu de la perte de l Méthode cinétique pour la distinction chirale La mesure de l’abondance d’un des ions fragments relativement à l’autre définit un ratio, noté R, caractéristique d’un énantiomère pour un système M/réf donné. On écrit Ri pour l’énantiomère i analogie avec le développement thermodynamique effectué dans la méthode cinétique standard, on peut relier ce ratio Ri à la variation d’enthalpie : de Ai, son ratio Rj s’écrira de la même façon : MS/MS des deux clusters trimériques [M(réf)2(A)-H]+ avec le système Cu/Pro énantiomérique des acides aminés L et D-Tyrosine [45] On observe bien sur les spectres MS/MS, selon l’énantiomère choisi, la différence d’abondance 358 issu de la perte de l’analyte (L- ou D-Tyr issu de la perte de la référence (L-Pro) qui induit une forte différence de ratio R. Méthode cinétique pour la distinction chirale 8 lativement à l’autre définit un ratio, noté R, pour l’énantiomère i : (11) ctué dans la méthode cinétique standard, (12) (13) le système Cu/Pro, pour [45]. la différence d’abondance Tyr) par rapport à l’ion différence de ratio R.
  14. 14. Méthode cinétique pour la distinction chirale 9 C’est ensuite le rapport des deux ratios R mesurés pour chacun des énantiomères, noté Rchiral, qui détermine la qualité du système pour la discrimination énantiomérique, qui est d’autant plus grande que ce ratio s’éloigne de l’unité. ܴ௖௛௜௥௔௟ ൌ ܴ௜ ܴ௝ (14) L’intérêt de la méthode cinétique à ce niveau concerne sa capacité à quantifier les énantiomères en mélange. La mesure du ratio R en mélange sera une combinaison des deux ratios des analytes chiraux i et j pris séparément, puisque les clusters formés pourront contenir chacun l’un ou l’autre des énantiomères, et par conséquent se fragmenteront selon la cinétique décrite par Ri ou Rj respectivement. Les cinétiques de dissociation observées en mélange sont alors une combinaison linéaire des enthalpies de réaction de chaque analyte, soit : ݈݊ሺܴሻ ൌ ݈݊ ቆ ሾ‫ܯ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻ൫‫ܣ‬௜ǡ௝൯ െ ‫ܪ‬ሿା ሾ‫ܯ‬ሺ‫݂±ݎ‬ሻଶ െ ‫ܪ‬ሿା ቇ ൌ ܽ ȉ οο‫ܪ‬௜ ൅ ሺͳ െ ߙሻ ȉ οο‫ܪ‬௝ ܴீ௉ ȉ ܶ௘௙௙ (15) où α est la fraction molaire de l’analyte i en mélange i/j Ce qui se réécrit, en terme de ratio, comme une combinaison linaire semi-logarithmique : ࢒࢔ሺࡾሻ ൌ ࢻ ȉ ࢒࢔ሺࡾ࢏ሻ ൅ ሺ૚ െ ࢻሻ ȉ ࢒࢔൫ࡾ࢐൯ (16) La mesure du ratio R, rapport des abondances des deux ions fragments dans le spectre MS/MS fournit ainsi la fraction molaire (soit l’excès énantiomérique) des deux énantiomères en mélange puisque les ratios des deux analytes pris séparément sont connus. D’après Cooks [18], cette dépendance linéaire permet l’utilisation d’une calibration à deux points, à ߙ௜ ൌ Ͳ ݁‫ݐ‬ ߙ௜ ൌ ͳ (soit la mesure des ratios pour chaque analyte pur), pour caractériser le système. Méthode cinétique pour la distinction isomérique Ce même principe de séparation par un environnement chiral, créé ici par la coordination de deux molécules chirales de référence autour d’un ion métallique divalent, peut être utilisé de façon tout à fait remarquable pour la distinction d’isomères, comme ce fut réalisé avec succès pour la distinction isomérique de peptides [20]. Il n’y a bien évidemment qu’une seule évolution de
  15. 15. Méthode cinétique pour la distinction isomérique 10 terminologie par rapport à la méthode cinétique appliquée à la distinction chirale, les principes et développements étant rigoureusement les mêmes. Riso remplacera Rchiral pour l’évaluation de la qualité discriminante d’un système M/réf. Le raisonnement peut alors être étendu à un nombre N de composés isomères, à la condition que l’on dispose de N-1 systèmes M/réf discriminants pour les N analytes. La mesure des N-1 ratios en mélange, connaissant le ratio de chaque analyte pris séparément pour chacun des N-1 systèmes, apporte les N fractions molaires par la résolution d’un système à N- 1 inconnues (le nombre N d’analyte et leur nature étant déjà supposés connus). ܰ ±‫ݏ݊݋݅ݐܽݑݍ‬ ‫ە‬ ۖ ۖ ۖ ‫۔‬ ۖ ۖ ۖ ‫ۓ‬ ܰ െ ͳ ‫ݏ݁݉°ݐݏݕݏ‬ ൌ ܰ െ ͳ ±‫ݏ݊݋݅ݐܽݑݍ‬ ‫ە‬ ۖ ‫۔‬ ۖ ‫ۓ‬ ݈݊൫ܴெǡ௥±௙ ൯ ൌ ෍ ߙ௜ ȉ ݈݊൫ܴ௜ ெǡ௥±௙ ൯ ே ௜ୀଵ ǥ ෍ ߙ௜ ൌ ͳ ே ௜ୀଵ ሺܰ ݈ܽ݊ܽ‫ݏ݁ݐݕ‬ ݁݊ ݉±݈ܽ݊݃݁ሻ
  16. 16. 11 Résultats et discussion Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique La première partie du travail concerne bien évidemment la recherche systématique de systèmes discriminants pour les trois monosaccharides étudiés, D-glucose, D-galactose et D-fructose. De nombreuses études précédentes, pour l’application de la méthode cinétique à diverses classes de composés chiraux (acides alpha-hydroxylés, acides aminés, sucres, …) [20,35-38] ont permis de sélectionner une gamme d’ions centraux et de références possiblement adaptés à notre recherche. Il n’existe pas en effet de règle bien définie quant à l’adéquation métal/référence/analyte et seules quelques pistes et constatations empiriques peuvent guider ce choix. L’ion central est ainsi le plus souvent un métal de transition divalent, Mn2+ , Fe2+ , Co2+ , Cu2+ et Zn2+ [39] (la littérature présente également l’utilisation de Ni2+ [40], mais les résultats médiocres obtenus avec ce métal ne seront pas présentés ici). Le calcium Ca2+ est également très utilisé [41,42], puisqu’il permet comme les ions précédents de coordiner l’ensemble référence/analyte, bien qu’il n’appartienne pas à la classe des métaux de transition. Le choix de l’ion central arrêté, une sélection de références potentielles doit être effectuée, en essayant de suivre quelques « règles » tout à fait empiriques : ƒ Référence et analyte doivent avoir une affinité ionique similaire pour l’ion central (dans notre cas une affinité métallique) [40]. Comme ces données sont le plus souvent inconnues (la méthode cinétique pourrait dans le même temps permettre de déterminer ces affinités [43], mais l’absence de toute donnée de référence n’a pas permis ce travail), on peut se référer à l’affinité protonique comme approximation de l’affinité ionique même si cette analogie n’est pas rigoureuse [44]. ƒ Une analogie structurale et fonctionnelle entre la référence et l’analyte est souhaitable [45], qui limite alors la variation d’entropie lors de la fragmentation (réarrangement pré et post- dissociation), variation considérée comme nulle dans la méthode cinétique standard présentée, ou constante dans la variation isentropique de la méthode [26]. Le choix d’une gamme de référence s’est toutefois porté, et malgré l’importance du second critère, sur les acides aminés, molécules largement utilisées dans ce rôle [18] et qui, si elles ne respectent la similarité structurale avec les sucres étudiés, peuvent présenter des fonctions chimiques semblables ou similaires.
