2. I parassiti
Le infezioni parassitarie sono causate da un gran numero di organismi la
cui trasmissione può richiedere la presenza di un insetto vettore o un
ospite intermedio.
La maggior parte causano malattie croniche e debilitanti altre presentano
forme acute e letali che sono diffuse in tutto il mondo.
Molte parassitosi croniche possono causare un malattia solo in un numero
limitato di individui. I parassiti non sono solo importanti in quanto causano
malattie gravi e letali ma essendo basate sull’interazione fra l'organismo
patogeno e l’uomo e con ospiti intermedi o insetti vettori, la loro biologia è
estremamente complessa e presenta notevoli difficoltà per poter
identificare target specifici per lo sviluppo di molecole antiparassitarie.
I parassiti hanno sviluppato, nel corso della loro co-evoluzione con gli
animali che infettano, diverse strategie che hanno permesso loro di entrare
in contatto con particolari microambienti presenti in un ospite.
Tutti i parassiti, come altri organismi patogeni, si sono evoluti da forme che
vivevano libere nell’ambiente.
2
4. Diverse forme di parassitismo
I parassiti hanno sviluppato diverse vie che sono facilitate da condizioni igieniche
precarie tramite le quali penetrano in un individuo utilizzando uno stato larvale o
uova che possono essere ingerite con cibi contaminati o accidentalmente.
Altri tipi di larve sono in grado di perforare la cute o di infettare il feto passando
attraverso la placenta. In altri casi, un insetto vettore punge la cute o rilascia con le
feci in una ferita o nelle mucose una forma infettiva di un parassita.
Altri parassiti sono in grado di passare da un individuo a un altro tramite rapporti
sessuali. Una volta compiuto il proprio ciclo vitale all’interno di un individuo, un
parassita rilascia le proprie uova o larve nelle feci o nell’urina e lascia il corpo
dell’individuo infetto.
4
5. Diverse forme di parassitismo
Le parassitosi sono malattie prevalentemente presenti nei paesi tropicali e in via di
sviluppo, anche se sempre più frequentemente vengono identificati nei paesi
sviluppati, anche a causa di viaggi in paesi tropicali o dove una certa malattia è
endemica. Le parassitosi sono malattie estremamente frequenti di tipo cronico ma
meno fatali delle infezioni dovute a virus o a batteri che possono essere acute e
letali.
I parassiti sono organismi molto più complessi rispetto ad altri patogeni come i
batteri o i funghi in quanto hanno cicli vitali molto elaborati (che comprendono
diverse forme distinte in un singolo o più ospiti) basati su tropismi di specie e di
tessuto nell’ospite, nei vettori e nell'ambiente esterno.
Tali forme sono morfologicamente distinte e sono il risultato di una complessa
regolazione dell'espressione genica che permette loro di adattarsi non solo
biochimicamente (come i batteri) ma anche di occupare diversi tessuti dell’ospite
e del vettore e di migrare da un distretto a un altro del corpo umano (o di animali).
Questa sofisticata abilità a cambiare di forma a seconda dello stadio vitale fa sì
che anche la risposta immunitaria da parte dell’ospite sia fortemente ostacolata.
5
6. Parassiti
Fotografia al microscopio elettronico a scansione di
Giardia intestinalis adesa all ’ epitelio intestinale Ascaris lumbricoides di circa 20 cm.Le
mediante un disco adesivo di cui e`provvista. femmine raggiungono dimensioni di 35
cm.
7. Le malattie parassitarie
I parassiti hanno infettato l’uomo da millenni ed è stata dimostrata la loro presenza negli scheletri di
individui vissuti nel passato. Per esempio, nell’intestino del corpo mummificato di Ötzi, “l’uomo venuto dal
ghiaccio” vissuto circa 3.200 anni fa il cui corpo fu trovato sulle Alpi italiane nel 1991, sono state identificate
le uova del parassita Trichuria trichiura. Inoltre, antichi papiri egizi e gli scritti del medico greco Ippocrito
descrivono le infezioni malariche che sono causate dal Plasmodium.