  17. 17. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique 12 C’est le cas de sept des huit acides aminés choisis : ƒ Sérine (Ser) et Thréonine (Thr) pour les fonctions alcools, ƒ Acide aspartique (Asp) et Acide glutamique (Glu) pour les groupes carboxyles (présents chez les monosaccharides en forme acyclique), ƒ Asparagine (Asn), Glutamine (Gln) et Arginine (Arg) pour les fonctions amides ou amines. Le huitième acide aminé, la Phénylalanine (Phe), a été considéré pour sa capacité éventuelle à former des interactions « sucre – composé aromatique » décrites dans la littérature [46,47]. Tableau 1 : Acides aminés L utilisés comme références dans le cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+ . NH2 H OH O OH Ǧ±”‹‡ ȋǦ‡”Ȍ NH2 H OH O OH ǦŠ”±‘‹‡ ȋǦŠ”Ȍ NH2 H C O OH OH O …‹†‡ Ǧƒ•’ƒ”–‹“—‡ ȋǦ •’Ȍ NH2 H O OH C OHO …‹†‡ Ǧ‰Ž—–ƒ‹“—‡ ȋǦ Ž—Ȍ NH2 H O OH ǦŠ±›ŽƒŽƒ‹‡ ȋǦŠ‡Ȍ NH2 H C O OH NH2 O Ǧ •’ƒ”ƒ‰‹‡ ȋǦ •Ȍ NH2 H O OH C NH2O Ǧ Ž—–ƒ‹‡ ȋǦ ŽȌ NH2 H O OH NH C NH2NH Ǧ ”‰‹‹‡ ȋǦ ”‰Ȍ Nota : Les références utilisées sont des molécules chirales. Les formes L et D de chaque acide aminé ont été utilisées pour la recherche systématique des systèmes M/réf discriminants. Les résultats étant remarquablement semblables entre les deux formes, en termes de capacité à former le cluster trimérique et de ratio R, seuls ceux associés aux formes L des références sont présentés. Une dernière molécule de référence, choisie quant à elle pour sa grande proximité structurale et fonctionnelle avec les trois isomères est le D-fucose, soit le D-déoxygalactose. L’utilisation des références structurellement les plus proches des analytes, soit lesdits analytes marqués
  18. 18. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique 13 isotopiquement (le carbone C1 devient un carbone 13, soit un décalage de masse de +1 en MS et MS/MS) constitue une perspective à cette étude mais augmente substantiellement le coût de l’analyse. La recherche des systèmes M/réf discriminants à partir des métaux de transition et acides aminés sélectionnés s’articule autour de deux points : ƒ La formation du cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+ en ESI-MS, condition sine qua non de l’application de la méthode cinétique à la distinction isomérique ; ƒ La fragmentation de ce cluster, qui doit permettre le calcul d’un ratio R défini précédemment à partir des deux ions fragments, ce ratio devant enfin être caractéristique d’un isomère. Les résultats selon ces deux « critères » sont présentés dans les tableaux 2 et 3 : Tableau 2 : Récapitulatif des comportements observés pour une série de références et de métaux en ESI-MS. ±–ƒŽ ȋ
  19. 19. Ȍ ƒ  ‡ ‘ —  ”±ˆ±”‡…‡ Ǧ •’ Ǧ Š‡ Ǧ • Ǧ ‡” Ǧ Ž Ǧ Š” Ǧ Ž— Ǧ ”‰ Ǧ ˆ—…‘•‡ trimère non formé trimère formé : fragmentation secondaire trimère formé : - réf uniquement trimère formé : - sucre uniquement trimère formé : dissociations compétitives On notera l’absence de tendance évidente entre le numéro atomique du métal et son comportement avec une référence donnée, justifiant a posteriori la recherche empirique de systèmes discriminants. Les systèmes ne permettant pas la formation du trimère ne peuvent évidemment pas être retenus ( െ ”‰ǡ ‫׊‬ ‘— െ ˆ—…‘•‡ǡ ‫׊‬ ’ƒ” ‡š‡’Ž‡ሻ. D’autres engendrent le trimère attendu [M(réf)2(A)-H]+ mais le spectre MS/MS présente une fragmentation « secondaire » issue de l’ion précurseur et des deux ions fragments souhaités, ce qui n’est pas acceptable dans le cadre de la méthode cinétique, les fragmentations donnant les ions fragments [M(réf)(A)-H]+ et [M(réf)2-H]+ devant être les seules voies de dissociation du cluster trimérique [17]. D’autre part, si les ions fragments se dissocient à leur tour, leur abondance ionique se trouvera faussée et le ratio mesuré
  20. 20. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique 14 entaché d’une erreur dont on ne pourra garantir la répétabilité. Certains systèmes présentent une seule voie de dissociation pour les trois monosaccharides : ƒ La perte de référence uniquement, ce qui pour le moment tout du moins ne conduit à rien d’exploitable en distinction ou en quantification ; ƒ La perte de sucre uniquement, la référence devenant alors un candidat pour la variation en ligand fixe de la méthode cinétique (voir plus bas), observée dans la grande majorité pour les acides aminés à fonction amide, L-Asn et L-Gln. Les systèmes permettant la formation du trimère et présentant une fragmentation compétitive entre les deux voies de dissociation pour les trois sucres sont présentés dans le tableau 3. Tableau 3 : Récapitulatif des systèmes potentiellement discriminants pour les trois sucres. ȏ
  21. 21. ȋ‡ˆȌȋ ‹ȌǦȐΪ Ȁ ȏ
  22. 22. ȋ‡ˆȌʹǦȐΪ ‹•‘
  23. 23. ±ˆ ‰ƒŽ ‰Ž… ˆ”— ‰ƒŽȀ‰Ž… ‰ƒŽȀˆ”— ‰Ž…Ȁˆ”— ƒʹΪ •’ ͳ͸ǡ͹ ͳǡͷͻ ͷǡͺ ͳͲǡͷ ʹǡͻ Ͳǡʹ͹ • Ͳǡͷͺͳ ͲǡͲͻͲ Ͳǡʹʹ͹ ͸ǡͷ ʹǡͷ͸ ͲǡͶͲ Ž— ͻǡͲͻ Ͳǡͺͻ͵ ͵ǡͲ͵ ͳͲǡʹ ͵ǡͲͲ Ͳǡʹͻ ʹΪ •’ ʹǡ͸ʹ ͲǡͶͷ ͳǡͳͳ ͷǡͺ ʹǡ͵͸ ͲǡͶͳ Š” ʹͶ ͳǡͻ͸ ͵ǡʹ͵ ͳʹ ͹ǡͶ Ͳǡ͸ͳ ‡ʹΪ •’ ʹǡʹ͹ ͲǡͶͳͳ ͲǡͶͷͷ ͷǡͷʹ Ͷǡͻͻ ͲǡͻͲ ‘ʹΪ Š” ͻǡʹ͸ Ͳǡ͹Ͷ͸ Ͳǡͷͷ͹ ͳʹǡͶ ͳ͸ǡ͸ ͳǡ͵Ͷ —ʹΪ ‡” ͲǡͶʹͲ Ͳǡͳ͸ͳ ͲǡͲͶ͵ ʹǡ͸ͳ ͻǡͺ ͵ǡ͹ ʹΪ •’ ͳǡͶ͵ Ͳǡ͵ͳ͹ Ͳǡ͵ͳʹ Ͷǡͷͳ Ͷǡͷͺ ͳǡͲʹ Š‡ Ͷǡʹ Ͳǡͳͻʹ Ͳǡͳ͹ʹ ʹͳǡͻ ʹͶǡͶ ͳǡͳʹ Š” Ͷǡͳ͹ Ͳǡ͵ͻʹ ͲǡͶʹ ͳͲǡ͸ ͻǡͻ Ͳǡͻ͵ (les écart-types ne sont pas indiqués par souci de clarté, le nombre de chiffres significatifs renseigne sur la précision des mesures) Les complexes au calcium sont tous prometteurs en termes de distinction isomérique, mais le bouchage systématique du spectromètre lors du traitement de ces solutions a rendu leur utilisation hasardeuse puis tout à fait indésirable. Néanmoins ces trois systèmes ne doivent pas être écartés, le nitrate de calcium utilisé ici n’étant peut être pas adapté (produit ancien, hydraté). Les trois systèmes Zn/réf ne discriminent pas suffisamment le D-glucose du D-fructose (Riso trop proche de l’unité) et sont donc écartés, ainsi que le système Fe/Asp pour la même raison. Enfin, le système
  24. 24. Mn/Thr a été jugé susceptible d’induire de trop gra associée au ratio obtenu pour le D le tableau, mais le nombre de chiffres significatifs renseigne sur la précision d Il reste donc trois systèmes aptes à quantifier les Co/Thr et Cu/Ser. Puisque deux systèmes sont nécessaires et suffisant isomères, seuls Cu/Ser er Mn/Asp des Riso. Nota : La similitude des résultats observés pour les forme formes L et D des monosaccharides étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomè distinguer convenablement les énantiomères d’un mêm Figure 3 : Spectres ESI/MS-MS des trois clusters [M(réf) Les spectres MS/MS de la figure 3 les trois isomères étudiés. L’abondance ionique de référence (- L-Ser) varie avec la nature du 272 issu de la perte de l’analyte (pic de base dans les isomère. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomér Mn/Thr a été jugé susceptible d’induire de trop grandes erreurs en quantification, D-galactose (les écart-types des ratios mesurés ne figure chiffres significatifs renseigne sur la précision de la mesure). Il reste donc trois systèmes aptes à quantifier les trois monosaccharides en mélange, Mn/Asp, Puisque deux systèmes sont nécessaires et suffisants pour le traitement de troi Mn/Asp seront utilisés désormais, sélectionnés par simple La similitude des résultats observés pour les formes L et D des références se retrouve logiquement pou étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomère distinguer convenablement les énantiomères d’un même isomère. MS des trois clusters [M(réf)2(A)-H]+ des sucres étudiés pour le système Cu/Ser figure 3 illustrent la discrimination apportée par le systèm les trois isomères étudiés. L’abondance ionique de l’ion fragment m/z 347 ) varie avec la nature du sucre, relativement à l’abondance de l’ion fragment issu de la perte de l’analyte (pic de base dans les trois cas) d’où un ratio R spécifique à chaque Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique 15 ndes erreurs en quantification, vue l’incertitude pes des ratios mesurés ne figurent pas dans chiffres significatifs renseigne sur la précision de la mesure). trois monosaccharides en mélange, Mn/Asp, pour le traitement de trois seront utilisés désormais, sélectionnés par simple comparaison s L et D des références se retrouve logiquement pour les étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomères sont alors incapables de des sucres étudiés pour le système Cu/Ser. illustrent la discrimination apportée par le système Cu/Ser pour 347 issu de la perte de sucre, relativement à l’abondance de l’ion fragment m/z trois cas) d’où un ratio R spécifique à chaque
  25. 25. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique 16 Remarque : Afin de rationaliser la recherche de systèmes discriminants, une approche basée sur des calculs théoriques a été mise ne place. La modélisation des clusters trimériques et dimériques principalement effectuée pour un système simple (Ca/Thr) s’est soldée par un arrêt des calculs. En effet, la différence d’énergie de liaison [Ca(Thr)(A)-H]+ -- Thr et [Ca(Thr)2-H]+ -- A est de l’ordre de 5 kcal.mol-1 , ce qui tend vers la limite de précision de la méthode. Or le système Ca/Thr présente un comportement radical puisqu’il ne perd que la référence lors de la fragmentation. Les mêmes calculs effectués pour des systèmes présentant des dissociations compétitives ne seraient donc pas exploitables car fourniraient des résultats inférieurs à cette valeur déjà critique. A noter enfin que la section Conditions expérimentales rappelle les protocoles utilisés pour l’obtention des résultats présentés. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique : variante en ligand fixe Comme son nom l’indique assez clairement, la variante en ligand fixe est une évolution de la méthode cinétique standard appliquée à la reconnaissance chirale ou isomérique, dans laquelle l’une des molécules de référence est remplacée par un ligand fixe, c’est-à-dire non éliminé lors des dissociations compétitives. Ce ligand fixe est en fait le siège unique de la déprotonation (qui peut se produire sur les trois molécules dans la méthode standard, d’où la formation d’isomères pour le complexe trimérique) et implique une limitation des isomères du cluster ainsi que cette fixité par rapport au métal [48]. réf* sucre MII Lfixe - H unité fixe réf* sucre MII réf* - H + ligand fixe + (17) La détection des références candidates au rôle de ligand fixe passe bien évidemment par l’observation d’une perte de sucre quasi-exclusive pour tous les isomères lors de la fragmentation du cluster trimérique incluant ce même ligand fixe. La fragmentation du cluster trimérique formé de ce ligand, d’une autre référence non fixe et de l’analyte ne conduit alors à aucune perte de ligand fixe. Le ligand fixe pourra par exemple exalter la discrimination isomérique, en augmentant les interactions référence/analyte, ou limiter les problèmes entropiques par la diminution du nombre d’isomères du clusters et des réarrangements post-fragmentation.
  26. 26. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomér Dans le cas présent, l’utilisation du ligand fixe r de situations problématiques, que ƒ La non-formation du cluster trimérique, qui peut être liée rigidité structurale de la référence ƒ La trop forte fragmentation secondaire du cluster t ƒ La faible discrimination ou l’absence de discrimina monosaccharides ; ou tout simplement de celle d’améliorer la discrimination déjà effective d’un s c’est le cas dans la grande majorité des articles [48, Cette application s’est révélée ƒ le système Fe/Thr présente une fixe Fe/Asn/Thr ne présente plus cette fragmentatio discriminant pour les trois sucres ƒ le D-fucose utilisé comme seule référence ne permet aucun des métaux, tandis que le nouveau système Cu/Asn/D complexe pour les trois sucres et est également dis ƒ le système Zn/Asp a été précédemment éliminé pour s glucose et D-fructose ( trois monosaccharides ( Figure 4 : Comparaison des spectres ESI [Fe(Thr)2(sucre)-H]+ Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique – variante en ligand fixe Dans le cas présent, l’utilisation du ligand fixe relève de la volonté de résolution ou d’amélioration , que sont : formation du cluster trimérique, qui peut être liée à une gène stérique rigidité structurale de la référence ; La trop forte fragmentation secondaire du cluster trimérique et des ions fragments La faible discrimination ou l’absence de discrimination entre deux des trois d’améliorer la discrimination déjà effective d’un système M/réf, comme nde majorité des articles [48,49]. Cette application s’est révélée efficace dans certains cas pour les problèmes cités le système Fe/Thr présente une fragmentation secondaire forte alors que fixe Fe/Asn/Thr ne présente plus cette fragmentation, comme le montre la F ; me seule référence ne permet la formation du cluster trimérique avec le nouveau système Cu/Asn/D-fucose conduit à la formation du complexe pour les trois sucres et est également discriminant ; le système Zn/Asp a été précédemment éliminé pour son absence de discrimination entre D ) mais le système Zn/Asn/Asp permet la discrimination des , , ). omparaison des spectres ESI-MS/MS des clusters trimériques [Fe(Asn)(Thr)(sucre) + quant à la fragmentation secondaire (indiqué en rouge) variante en ligand fixe 17 elève de la volonté de résolution ou d’amélioration à une gène stérique ou une rimérique et des ions fragments ; tion entre deux des trois d’améliorer la discrimination déjà effective d’un système M/réf, comme efficace dans certains cas pour les problèmes cités : fragmentation secondaire forte alors que le système à ligand , comme le montre la Figure 4, et est u cluster trimérique avec fucose conduit à la formation du discrimination entre D- le système Zn/Asn/Asp permet la discrimination des ). [Fe(Asn)(Thr)(sucre)-H]+ et en rouge).
  27. 27. Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique – variante en ligand fixe 18 L’observation de résultats opposés à ceux souhaités (perte de discrimination par exemple) rendent cependant, comme la recherche de système, l’exploration hasardeuse et malheureusement systématique. Toutefois, pour la quantification d’isomères en mélange, l’utilisation d’un ligand fixe peut devenir un moyen simple et rapide d’augmenter le nombre de systèmes discriminants. Ainsi, les systèmes Co/Thr, Mn/Asp et Cu/Ser étant déjà discriminants, et les acides aminés Asn et Gln étant considérés comme fixes pour les métaux précités, l’ensemble des systèmes (Mn, Co, Cu)/(Asn, Gln)/(Asp, Ser, Thr) pourraient devenir 18 systèmes potentiellement discriminants, pouvant idéalement traiter 19 isomères en mélange. Quantification en mélange Mélange binaire L’étape suivante et la finalité réelle du travail concerne la quantification des trois monosaccharides isomères type en mélange par la méthode cinétique. D’après les développements présentés, trois analytes nécessitent deux mesures de ratio dans des conditions différentes, soit deux systèmes métal/référence [36]. Mn/Asp et Cu/Ser ont été sélectionnés pour ces mesures. D’après Cooks et al. et comme présenté précédemment, la méthode cinétique appliquée à la reconnaissance chirale (ou isomérique) est intrinsèquement linéaire, même si certains auteurs [50,51] (dont Cooks [45]) ont pu observer des cas de non linéarité. C’est précisément le cas ici, puisque la mesure des fractions molaires de deux des trois isomères en mélange (par la mesure d’un seul ratio, pour un seul système) par l’application de la relation linéaire (16) a fourni des résultats largement biaisés (des erreurs de plus de 40% par rapport à la fraction réelle ont été relevées). Le tracé du logarithme népérien du ratio mesuré pour le système Cu/Ser en fonction de la fraction molaire d’un des isomères en mélange binaire, linéaire en théorie, est présenté ci-après et illustre bien les non linéarités observées.