L’analisi molecolare della regolazione dell’espressione genica dei parassiti ha già permesso di scoprire
meccanismi fondamentali prima sconosciuti nelle cellule eucariotiche. Per esempio, nei tripanosomi sono
stati identificati il meccanismo della variazione antigenica e il processo di trans-splicing di mRNA codificati
da geni diversi e poi riuniti per produrre un mRNA maturo.Inoltre, nei parassiti sono stati identificati organelli
come gli apicoplasti che non sono presenti in altri organismi e che permettono loro di sopravvivere in
particolari ambienti dell’ospite.
Gli apicoplasti organelli di 0,15 - 1,5 μm di diametro che contengono un DNA circolare di circa 35 kb
circondato da 4 membrane. I geni degli apicoplasti derivano dai geni di plastidi di alghe e quindi questi
organelli si sono formati molto probabilmente per endosimbiosi.
Tali organelli, situati in prossimità del nucleo, sono fondamentali per la sopravvivenza del parassita. Benché
non siano ancora chiare quali siano le funzioni di tale organello, la sua presenza è indispensabile. Infatti, se
l'apicoplasto viene eliminato tramite plasmid curing (eliminazione di un plasmide tramite trattamento con
giallo di acridina) il parassita muore, anche se non immediatamente. Il parassita infatti muore solo dopo
aver invaso un nuovo individuo in quanto non è in grado di infettarlo, il che suggerisce che l’apicoplasto
codifica per funzioni essenziali per l’invasione dell’ospite.
Poiché l’apicoplasto codifica per vie metaboliche, quali quelle per alcuni acidi grassi, radicalmente diverse
da quelle codificate dal DNA nucleare, esso presenta caratteristiche fondamentali per lo sviluppo di farmaci
antimalarici specifici.
Inoltre, poiché l'apicoplasto si è originato dai plastidi codifica per proteine coinvolte nella replicazione7 del
proprio DNA, per la trascrizione di geni apicoplasto-specifici e per la traduzione di mRNA che sono di
9. Idrogenosomi - acidocalcisomi
Membri del genere della Trichomonas (protisti flagellati anaerobi) contengono un
altro organello chiamato idrogenosoma che non contiene DNA, citocromi o
enzimi del ciclo dell’acido citrico e produce ATP utilizzando piruvato con enzimi
tipici dei batteri anaerobi.
Invece, nei tripanosomi, in Toxoplasma e nei plasmodi sono presenti gli
acidocalcisomi, organelli di circa 100 - 200 nm coinvolti nell’omeostasi del Ca+2.
Questi organelli posseggono pompe proteiche responsabili del trasporto attivo di
molecole e di antiporti (trasportatori secondari, Ca2+/H+ e Na+/H+).
9
11. Plasmodium
La malaria è la più importante malattia parassitaria causata da protozoi.
I plasmodi sono gli agenti della malaria, una delle malattie parassitarie più
diffuse causando 200 - 300 milioni di nuovi casi al mondo ogni anno.
Questa malattia è presente nelle regioni tropicali e sub-tropicali di tutti i
continenti in particolare in Africa.
La malaria si trasmette tramite la puntura di una zanzara del genere Anopheles
portatrice del parassita.
I plasmodi sono sporozoi che infettano i globuli rossi del sangue e richiedono
due ospiti per il loro ciclo vitale,
la zanzara in cui avviene lo stadio sessuale dell’organismo, e
l’uomo (o altri primati) pin cui avviene il ciclo asessuato.
12. La malaria
La malaria, il cui termine deriva da mal’aria, aria cattiva, infetta, viene trasmessa da una zanzara tra i
9 e 17 giorni dopo che ha ingerito il sangue da un individuo che aveva nel sangue i plasmodi, e che a
sua volta sviluppa la malattia tra gli 8 e i 30 giorni dopo la puntura.
Molti casi di malaria avvengono anche in paesi dove non è presente l’infezione, sia perché la
contraggono durante viaggi in aree endemiche sia perché zanzare che contengono il plasmodio
possono raggiungere paesi distanti entrando in un aereo che le trasporta a distanza e quindi infetta
individui generalmente nell’ambito dell’aeroporto di destinazione (airport malaria). La malaria può
essere contratta anche tramite trasfusioni di sangue infetto o tra utilizzatori di droghe per via
endovenosa.
I plasmodi risiedono prevalentemente nel sangue e
nel fegato, ma infettano anche la milza e altri organi
(per esempio i reni) dell’uomo.