  28. 28. Figure 5 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en f d’un des sucres : ( ) D-galactose en mélange avec D ( ) D-galactose en mélange avec D est représenté en ligne pointillée, les droites thé La linéarité de la méthode cinétique étant mise en explicites et implicites de cette méthode. En parti l’indépendance de la formation du cluster trimériqu isomères en mélange [52]. Pour un mélange binaire par exemple, si les analyte identiquement avec le métal et les références pour [M(réf)2(Ai)-H]+ et [M(réf)2(Aj) fractions molaires des analytes en phase liquide quantification juste. Cependant, tout formation des clusters imposerait un biais entre la même analyte impliqué dans le cluster correspondant, c’est gazeuse. Afin de vérifier si un tel phénomène de compétition est à l’origine des biais ionique dans le spectre MS du cluster trimérique associé à un analyte i croissantes a été mesurée en présence d’un isotopiquement avec un 13 C (pour dont les rapports m/z seront alors séparés Quantification en mélange ogarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction galactose en mélange avec D-fructose, ( ) D-fructose en mélange avec D galactose en mélange avec D-glucose. Le « tracé » expérimental à partir des trois points de mesure est représenté en ligne pointillée, les droites théoriquement attendues sont en trait plein La linéarité de la méthode cinétique étant mise en défaut, il est nécessaire de revenir aux hypothèses explicites et implicites de cette méthode. En particulier, un pré-requis l’indépendance de la formation du cluster trimérique associé à un isomère vis Pour un mélange binaire par exemple, si les analyte identiquement avec le métal et les références pour former les clusters trimériques correspondant )-H]+ , l’abondance des clusters en phase gazeuse reflètera ions molaires des analytes en phase liquide et la mesure du ratio en MS/MS fournira une ntification juste. Cependant, tout phénomène de compétition entre les deux isomère formation des clusters imposerait un biais entre la fraction d’un analyte en solution s le cluster correspondant, c’est-à-dire la fraction phénomène de compétition est à l’origine des biais observés du cluster trimérique associé à un analyte i, n présence d’une concentration donnée en C (pour distinguer les deux clusters [M(réf)2(Ai)-H] seront alors séparés d’une unité de masse). Quantification en mélange – mélange binaire 19 onction de la fraction molaire liquide fructose en mélange avec D-glucose, à partir des trois points de mesure s sont en trait plein. défaut, il est nécessaire de revenir aux hypothèses élémentaire concerne é à un isomère vis-à-vis des autres Pour un mélange binaire par exemple, si les analytes Ai et Aj réagissent former les clusters trimériques correspondants l’abondance des clusters en phase gazeuse reflètera les et la mesure du ratio en MS/MS fournira une phénomène de compétition entre les deux isomères pour la action d’un analyte en solution et celle de ce fraction de l’analyte en phase phénomène de compétition est à l’origine des biais observés, l’abondance à trois concentrations e concentration donnée en analyte j marqué H]+ et [M(réf)2(Aj)-H]+
  29. 29. Ces mesures sont réalisées pour une gamme croissant obtenus pour le système Cu/Ser et le le graphe ci-dessous : Figure 6 : Abondance ionique du cluster trimérique [Cu(Ser) D-fructose, pour différentes concentrations en D Un phénomène d’exaltation est clairement mis en évi trimérique du fructose est bien une fonction linéaire de pente de cette droite est une fonction sigmoïdale d alors ici le rôle d’isomère « compétiteur formation/ionisation du cluster trimérique d’ puisque la fraction molaire « réelle gazeuse telle que mesurée par la méthode cinétique. toutefois différente selon le système binaire envis influence pourrait être un changement de structure anomérique d’un isomère, par interac différences de formation/ionisation du cluster trimérique associé. Quantification en mélange Ces mesures sont réalisées pour une gamme croissante de concentration en analyte j. Les résultats pour le système Cu/Ser et le mélange binaire D-fructose/D-glucose (13 cluster trimérique [Cu(Ser)2(fru)-H]+ en fonction de la concentration en fructose, pour différentes concentrations en D-glucose (13 C1) exprimées en mM Un phénomène d’exaltation est clairement mis en évidence ici, puisque si l’abondance du cluster une fonction linéaire de la concentration de ce même fructose, la pente de cette droite est une fonction sigmoïdale de la concentration en D-glucose marqué, qui joue compétiteur ». La présence d’un second isomère impacte bien la formation/ionisation du cluster trimérique d’un isomère donné, influence à l’origine d’un biais réelle » de l’analyte en phase liquide diffère de sa mesurée par la méthode cinétique. La portée de cet effet de compétition est toutefois différente selon le système binaire envisagé. Une description envisageable de cette influence pourrait être un changement de structure principale, ou la modification de l’équilibre par interaction faible entre monosaccharides [5 nisation du cluster trimérique associé. Quantification en mélange – mélange binaire 20 e de concentration en analyte j. Les résultats 13 C1) sont présentés sur en fonction de la concentration en exprimées en mM dence ici, puisque si l’abondance du cluster la concentration de ce même fructose, la glucose marqué, qui joue isomère impacte bien la , influence à l’origine d’un biais diffère de sa fraction en phase a portée de cet effet de compétition est Une description envisageable de cette principale, ou la modification de l’équilibre [53,54], entrainant des