Generalmente, a un periodo di febbri segue una
fase di remissione che dura da alcune settimane a
diversi mesi, a cui fa seguito un nuovo attacco
malarico. Le crisi parossistiche (febbri alte, brividi e
sudorazione) tipiche della malaria sono coincidenti
con la liberazione dei merozoiti nel circolo ematico a
seguito della lisi simultanea dei globuli rossi infettati.
Nei periodi tra una crisi e la successiva le condizioni
del paziente sono normali. Con il protrarsi della
malattia, la malaria può causare anemia e spleno-
Anopheles gambiae ed epatomegalia.
13. La malaria
La malaria può essere trasmessa da diverse specie del genere Anopheles che differiscono nel
comportamento e nelle proprietà fisiologiche (ma è sempre la femmina che trasmette l’infezione, mentre
il maschio non si nutre di sangue ma di polline di fiori). Questa diversità di specie fa si che i pattern
epidemiologici della malattia nel mondo siano diversi. Per esempio, il P. vivax si sviluppa in zanzare che
vivono a temperature inferiori della specie che sono il vettore del P. falciparum. Di conseguenza, la
distribuzione geografica della malaria vivax è più diffusa di quella falcipara.
La malaria viene diagnosticata osservando al microscopio ottico la presenza dei parassiti nei globuli rossi
in strisci di sangue tramite la colorazione di Giemsa o di Wright. Oggi sono utilizzati anche metodi basati
sulla ricerca di antigeni nel sangue dei pazienti o di frammenti specifici di DNA con la tecnica della PCR,
anche se quest’ultima è scarsamente utilizzata nelle regioni endemiche per l’alto costo e per la
mancanza delle necessarie attrezzature.
14. Epidemiologia della malaria
Dopo la seconda guerra mondiale sono stati messi in atto a livello mondiale una serie di
programmi mirati a eradicare la malaria dalle regioni endemiche. Mentre in diverse zone
tale sforzo è stato coronato da successo, in molte regioni dell’Africa tropicale e dell’Asia
è fallito.
Ciò è dovuto in parte alla scarsa efficacia da parte degli operatori sanitari locali, in parte
per la comparsa di ceppi di zanzare resistenti al trattamento con pesticidi.
Inoltre, per poter mettere in opera dei programmi efficaci e degli obiettivi raggiungibili
dipende anche da attendibili dati epidemiologici. I dati più accurati indicano in circa 1-2
milioni i morti causati direttamente dalla malaria (circa 3 - 6 000 al giorno), di cui la
maggior parte sono bambini africani.
•Diversi fattori influenzano la distribuzione della malaria che contribuiscono a rendere più
difficile il suo controllo:Instabilità climatica: siccità e alluvioni possono aumentare la
trasmissione della malattia in diverse circostanze epidemiologiche.Global warming:
l’aumento della temperatura a livello mondiale sta determinando un incremento della
trasmissione della malaria in alcune aree prima prive dell’infezione, anche se difficilmente
esso può contribuire a un aumento globale della malaria.Agitazioni politiche e guerre civili
determinano il collasso dei programmi di trattamento e i rifugiati localizzati in campi di
aiuto umanitario possono causare l’insorgere di epidemie per la presenza di portatori
provenienti da aree endemiche.Diffusione dell ’ HIV: i pazienti con AIDS sono più
suscettibili alla malaria e riduce il numero del personale medico disponibile per il
14
trattamento della malaria, eMutazioni che conferiscono resistenza ai pesticidi adoperati
16. I plasmodi
La malaria è la più importante malattia parassitaria causata da protozoi.
• La specie di plasmodi che infettano l’uomo e hanno diversi gradi di virulenza
sono:Plasmodium vivax (malaria benigna terziaria);P. ovale
(malaria benigna terziaria o malaria ovale);P. malariae (malaria
quartana) eP. falciparum (malaria maligna terziaria).
16
17. I plasmodi
• Plasmodium vivax Questo plasmodio è la specie che colpisce maggiormente
l’uomo ed è quello più diffuso a livello mondiale per la capacità del vettore di
crescere sia in aere tropicali che sub-tropicali e temperate.
• Il P. vivax invade selettivamente gli eritrociti giovani e immaturi. Una vota
penetrato nel globulo rosso questo si ingrandisce e acquisisce una forma
irregolare. Tali cambiamenti di morfologia sono utilizzati per l’identificazione del P.
vivax. Un individuo sviluppa i sintomi della malaria tra i 10 e i 15 giorni dopo la
puntura della zanzara. I sintomi non sono molto diversi da quelli di un’influenza.