  30. 30. Quantification en mélange – mélange binaire 21 Zhang et al [50] ont proposé l’introduction d’une constante d’équilibre ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ susceptible de caractériser la distribution d’un analyte i dans les phases liquide et gazeuse en présence d’un isomère j: ‫ܣ‬௜ ௟ ௄೔ ೔ǡೕ ሱሮ ‫ܣ‬௜ ௚ (18) Cette constante d’équilibre concerne bien évidemment un analyte donné dans un mélange donné (binaire ici), puisqu’il doit rendre compte des phénomènes d’interactions entre analytes et ne pourra en aucun cas caractériser un analyte de façon universelle. En définissant une constante similaire pour l’analyte j (en présence de l’analyte i), on peut alors définir la fraction molaire en phase gazeuse de l’analyte i en fonction des fractions molaires en phase liquide des analytes i et j, et des constantes d’équilibre définies : ߙ௜ ௚ ൌ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ ȉ ߙ௜ ௟ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝ ȉ ߙ௝ ௟ (19) Ce qui se réécrit, en considérant qu’il s’agit d’un mélange binaire [51] : ߙ௜ ௚ ൌ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝൘ ȉ ߙ௜ ௟ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝൙ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ൫ͳ െ ߙ௜ ௟ ൯ (20) En reprenant l’équation (15), mais en y substituant le terme ߙ, classiquement associé à la fraction molaire en phase liquide dans la méthode cinétique standard, à la fraction molaire en phase gazeuse d’un des analytes, on obtient : ݈݊ሺܴሻ ൌ ߙ௜ ௚ ȉ ݈݊ሺܴ௜ሻ ൅ ൫ͳ െ ߙ௜ ௚ ൯ ȉ ݈݊൫ܴ௝൯ (21) où Ri et Rj sont les ratios des analytes i et j considérés séparément, valeurs expérimentales donc soumises à aucune correction ou modification. En combinant les équations (19) et (20), on écrit le ratio mesuré en mélange R en fonction d’une fraction molaire en phase liquide : ݈݊ሺܴሻ ൌ ቌ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝൘ ȉ ݈݊ሺܴ௜ሻ െ ݈݊൫ܴ௝൯ቍ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ݈݊൫ܴ௝൯ ‫ۉ‬ ‫ۈ‬ ‫ۇ‬‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝൙ െ ͳ ‫ی‬ ‫ۋ‬ ‫ۊ‬ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ͳ (22)
  31. 31. La détermination du rapport monosaccharides étudiés (gal/fru, gal/glc, fru/ celles déjà effectuées. Une régression de la forme fraction molaire liquide) a été appliquée aux points aux mesures du ratio R pour ces même 0, 50 et 100%. Cette régression permet constantes d’équilibre, comme présent validation, correspondant aux fractions molaires 25 et 75% donc de la correction. Ainsi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j p fraction molaire des analytes i ou j obtenant ainsi les fractions en phase gaz retrouvant ainsi les fractions molaires en phas Figure 7 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en f d’un des analytes. ( ) D-galactose en mélange avec D ( ) D-galactose en mélange avec D Le tracé de la régression de la forme (21) Puisque la régression est excellente et appuyée par le calcul des rapports des constantes d’équi une régression trois points. On obtient ainsi Des mesures du ratio R et les calculs des fractions Quantification en mélange rapport dans le cas des mélanges étudiés (gal/fru, gal/glc, fru/glc) ne demande pas de mesures supplémentaires à celles déjà effectuées. Une régression de la forme de l’équation (21) (fonction rationnelle de la appliquée aux points expérimentaux de la Figur aux mesures du ratio R pour ces mêmes mélanges binaires et des fractions molaires en phase liquide . Cette régression permet une corrélation excellente et la détermination du , comme présenté sur la Figure 7 dans le cas du système Cu/Ser fractions molaires 25 et 75%, assurent la validité de la régre insi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j permet de r des analytes i ou j sans biais, soit en considérant la relation linéair obtenant ainsi les fractions en phase gazeuse, soit en considérant la fonction rationnelle (21) retrouvant ainsi les fractions molaires en phase liquide. ogarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire liquide galactose en mélange avec D-fructose, ( ) D-fructose en mélange avec D se en mélange avec D-glucose – points de validation à 25 et 75%. de la forme (21) effectuée sur trois points (0, 50 et 100%) est réalisé Puisque la régression est excellente et appuyée par les points de validation pour le système Cu/Ser, le calcul des rapports des constantes d’équilibre pour le système Mn/Asp a également été On obtient ainsi , Des mesures du ratio R et les calculs des fractions Quantification en mélange – mélange binaire 22 mélanges binaires des trois glc) ne demande pas de mesures supplémentaires à (fonction rationnelle de la igure 4, correspondant binaires et des fractions molaires en phase liquide la détermination du rapport des igure 7 dans le cas du système Cu/Ser. Des points de assurent la validité de la régression et insi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j permet de retrouver la sans biais, soit en considérant la relation linéaire (20) en , soit en considérant la fonction rationnelle (21) en onction de la fraction molaire liquide fructose en mélange avec D-glucose, points de validation à 25 et 75%. est réalisé en trait plein. pour le système Cu/Ser, libre pour le système Mn/Asp a également été réalisé par et Des mesures du ratio R et les calculs des fractions molaires associées
  32. 32. Quantification en mélange – mélange binaire 23 par la relation (21), soit la correction phase liquide/phase gazeuse, sont alors effectués pour les fractions 25 et 75% à partir des rapports des constantes d’équilibre calculés, et comparés aux résultats obtenus avec la méthode linéaire standard. Ces données sont présentées dans le Tableau 4. Tableau 4 : Résultats de quantification des fractions molaires en mélange binaire, par une calibration deux points (standard) et trois points (corrigé) pour les trois monosaccharides étudiés. a écart type, b utilisé comme point de calcul dans la calibration trois points. ˆ”ƒ…–‹‘ ‘Žƒ‹”‡ ‡ ’Šƒ•‡ Ž‹“—‹†‡ Ψ ȋɐȌƒ ±Žƒ‰‡ „‹ƒ‹”‡ Ƚ୪ ”±‡ŽŽ‡ …ƒŽ‹„”ƒ–‹‘ †‡—š ’‘‹–• ȋ±–Š‘†‡ •–ƒ†ƒ”†Ȍ …ƒŽ‹„”ƒ–‹‘ –”‘‹• ’‘‹–• ȋ±–Š‘†‡ …‘””‹‰±‡Ȍ Ǧ‰ƒŽƒ…–‘•‡ Ϊ Ǧ‰Ž—…‘•‡ Ƚ୥ୟ୪ ୪ ͸ͻ ͻͶ ͽͻ ͺ͹Ǥͷ ȋͶǤͻȌ ͼͿǤ; ȋͶǤͼȌ ;ͽǤͿ ȋͶǤͿȌ ͸ͻǤͽ ȋͶǤͽȌ ͻͶǤͶ„ ȋͶǤͻȌ ͽͼǤͷ ȋͷǤͶȌ Ǧ‰ƒŽƒ…–‘•‡ Ϊ Ǧˆ”—…–‘•‡ Ƚ୥ୟ୪ ୪ ͸ͻ ͻͶ ͽͻ ͸ͺǤͽ ȋͶǤ;Ȍ ͺͿǤͺ ȋͶǤͽȌ ͽͺǤ; ȋͶǤͺȌ ͸ͻǤͶ ȋͶǤͻȌ ͻͶǤͶ„ ȋͶǤͺȌ ͽͻǤͶ ȋͶǤͻȌ Ǧˆ”—…–‘•‡ Ϊ Ǧ‰Ž—…‘•‡ Ƚ୤୰୳ ୪ ͸ͻ ͻͶ ͽͻ ͺͷǤ͹ ȋͶǤͺȌ ͼ;ǤͶ ȋͶǤͽȌ ;ͼǤͺ ȋͶǤ;Ȍ ͸ͺǤͺ ȋͶǤͼȌ ͻͶǤͶ„ ȋͶǤͼȌ ͽͻǤͻ ȋͷǤͷȌ Une calibration trois points, qui permet d’obtenir le rapport des constantes d’équilibre régissant l’équilibre phase liquide/phase gazeuse, permet également de bien corriger la non linéarité observée précédemment en fournissant des valeurs de fractions molaires en phase liquide en bon accord avec les fractions réelles, pour les deux systèmes métal/référence engagés. A noter que le système Mn/Asp pour le mélange binaire gal/fru fournit de bons résultats pour une calibration deux points, tendance reflétée par la valeur du rapport des constantes d’équilibre, ‫ܭ‬௚௔௟ ௚௔௟ǡ௙௥௨ ‫ܭ‬௙௥௨ ௚௔௟ǡ௙௥௨ ൗ ൌ ͳǡͲͳ. Les deux isomères se comportent dans ce cas d’une façon très similaire avec le métal et la référence, impliquant des phénomènes de compétition limités. A noter enfin que cette valeur diffère tout à fait du rapport des constantes d’équilibres obtenu avec le système Cu/Ser pour le même mélange binaire (‫ܭ‬௚௔௟ ௚௔௟ǡ௙௥௨ ‫ܭ‬௙௥௨ ௚௔௟ǡ௙௥௨ ൗ ൌ ʹǡͷͳ), ce qui montre que la constante d’équilibre phase liquide/phase gazeuse d’un analyte dépend également du système discriminant métal/référence utilisé.
  33. 33. Quantification en mélange – mélange binaire 24 La méthode peut alors être appliquée à tout système discriminant pour une quantification en mélange binaire, en remplaçant la calibration deux points [18] de la méthode standard (0 et 100%) par une calibration trois points (0, 50 et 100% par exemple) [50]. Mélange ternaire L’extension du raisonnement précédent à un mélange ternaire i/j/k est évidente, et l’obtention de la relation entre logarithme népérien du ratio et fractions molaires en phase liquide immédiate : ݈݊ሺܴሻ ൌ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ǡ௞ ȉ ݈݊ሺܴ௜ሻ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝ǡ௞ ȉ ݈݊൫ܴ௝൯ ȉ ߙ௝ ௟ ൅ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௝ǡ௞ ȉ ݈݊ሺܴ௞ሻ ȉ ߙ௞ ௟ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ǡ௞ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝ǡ௞ ȉ ߙ௝ ௟ ൅ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௝ǡ௞ ȉ ߙ௞ ௟ (23) que l’on réécrit, avec l’hypothèse explicite d’un mélange ternaire : ݈݊ሺܴሻ ൌ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௝ǡ௞൘ ȉ ݈݊ሺܴ௜ሻ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௝ǡ௞൙ ȉ ݈݊൫ܴ௝൯ ȉ ߙ௝ ௟ ൅ ݈݊ሺܴ௞ሻ ȉ ൫ͳ െ ߙ௝ ௟ െ ߙ௜ ௟ ൯ ቌ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௝ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௝ǡ௞൘ െ ͳቍ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ‫ۉ‬ ‫ۈ‬ ‫ۇ‬‫ܭ‬௝ ௜ǡ௝ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௝ǡ௞൙ െ ͳ ‫ی‬ ‫ۋ‬ ‫ۊ‬ ȉ ߙ௝ ௟ ൅ ͳ (24) d’où la nécessité de deux mesures de ratios R sous deux conditions différentes (soit deux systèmes métal/référence discriminants) afin d’expliciter les deux fractions molaires inconnues et d’en déduire la troisième. Si l’impact de la présence d’un isomère j sur la formation/ionisation du cluster d’un isomère i est avéré, il peut sembler raisonnable, dans une première approximation, de négliger l’influence d’un troisième isomère k sur cette compétition. Schématiquement cela revient à considérer, en termes d’interactions entre isomères tout du moins, un mélange ternaire i/j/k comme une combinaison de trois mélanges binaires i/j, j/k et i/k. Mathématiquement, cela se traduit par l’équation suivante : ݈݊ሺܴሻ ൌ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௞൘ ȉ ݈݊ሺܴ௜ሻ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ‫ܭ‬௝ ௝ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௝ǡ௞൘ ȉ ݈݊൫ܴ௝൯ ȉ ߙ௝ ௟ ൅ ݈݊ሺܴ௞ሻ ȉ ൫ͳ െ ߙ௝ ௟ െ ߙ௜ ௟ ൯ ൭ ‫ܭ‬௜ ௜ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௜ǡ௞൘ െ ͳ൱ ȉ ߙ௜ ௟ ൅ ൮ ‫ܭ‬௝ ௝ǡ௞ ‫ܭ‬௞ ௝ǡ௞൘ െ ͳ൲ ȉ ߙ௝ ௟ ൅ ͳ (25)
  34. 34. Quantification en mélange – mélange ternaire 25 Naturellement, et puisque les constantes d’équilibres sont attribuées pour un système métal/référence et un mélange binaire donnés, la mesure d’un seul ratio R conduit à l’obtention de trois valeurs possibles pour chaque fraction molaire, selon l’attribution de l’isomère k (le « compétiteur ») au fructose, glucose ou galactose. Le Tableau 5 résume les résultats obtenus pour trois mélanges ternaires gal/glc/fru distincts : Tableau 5 : Résultats de quantification pour trois mélanges ternaires, par la méthode cinétique corrigée. ˆ”ƒ…–‹‘ ‘Žƒ‹”‡ ‡ ’Šƒ•‡ Ž‹“—‹†‡ Ψ ȋɐȌƒ ”±‡ŽŽ‡ ˜ƒŽ‡—”• …ƒŽ…—Ž±‡• ‘›‡‡ ƒ”‹–Š±–‹“—‡  α ˆ”—  α ‰Ž…  α ‰ƒŽ ‰ƒŽ
  35. 35. ‰Ž… ˆ”— ͹͹ ͹͹ ͹͹ ͹ͻǡ͸ ͹͸ǡͶ ͹͸ǡ; ͹ͷǡ; ͹͹ǡͼ ͹ͺǡͼ ͹͸ǡͽ ͹ͼǡͷ ͹ͷǡ͸ ͹͹Ǥ͸ ȋͶǤͻȌ ͹ͺǤͶ ȋͷǤͶȌ ͹͸Ǥ; ȋͶǤͿȌ ‰ƒŽ
  36. 36. ‰Ž… ˆ”— ͻͶ ͹ͻ ͷͻ ͻͶǡͼ ͹ͻǡͼ ͷ͹ǡͼ ͻͷǡͺ ͹͹ǡͷ ͷͻǡͻ ͺͼǡ͸ ͹ͿǡͶ ͷͺǡͿ ͺͿǤͺ ȋͶǤͼȌ ͹ͻǤͿ ȋͶǤͿȌ ͷͺǤͽ ȋͷǤͷȌ ‰ƒŽ
  37. 37. ‰Ž… ˆ”— ͹ͻ ͷͻ ͻͶ ͹͹ǡ; ͷͺǡ͸ ͻ͸ǡͶ ͹ͺǡ͸ ͷ͹ǡͺ ͻ͸ǡͺ ͹ͺǡ; ͷͿǡͽ ͺͻǡͻ ͹ͺǤ͹ ȋͶǤͻȌ ͷͻǤ; ȋͷǤͷȌ ͺͿǤͿ ȋͷǤ͸Ȍ a écart type On observe que les trois valeurs possibles pour chaque fraction molaire sont, sans être aberrantes, parfois éloignées de la valeur réelle. Il n’existe pas cependant de tendance simple reliant la justesse des résultats à l’identification de l’isomère k (le « compétiteur ») dans la formule (24) au fructose, glucose ou galactose. L’identification de l’isomère k au fructose apporte les fractions les plus justes pour le glucose et le galactose dans le mélange II, pour le fructose et le glucose dans le mélange III, ce qui rompt la tendance possible observée dans le mélange I, où la fraction la plus juste pour un isomère est obtenue lorsque cet isomère est l’isomère k. C’est par contre la moyenne arithmétique de ces trois valeurs qui constitue une bonne approximation de la fraction en phase liquide comme l’attestent les valeurs présentées dans le tableau 5. Cette opération mathématique correspond en fait à l’approximation i/j/k ~ i/j + i/k + j/k, qui est de ce fait sinon vérifiée au moins validée. Tous ces résultats sont également présentés dans Distinction and quantitation of sugar isomers in ternary mixtures using the kinetic method, article soumis au Journal of the American Society for Mass Spectrometry, ainsi que dans Distinction isomérique et quantification de monosaccharides par la méthode cinétique, poster présenté au SMAP 2009 (Spectrométrie de Masse et Analyse Protéomique), à Dijon du 14 au 18 septembre 2009.
  38. 38. 26 Conclusion La méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique a été utilisée avec succès pour la discrimination et la quantification de trois monosaccharides en mélanges binaire et ternaire, par l’utilisation de cations métalliques divalents comme atome central et d’acides aminés pour référence. La recherche de systèmes discriminants, largement empirique et par conséquent systématique, fournit comme meilleurs systèmes des couples métal/référence dont ladite référence présente effectivement une analogie structurale avec l’analyte (une fonction hydroxyle pour la sérine et un groupement carboxyle pour l’acide aspartique). L’hypothèse sous-jacente première de la méthode cinétique, i.e. la formation semblable du cluster trimérique pour chaque analyte indépendamment des autres analytes, n’est pas respectée ici puisque des phénomènes de compétition sont mis en évidence. Néanmoins la quantification des isomères en mélange peut tout de même être assurée par une correction à la loi linéaire de la méthode cinétique standard, en considérant que la fraction de l’analyte impliqué dans le cluster trimérique (c’est-à-dire en phase gazeuse) n’est pas strictement égale à sa fraction molaire en solution, mais qu’il existe un équilibre entre ces deux états. On ne peut cependant pas exclure d’autres phénomènes susceptibles d’entrainer une non-linéarité, en particulier la présence de complexes isobares de composition différente [55] et les phénomènes entropiques ignorés ici, consciemment et à tort puisque analytes et références ne sont pas identiques structuralement et que des interactions intramoléculaires existent. La signification physique des coefficients correcteurs, décrits comme les rapports des constantes d’équilibre entre phase liquide et phase gazeuse, est donc sans aucun doute plus complexe. L’utilisation de la variation en ligand fixe de la méthode cinétique permettra de multiplier les systèmes discriminants tout en limitant les changements de métal ou de référence, autorisant ainsi une augmentation rapide de la capacité de quantification simultanée (N-1 systèmes pour N isomères en mélange) et une limitation du nombre de manipulations associées. Les démarches préliminaires concerneront alors la mesure du ratio de chaque analyte seul pour chaque système, et les 2 parmi N calibrations trois points des mélanges binaires pour obtenir les coefficients correcteurs associés. La moyenne arithmétique des N fractions molaires obtenues devrait fournir une bonne évaluation de la fraction molaire en phase liquide réelle de chaque isomère. Enfin, l’étude de la fragmentation du complexe dimérique [M(réf)(A)-H]+ (déjà explorée pour la distinction isomérique de peptides [56]) peut constituer une source supplémentaire de systèmes et fournir des avantages similaires à ceux apportés par le ligand fixe.