Solo dopo un certo periodo e diverse lisi dei globuli rossi il paziente mostra i tipici
sintomi della malaria. I cicli febbrili si susseguono ogni 48 ore con la lisi dei globuli
rossi (malaria benigna terziaria).Plasmodium ovale (malaria benigna terziaria o
malaria ovale); questo plasmodio è simile al vivax anche per la sua preferenza a
invadere eritrociti giovani e immaturi, ma dopo l'invasione del globulo rosso
questo prende una forma appunto ovale. Il P. ovale è diffuso prevalentemente in
Africa dov’è presente più del vivax, ma è causa della malaria anche in Asia e in
Sud America. I
P. ovale determina una malattia simile a quella del vivax, cioè la malaria benigna
terziaria o malaria ovale. A differenza del vivax che può causare una malaria che
perdura per diversi anni, la malaria causata dall’ovale dura in genere circa un
anno. 17
18. I plasmodi
• Plasmodium malariae Questo plasmodio infetta solo eritrociti maturi, e non
determina una deformazione dei globuli rossi. Mentre gli ipnozoiti del P. vivax e
del P. ovale sono normalmente identificati nel fegato, nella malaria causata dal P.
malariae sono assenti.
Il periodo di incubazione è il più lungo dei plasmodi umani (tra i 18 e i 40 giorni, ma a
volte anche dopo qualche anno dopo la puntura). I cicli febbrili hanno una
frequenza di 72 ore (malaria quartana) e può persistere nell’uomo anche diversi
anni. Il P. malariae è presente nelle stesse regioni tropicali e sub-tropicali degli
altri plasmodi ma è meno frequente.
• Plasmodium falciparum È questo il plasmodio più virulento e di gran lunga la
causa di morte della maggior parte dei casi di malaria. Una delle ragioni è che il P.
falciparum non ha selettività di eritrociti, infettando infatti tutti gli stadi di eritrociti.
Inoltre, fino a 4 plasmodi possono penetrare nei globuli rossi. Poiché la gran parte
dei trofozoiti e degli schizonti si localizzano nel fegato e nella milza, raramente
vengono osservati negli strisci di sangue. Ricadute (relapse) sono raramente
osservate anche se una recrudescenza della patologia può avvenire e sono quasi
sempre fatali. Il periodo di incubazione è di soli 7 - 10 giorni a cui seguono i
classici sintomi della malaria. Il falciparum causa una malaria maligna terziaria
con attacchi febbrili ogni 36 - 48 ore.
18
19. Plasmodium
Il ciclo vitale del Plasmodium è simile in tutte le specie che infettano l’uomo.
ipnozoiti
schizonti
Il Plasmodium è presente nell’uomo prevalentemente nei globuli rossi del sangue e nelle cellule del fegato,
mentre nella zanzara Anopheles gambiae, mostrata in si localizza nelle ghiandole salivari e nell’intestino.
Il ciclo inizia con la puntura di una zanzara che introduce gli sporozoiti del Plasmodium presenti nella sua saliva
nel sistema circolatorio dell’uomo. Gli sporozoiti raggiungono le cellule parenchimali del fegato dove avviene la
riproduzione asessuata (schizogonia). Questa fase di crescita (ciclo esoeritrocitico) dura tra gli 8 e i 24 giorni a
secondo della specie di Plasmodium. Quando gli sporozoiti smettono di dividersi nel fegato si trasformano in
una forma latente (ipnozoiti, prevalentemente nel P. vivax e P. ovale) che possono causare la malaria anche
molti anni dopo l’infezione iniziale. Quando gli epatociti lisano i plasmodi maturi si sono trasformati in merozoiti
che entrano nel circolo sanguigno e attaccano i globuli rossi dando vita al ciclo eritrocitico (parassitemia).
Durante questo ciclo i merozoiti si trasformano in forme ad anello (ring form) i trofozoiti mononucleati che
generano gli schizonti dotati tra 6 e 24 nuclei. Gli schizonti generano nuovamente i merozoiti che lisano il
globulo rosso e invadono altri globuli rossi ripetendo il ciclo. La fase eritrocitaria ciclica si ripete ogni 48 - 72 hr
20. Plasmodium
Il ciclo vitale del Plasmodium è simile in tutte le specie che infettano l’uomo.
ipnozoiti
schizonti
Il ciclo si interrompe quando i merozoiti formano in gametociti maschili e femminili.