  39. 39. 27 Références bibliographiques [1] Oppenheimer, S. B. Cancer: A biological and clinical introduction ; Pearson: Boston, 2004. [2] Oppenheimer, S. B. Cellular basis of cancer metastasis: A review of fundamentals and new advances. Acta Histochem. 2006, 108, 327-334. [3] Lindhorst, T. K. Essentials of Carbohydrate Chemistry and Biochemistry ; Wiley-VCH, Third edition, 2007. [4] Gyurcsik, B. ; Nagy, L. Carbohydrates as ligands : coordination equilibria and structure of the metal complexes. Coord. Chem. Rev. 2000, 203, 81–149. [5] Masuda, T. ; Kitahara, K. ; Aikawa, Y. ; Arai, S. High-performance liquid chromatographic separation of carbohydrates on a stationary phase prepared from polystyrene-based resin and novel amines. J. Chromatogr. A. 2002, 961, 89-96. [6] Agblevor, F. A.; Hames, B. R.; Schell, D.; Chum, H. L. Analysis of biomass sugars using a novel HPLC method. Applied Biochem. Biotechnol. 2007, 136, 309-326. [7] Menges, R. A.; Armstrong, D. W. In Chiral separations by liquid chromatography. Ahuja, S., Ed.; American Chemical Society: Washington, D. C., 1991; Vol. 471, pp 67-100. [8] Salpin, J.-Y. ; Tortajada, J. Structural characterization of hexoses and pentoses using lead cationization : an electrospray ionization and tandem mass spectrometric study. J. Mass Spectrom. 2002, 37, 379-388. [9] Carlesso, V. ; Fournier, F. ; Tabet, J.-C. Stereochemical differentiation of four monosaccharides using transition metal complexes by electrospray ionization/ion-trap mass spectrometry. Eur. J. Mass Spectrom. 2000, 6, 421-428. [10] Madhusudanan K. P. Tandem mass spectra of ammonium adducts of monosaccharides : differentiation of diastereosiomers. J. Mass Spectrom. 2006, 41, 1096-1104. [11] Giorgi, G. ; Speranza, M. Stereoselective noncovalent interactions of monosaccharides with hydrazine, Int. J. Mass Spectrom. 2006, 249–250, 112–119. [12] Madhusudanan, K. P. ; Kanojiya, S. ; Kumar, B. Effect of stereochemistry on the electrospray ionization tandem mass spectra of transition metal chloride complexes of monosaccharides. J. Mass Spectrom. 2005, 40, 1044–1054. [13] Behr, J. R. ; Matsumoto, Y. ; White, F. M. ; Sasisekharan, R. Quantification of isomers from a mixture of twelve heparin and heparan sulfate disaccharides using tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2553–2562. [14] Bagheri, H. ; Chen, H. ; Cooks, R. G. Chiral recognition by proton transfer reactions with optically active amines and alcohols. Chem. Commun. 2004, 2740-2741.
  40. 40. Références bibliographiques 28 [15] Cooks, R. G. ; Kruger, T. L. Intrinsic basicity determination using metastable ions. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 1279. [16] Shen, W. ; Wong, P. S. H. ; Cooks, R. G. Stereoisomeric Distinction By the Kinetic Method : 2,3-Butanediol. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 71–74. [17] Zhang, D. X.; Tao, W. A.; Cooks, R. G. Chiral resolution of D- and L-amino acids by tandem mass spectrometry of Ni(II)-bound trimeric complexes. Int. J. Mass Spectrom. 2001, 204, 159-169. [18] Augusti, D. V.; Carazza, F.; Augusti, R.; Tao, W. A.; Cooks, R. G. Quantitative chiral analysis of sugars by electrospray ionization tandem mass spectrometry using modified amino acids as chiral reference compounds. Anal. Chem. 2002, 74, 3458-3462. [19] Tao, W.A. ; Wu, L. ; Cooks, R. G. Rapid Enantiomeric Quantification of an Antiviral Nucleoside Agent (D,L-FMAU,2¢-Fluoro-5-methyl-alpha,D,L-arabinofuranosyluracil) by Mass Spectrometry. J. Med. Chem. 2001, 44, 3541-3544. [20] Wu, L. M.; Lemr, K.; Aggerholm, T.; Cooks, R. G. Recognition and quantification of binary and ternary mixtures of isomeric peptides by the kinetic method: Metal ion and ligand effects on the dissociation of metal-bound complexes. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003, 14, 152-160. [21] Cooks, R. G. ; Wong, P. S. H. Kinetic method of making thermochemical determinations : Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 1998, 31, 379-386. [22] Ervin, K. M. Microcanonical analysis of the kinetic method. The meaning of the “effective temperature”. Int. J. Mass Spectrom. 2000, 195/196, 271-284. [23] Drahos, L. ; Vékey, K. How closely related are the effective and the real temperature ? J. Mass Spectrom. 1999, 34, 79-84. [24] Laskin, J. ; Furtrell, J. H. The theoretical basis of the kinetic method from the point of view of finite heat bath theory. J. Phys. Chem. A. 2000, 104, 8829-8837. [25] Armentrout, P. B. Is the kinetic method a thermodynamic method ? J. Mass Spectrom. 1999, 34, 74-78. [26] Cooks, R.G. ; Koskinen J. T. ; Thomas P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 1999, 34, 85-92. [27] Armentrout, P. B. Entropy measurements and the kinetic method : a statistically meaningful approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000, 11, 371-379. [28] Zheng, X. ; Cooks, R.G. Thermochemical determinations by the kinetic method with direct entropy correction. J. Phys. Chem. A. 2002, 106, 9939-9946. [29] Hahn, I.-S. ; Wesdemiotis, C. Protonation thermochemistry of L-alanine : An evaluation of proton affinities and entropies determined by the extended kinetic method. Int. J. Mass Spectrom. 2003, 222, 465–479. [30] Williams, T. I. ; Denault, J. W. ; Cooks, R. G. Proton affinity of deuterated acetonitrile estimated by the kinetic method with full entropy analysis International. J. Mass Spectrom. 2001, 210/211, 133–146.
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  42. 42. Références bibliographiques 30 [46] Su, Z ; Cocinero E. J. ; Stanca-Kaposta E. C. ; Davis B. G. ; Simons J. P. Carbohydrate- aromatic interaction : a computational and IR spectroscopic investigation of the complex methyl-Į- L-fucopyranoside/toluene isolated in the gas-phase. Chem. Phys. Lett. 2009, 471, 17-21. [47] Vandenbussche S. ; Diaz D. ; Fernandez-Alonso M. C. ; Pan W. ; Vincent S. P. ; Cuevas G. ; Canada F. J. ; Jimenez-Barbero J. ; Bartik K. Aromatic-carbohydrate interactions : an NMR and computational study of model systems. Chem. Eur. J. 2008, 14, 7570 – 7578. [48] Wu, L. ; Cooks, R. G. Chiral and isomeric analysis by electrospray ionization and sonic spray ionisation using the fixed-ligand kinetic method. Eur. J. Mass Spectrom. 2005, 11, 231-242. [49] Wu, L. ; Cooks, R. G. Chiral analysis using the kinetic method with optimized fixed ligands : applications to some antibiotics. Anal. Chem. 2003, 75, 678-684. [50] Zhang, M. Y.; Kerns, E.; McConnell, O. Observation of enantiomeric formation of trimeric complex ions [CuII(Phe)(Pro)2-H]+ using ESI. In Proceedings of the 51st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Montreal, Quebec, Canada, June 8-12 2003. [51] Lemr, K.; Ranc, V.; Frycak, P.; Bednar, P.; Sevcik, J. Chiral analysis by mass spectrometry using the kinetic method in flow systems. J. Mass Spectrom. 2006, 41, 499-506. [52] Wu, L. M.; Tao, W. A.; Cooks, R. G. Kinetic method for the simultaneous chiral analysis of different amino acids in mixtures. J. Mass Spectrom. 2003, 38, 386-393. [53] Patel T. R. ; Harding S. E. ; Ebringerova A. ; Deszczynski M. ; Hromadkova Z. ; Togola A. ; Paulsen B. S. ; Morris G. A. ; Rowe A. J. Weak Self-association in a carbohydrate system. Biophys. J. 2007, 93, 741-749. [54] Carcabal P. ; Jockusch R. A. ; Hunig I. ; Snoek L. C ; Kroemer R. T. ; Davis B. G. ; Gamblin D. P. ; Compagnon I. ; Oomens J. ; Simons J. P. Hydrogen Bonding and cooperativity in isolated and hydrated sugars : mannose, galactose, glucose and lactose. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 11414 – 11425. [55] Ranc, V. ; Havlicek, V. ; Bednar, P. ; Lemr, K. Magnesium interference and different efficiencies of diastereoisomeric cluster formation in phenylalanine enantiomeric discrimination by the kinetic method. Int. J. Mass Spectrom. 2009, 280, 213-217. [56] Wu L. ; Meurer E. C. ; Young B. ; Yang P. ; Eberlin M. N. ; Cooks R. G. Isomeric differentiation and quantification of alpha, beta-amino acid-containing tripeptides by the kinetic method : alkali metal-bound dimeric cluster ions. Int. J. Mass Spectrom. 2004, 231, 103–111.
  43. 43. Conditions expérimentales Produits et solvants utilisés : Tous les produits ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO) et utilisés sans étape de purification. Sucres : L/D-glucose ; L/D-fructose ; L/D-galactose ; D-glucose (13 C1) ; D-fructose (13 C1) Acides aminés L/D-Arginine ; L/D-Asparagine ; Acide L/D aspartique ; Acide L/D glutamique ; L/D-Glutamine ; L/D-Phénylalanine ; L/D-Serine ; L/D-Thréonine ; L/D-Tyrosine. Sels métalliques : Ca(NO3)2 ; MnCl2 ; FeSO4 ; Co(CH3COO)2 ; ZnCl2 ; CuSO4 Solvants : Méthanol grade HPLC (Sigma-Aldrich) Eau grade HPLC (SDS, Peypin, France) Les solutions ionisées par electrospray contiennent le métal de transition (1.10-4 M), la référence (2.10-4 M) et le sucre (2.10-4 M), et sont préparées d’après le protocole ci-après.
  44. 44. Préparation des solutions de travail : Les solutions sont préparées en utilisant les proportions proposées par Augusti et al. [18] solution mère 1ère dilution V = 5 ml de MeOH C = 3e-4 M V = 5 ml de H2O C = 6e-4 M V = 2,7 ml de MeOH + 2,15 ml de H2O C = 6e-4 M x µl x µl x µlsolution de travail V = 3 x µl Cmétal = 1e-4 M Créf = 2e-4 M Csucre = 2e-4 M Sel ( MnCl2, CoAc2, ...) V = 5 ml de H2O C = 1e-2 M Référence (acide aminé) V = 5 ml de H2O C = 1e-2 M Sucre V = 5 ml de H2O C = 2e-2 M 150 µl 300 µl 150 µl Analyse par spectrométrie de masse : Toutes les analyses et mesures ont été réalisées sur un spectromètre de masse hybride QTrap 3200 (Applied Biosystems SCIEX) équipé d’une source d’ionisation electrospray utilisée en mode positif. Ce spectromètre de masse est équipé de deux analyseurs quadripolaires en tandem (Q1 et Q3) et d’une cellule de collision intermédiaire. (ci-joint : vue du spectromètre de masse Qtrap 3200 [Applied Biosystems]) Le quadripôle Q3 peut être, moyennant l’application de tensions d’entrée et de sortie spécifiques, transformé en trappe ionique. Les ions précurseurs sont sélectionnés dans le premier quadripôle, et sont fragmentés dans la cellule par collision avec un gaz inerte, le diazote dans ce cas. Différentes énergies de collision (CE) et pressions de gaz dans la cellule de collision peuvent être définies, fournissant des modes de collision variés pour les ions précurseurs. Les ions fragments sont ensuite analysés par le quadripôle Q3 (mode MS/MS en triple quadripôle). D’autres modes (non utilisés dans cette étude) peuvent être appliqués, notamment en effectuant les fragmentations au sein de la trappe ionique (mode MS/MS Trap).
  45. 45. Schéma de fonctionnement du spectromètre de masse Qtrap 3200 [brochure 3200 Q TRAP system, Applied Biosystems] Différents paramètres peuvent être réglés lors de l’analyse, et dans ce cas précis, sont constants pour toutes les mesures réalisées. En particulier, la tension electrospray (Capillarity voltage) est réglée à 5500 V, la tension de cône (DP : Declustering Potential) à 20 V. Le gaz de nébulisation est de l’air introduit à une pression de 10 psi (0,69 bar), le diazote est utilisé comme gaz rideau (séparation entre la source d’ionisation à pression atmosphérique et le spectromètre sous vide) et comme gaz de collision dans la cellule de collision, à une pression de 10 psi (0,69 bar). L’énergie de collision appliquée aux ions précurseurs est de 5 eV (référentiel du laboratoire), qui est la valeur minimale autorisée par l’instrument. La pression du gaz de collision dans la cellule est également réglée à son minimum. Enfin, la solution de travail ionisée par electrospray est injectée dans la source d’ionisation par une pompe pousse-seringue à un débit de 5 µl.min-1 . Le contrôle de tous ces paramètres et de l’instrument, l’acquisition et le traitement des données sont réalisés avec le logiciel Analyst (1.4.1) fourni par Applied Biosystems. Le principe de toutes les analyses réalisées pour étudier un système métal/référence est le même : ƒ La solution contenant le métal, la référence et un sucre est ionisée par electrospray ; ƒ Un premier spectre MS (analyse des ions produits par la source d’ionisation) valide ou non la formation du cluster trimérique. Le cas échéant, les réglages de la hauteur du capillaire dans la source d’ionisation et de la hauteur de la source elle-même peuvent être effectués pour améliorer le signal attendu. ƒ La fragmentation du cluster trimérique est réalisée en mode MS/MS triple quadripôle. Si le spectre MS/MS répond aux impératifs de la méthode cinétique (pas de fragmentation secondaire, deux voies de dissociation compétitives observées), la mesure du ratio R est effectuée à 5 reprises par accumulation de 50 scans. Pour les systèmes discriminants retenus pour la quantification en mélange (Cu/Ser et Mn/Asp), trois solutions différentes ont été préparées et analysées à des dates différentes. ƒ Le spectromètre est rincé avec une solution aqueuse de méthanol (50:50) puis de méthanol pendant une durée jugée suffisante.
  46. 46. / Annexes Liste des abréviations utilisées ....................................................................................I Article soumis.............................................................................................................. II Poster présenté au SMAP 2009.............................................................................XIV Liste des abréviations utilisées fru : D-fructose glc : D-glucose gal : D-galactose ESI : ionisation electrospray CID : dissociation induite par collision M : métal divalent C : ion central Réf : molécule de référence A : analyte (Ai : analyte i ) i/j : mélange binaire des analytes i et j i/j/k : mélange ternaire des analytes i, j et k Į : fraction molaire (ߙ௟ : en phase liquide / ߙ௚ : en phase gaz) - réf : perte d’une molécule de référence / - sucre : perte d’un isomère de monosaccharide 13 C1 : marquage isotopique du carbone 1 d’un monosaccharide (d’après la nomenclature IUPAC*) [*: McNaught, A. D. Nomenclature of Carbohydrates. Carbohydrate Research. 1997, 297, 1-90.]
  47. 47. // Articlesoumis(encoursd’acceptation) ;:ŽƵƌŶĂůŽĨdŚĞŵĞƌŝĐĂŶ^ŽĐŝĞƚLJĨŽƌDĂƐƐ^ƉĞĐƚƌŽŵĞƚƌLJͿ
  48. 48. ///
  49. 49. /s
  50. 50. s
  51. 51. s/
  52. 52. s//
  53. 53. s///
  54. 54. /y
  55. 55. y
  56. 56. y/
  57. 57. y//
  58. 58. y///
  59. 59. y/s Poster présenté au SMAP 2009
  60. 60. Résumé L'analyse isomérique quantitative de trois monosaccharides (D-fructose, D-galactose, D- glucose), basée sur la dissociation de complexes trimériques simplement chargés formés par electrospray, a été réalisée selon la méthode cinétique. Divers acides aminés L et cations métalliques divalents ont été testés afin de choisir les meilleurs systèmes pour la distinction isomérique et la quantification en mélange. Une forte discrimination est observée pour de nombreux systèmes, dont le couple serine/Cu2+ et acide aspartique/Mn2+ , qui a été sélectionné pour l'analyse quantitative. Des effets de compétition pour la formation/ionisation des complexes ont été mis en évidence, mais une correction par des calibrations trois points assure la justesse et la répétabilité de la quantification en mélange binaire et ternaire. Abstract Quantitative isomeric analysis of D-fructose, D-galactose and D-glucose was achieved using collision-induced dissociation of electrosprayed trimeric ions with data analysis by the kinetic method. Several L-amino acids and divalent metal cations were tested to select the best systems for isomeric distinction and quantitation of each monosaccharide. Very high distinction could be achieved for most tested systems amongst which serine/Cu2+ and aspartic acid/Mn2+ were selected for quantitative analysis. Accurate quantitative results were obtained for each analyte in binary and ternary mixtures using three-point corrected calibration curves, which account for the competition effects evidenced to occur between sugars for the formation of the trimeric complexes.

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