Una zanzara pungendo un individuo infetto ingerisce (blood meal) i gametociti che
giungono nell’intestino dell’insetto dove lisano e si fondono generando uno zigote
diploide (oocinete).
Lo zigote migra verso la parete dell’intestino dove forma gli oocisti. All’interno
dell’oocisti avviene la meiosi che forma cellule aploidi, gli sporozoiti (sporogonia) che
migrano nelle ghiandole salivari della zanzara completando il ciclo del plasmodio.
La zanzara pungendo un nuovo individuo trasferisce il parassita da vita a un nuovo
21. La patogenesi della malaria
Nei casi gravi di malaria, e in particolare nella malaria cerebrale, diversi organi e
tessuti del corpo umano sono coinvolti oltre i globuli rossi.
Una delle caratteristiche principali del P. falciparum è quella di indurre i globuli
rossi infetti ad aderire alle pareti dei capillari sanguigni determinando
un’occlusione degli stessi e una limitazione della perfusione dei tessuti.
La lisi dei globuli rossi compromette ulteriormente il quadro clinico causando
anemia e la riduzione della diffusione dell’02.
Nonostante la gran mole di studi condotti sulla malaria, non è ancora emersa una
comprensione complessiva dei meccanismi della patogenicità di questo
parassita. Oggi si ritiene che la malattia sia determinata da una serie di
concause, come la lisi massiva dei globuli rossi (sia infettati che non),
l ’ occlusione dei capillari e i processi infiammatori a essi associati, che
causerebbero nell’insieme la riduzione della perfusione dei tessuti che a loro
volta genererebbero ulteriori danni aggravando il quadro clinico fino alla morte del
paziente.
21
22. La patogenesi della malaria
Dopo la puntura della zanzara gli sporozoiti raggiungono il fegato dove
transitano in diversi epatociti prima di trasformarsi in merozoiti. La
penetrazione nelle cellule del fegato viene mediata da un recettore degli
sporozoiti che lega specificamente gli epatociti. Ogni sporozoita è in grado
generare diverse decine di migliaia di merozoiti ognuno dei quali
successivamente attacca un globulo rosso, e moltiplicandosi al suo interno, da
inizio alla malattia.
Una volta penetrato in un globulo rosso (tramite dei recettori ancora poco
conosciuti), il plasmodio induce la formazione di un vacuolo utilizzando la
membrana plasmatica del globulo rosso stesso e penetra così al suo interno. A
differenza di P. vivax che invade i reticolociti (globuli rossi immaturi), P.
falciparum è in grado di invadere globuli rossi di diverso grado di maturazione.
22
23. La patogenesi della malaria
P. vivax invade solo globuli rossi che presentano sulla membrana l’antigene
Duffy (una proteina glicosilata di membrana) che è espresso preferenzialmente
nei reticolociti e non nei globuli rossi maturi.
Questo selettività per questo antigene ha fatto sì che nelle popolazioni umane
dell’Africa occidentale che non esprimono tale antigene nei reticolociti sono
immuni dalla malaria vivax che è assente in questa regione.
Inoltre, il P. vivax possiede un solo gene per riconoscere l’antigene Duffy, mentre
P. falciparum ne possiede diversi oltre Duffy che utilizza come recettori per
penetrare nei globuli rossi di diverso grado di maturazione.
L’adesione e la penetrazione del plasmodio all’interno di un globulo rosso sono
processi molto complessi e che comprendono diversi stadi. Inizialmente il
merozoita si colloca frontalmente alla membrana di un globulo rosso.
Successivamente si forma una giunzione tra l’ospite e il parassita che viene
mediata dalle proteine di superficie dell ’ eritrocita e da proteine integrali di
membrana del plasmodio.
A questo segue la formazione del vacuolo e il passaggio del merozoita all’interno
del vacuolo è mediato da un motore molecolare composto da un filamento di
actina e da un complesso di miosina.
L ’ invasione del globulo rosso è completa quando l ’ invaginazione della
23
24. La patogenesi della malaria
Strutture a rosetta degli eritrociti (rosetting) Gli eritrociti possono formare delle
aggregazioni quando intorno a un globulo rosso si forma una struttura detta “a
rosetta”, che ricorda la forma di un fiore. Tale fenomeno è presente anche nella
malaria, nella quale un plasmodio funge da cellula centrale attorno al quale si
legano i globuli rossi formando la rosetta. Tale formazione è dovuta
all’interazione tra un epitopo della membrana del protozoo e dei recettori sui
globuli rossi. Questa struttura permette al plasmodio di rimanere sequestrato ed
evitare di essere distrutto (per esempio, nel fegato e nella milza). La formazione
di rosette è molto importante nella progressione della malaria in quanto si è visto
che c’è una stretta correlazione fra la sua formazione e la forma cerebrale
Tossine malariche La malaria
(letale) della malattia. coinvolge complesse risposte
infiammatorie e anche la produzione
di tossine. In generale, tali tossine,
prodotte e rilasciate dai trofozoiti e
dagli schizonti, inducono le cellule
umane a sovra-produrre fattori che si
legano al siero. La gran parte delle
tossine malariche sono resistenti al
trattamento con proteasi e la loro
attività dipende dalla presenza 24 di
25. Variazione antigenica
Il processo della variazione antigenica è il meccanismo tramite il quale un
patogeno (plasmodi, tripanosomi, Leishmania, Salmonella) altera l’espressione
di proteine di membrana per evadere il sistema immunitario.
Il P. falciparum esporta sulla membrana dell ’ eritrocita diverse proteine che
determinano profonde alterazioni sia nelle proprietà antigeniche sia adesive della
cellula infettata.
La sua persistenza durante la proliferazione nello stadio eritrocitario dipende
dall’espressione successiva di molecole varianti sulla superficie degli eritrociti
infetti.
Questo processo avviene tramite il controllo trascrizionale di circa 60 geni (geni
var) che codificano per una famiglia di proteine di superficie, chiamate PfEMP1
(P. falciparum erythrocyte membrane protein 1, proteina di membrana di P.
falciparum specifica per gli eritrociti), che sono utilizzate per interagire con gli
eritrociti.
Ogni parassita esprime un solo gene var alla volta mentre gli altri sono
trascrizionalmente repressi, e ognuna delle proteine PfEMP1 permette al
plasmodio di aderire ai capillari sanguigni determinando la forma grave della
malattia.
25
26. Le famiglie geniche della variazione antigenica e loro organizzazione genomica
L’analisi del genoma di P. falciparum ha permesso di determinare che esiste
solo un numero ridotto di geni var (circa 60) per genoma aploide (un numero
molto basso rispetto ai circa 1.500 geni coinvolti nella variazione antigenica dei
tripanosomi).
È stata scoperta una seconda famiglia chiamata rif (repetitive interspersed
family, famiglia interspersa ripetitiva).
Le proteine codificate da questa famiglia genica, le RIFIN, sono antigeni di 30 -
45 kDa che hanno 2 regioni trans-membrana (2TM) che espongono circa 170
amminoacidi sulla membrana dell’eritrocita. Si ritiene che le RIFIN come altre
proteine 2TM siano fondamentali per il parassita per determinare l’infezione
degli eritrociti.
Inoltre, sono state identificate altre 2 famiglie geniche 2TM che codificano per
proteine coinvolte nella variazione antigenica e sono le STEVOR, simili alle
RIFIN che sono espresse in uno stadio tardivo degli eritrociti, e le PfEMP1.
Entrambe i membri di queste famiglie hanno una frequenza di cambiamento di
espressione simile a quella dei geni var.
Infine, un’ultima classe di proteine antigeniche identificata sono le proteine
SURFIN codificate dai geni surf (surface associated interspersed genes, geni
interspersi codificanti per proteine di superficie). 26
27. Le famiglie geniche della variazione
antigenica e loro organizzazione genomica
28. Famiglie geniche che codificano per proteine
variabili di superficie di P. falciparum
29. Le famiglie geniche della variazione antigenica e loro organizzazione genomica
Circa il 60 % dei geni var è localizzato in prossimità di una regione sub-telomerica
composta da un mosaico di elementi ripetuti non codificanti (TARE 1 - 6, telomere
associated repeats, sequenze ripetute associate ai telomeri) orientati in differenti
direzioni.
L’organizzazione complessiva delle regioni sub-telomeriche dei geni var (comprese le
regioni codificanti e non-codificanti) è conservata nei 28 telomeri dei 14 cromosomi del
P. falciparum. L’alta frequenza di ricombinazione che genera le nuove forme var
avviene per conversione genica.
29
30. Posizione fisica dei geni var nel nucleo di P. falciparum
nello stadio di anello (trofozoita)
Risultato schematizzato di
esperimenti tramite FISH
(fluorescent in situ hybridization)
in cui i cromosomi di P.
falciparum occupano siti specifici
nel nucleo del parassita. Infatti, i
geni var telomerici si localizzano
alla periferia del nucleo e
formano complessi comprendenti
da 4 a 7 cromosomi.
Una singola regione non
codificante localizzata a monte di
un gene var (per esempio, upsB
o upsC di circa 2 kb) viene
rimossa dal gene originale e ciò è
sufficiente a iniziare il
meccanismo di conteggio
(counting mechanism).
L ’ attivazione trascrizionale
avviene alla periferia del nucleo,
e silenzia tutti gli altri geni var
endogeni ed è ereditata nella
31. Posizione fisica dei geni var nel nucleo di P. falciparum
nello stadio di anello (trofozoita)
Una delle funzioni dei telomeri oltre ad assicurare la stabilita genomica e
una corretta divisione cellulare è quella di reclutare proteine specifiche per
generare un ’ appropriata organizzazione della cromatina che reprime
l'espressione genica in maniera dipendente dalla distanza da essi (effetto
posizionale dei telomeri, telomere position effect, TPE).
I geni var associati ai telomeri distano da questi tra le 20 e le 35 kb e
possono essere derepressi per inattivazione da parte della proteina che
lega i telomeri PfSir2 (corrispondente alla proteina ortologa di S.
cerevisiae, Sir2) che si associa con i promotori dei geni var silenziati.
32. L’anemia falciforme e la malaria
L’anemia falciforme (sickle-cell anaemia) è una malattia genetica autosomale recessiva che si
esprime nei globuli rossi che assumono una forma anormale, rigida simile a una falce.
Questa malattia genetica è stata descritta la prima volta nel 1910 dal medico statunitense James
B. Herrick identificando nel sangue di un paziente proveniente dalle Indie Occidentali eritrociti
dalla forma a falce.
Nel 1949 Linus Pauling dimostrò che l’emoglobina purificata da individui normali e da pazienti con
la malattia avevano una mobilità elettroforetica diversa. Successivamente, nel 1957 tramite
peptide fingerprinting, fu dimostrato che solo uno dei frammenti peptidici ottenuto per digestione
dell’emoglobina mutata aveva una diversa mobilità elettroforetica.
Il cDNA codificante per la β-globina umana fu clonato nel 1978.
33. L’ anemia falciforme
L ’ anemia falciforme è dovuta a una
mutazione nel gene che codifica per
l’emoglobina, che è localizzato sul braccio
corto del cromosoma umano 11, genera
una proteina alterata (HbS).
La malattia è più diffusa nell'Africa centro-
orientale, nel Sud dell'Arabia, in India e tra
le popolazioni del mediterraneo si presenta
in alcune zone dell ’ Italia, Spagna e
Grecia.
Analisi di genetica ha permesso di stabilire
che tali mutazioni sono comparse
indipendentemente nelle diverse
popolazioni
Negli individui eterozigoti per HbS non vi è danno significativo per i portatori in quanto l’allele non
mutato (HbA) produce il 50% di emoglobina normale. Negli individui omozigoti per HbS la valina che è
un amminoacido idrofobico (mentre l’acido glutammico è un amminoacido polare acido) causa il
collasso dell’emoglobina. Questa mutazione non determina effetti significativi nella struttura terziaria
e quaternaria della proteina in condizioni in concentrazione di ossigeno normali. A bassa tensione di
ossigeno però l’emoglobina espone il frammento composto dai primi sei amminoacidi tra i frammenti
E e F della proteina. La valina in queste condizioni si associa con la regione idrofobica causando
l’aggregazione della stessa emoglobina che forma un precipitato. La proteina mutata collassa e
distorce la forma del globulo rosso da una forma rotondeggiante liscia a forma di ciambella a
una di falce rugosa e con protuberanze rendendo l’eritrocita fragile e suscettibile a lisi nei
capillari. Gli individui portatori di questa mutazione mostrano i sintomi della malattia solo in condizioni
35. Trade off
malaria/anemia falciforme
In un portatore della mutazione HbS i globuli rossi tendono a lisare
precocemente cosa che impedisce al plasmodio di riprodursi. Inoltre, il
plasmodio non è in grado di metabolizzare l’HbS precipitata.
Nelle regioni tropicali dell ’ Africa, tra il Gambia e il Mozambico, la
frequenza di mutazione HbS del gene dell’emoglobina supera il 20%
nelle popolazioni locali.
Dettagliate analisi genetiche e antropologiche hanno dimostrato che i
genotipi HbA/HbS hanno chiaramente un vantaggio riproduttivo sia sui
genotipi HbA/HbA sia HbS/HbS in un ambiente dove la malaria è
endemica.
35
36. The malaria hypothesis:
l’agricoltura, la linguistica e l’evoluzione biologica e socioculturale
L’ipotesi della malaria, fu proposta nel 1957 da Frank B. Livingston il quale suggerì che le differenze
nella frequenza della mutazione S nel gene dell’emoglobina (Hb) tra le popolazioni umane fossero
dovute alla selezione genetica determinata dalla diffusione della malaria.
Nelle regioni dove la malaria è endemica, questa mutazione conferisce un vantaggio selettivo
(aumenta la fitness dell’individuo che è portatore del gene HbS in eterozigosi) rispetto agli individui
che non la posseggono, in quanto riduce in questi la possibilità di sviluppare la malaria.
I plasmodi, e in particolare P. falciparum, possono infatti determinare significative differenze
riproduttive tra genotipi sensibili (alleli normali HbA) e resistenti (allele mutato HbS) alla malaria.
Se infatti l’allele S conferisce una misura della resistenza alla malattia negli eterozigoti, allora queste
differenze riproduttive possono aumentare la frequenza di questo allele nella popolazione umana
come confermato dalle analisi epidemiologiche.
Studi della correlazione fra distribuzione della malaria falcipara e la frequenza dell’allele S hanno
confermato tale ipotesi genetica. Un’ulteriore importante evidenza è venuta dagli studi basati sulla
cosiddetta correlazione agricola e sull’osservazione che Anopheles gambiae, il principale vettore del
P. falciparum, richiede per la sua riproduzione acque calde stagnanti e soleggiate. Livingston notò che
tali condizioni sono raramente presenti nelle foreste tropicali che sono costituite da un’intensa e fitta
vegetazione.
È solo nelle aree dove l’uomo ha modificato l’ambiente, tagliando le foreste, che si sono formate le
condizioni ideali per la diffusione della zanzara. Quindi dove le foreste sono state sostituite con terreni
aperti e irrigati adatti per l’agricoltura è stato possibile, insieme con il conseguente aumento della
presenza dei plasmodi, la diffusione del vantaggio selettivo del gene HbS dell’emoglobina.
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37. The malaria hypothesis:
l’agricoltura, la linguistica e l’evoluzione biologica e socioculturale
Livingston predisse l ’ esistenza di una forte correlazione tra evoluzione
genetica e culturale delle popolazioni umane e indicò come causa scatenante
della diffusione della malaria, l’espansione dell’agricoltura che determinò il
cambiamento nella frequenza genica dell’allele Hbs nelle popolazioni umane in
Africa.
In particolare, dimostrò che nell ’ Africa occidentale c ’ è un gradiente di
diffusione dell’allele S che si sovrappone alla coltivazione della patata dolce
nel Sud e del riso a Est. Lo studio di Livingston è ora definito “un classico della
genetica delle popolazioni umane e il primo e chiaro dettagliato esempio di una
stretta associazione tra biologia, cultura e l ’ instaurarsi di una malattia
(molecolare)” ed è oggi considerato il primo esempio di antropologia evolutiva.
Negli anni successivi, le analisi epidemiologiche a livello mondiale hanno
dimostrato che l’ipotesi della malaria era corretta.
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38. The malaria hypothesis:
l’agricoltura, la linguistica e l’evoluzione biologica e socioculturale
Nel 1970 nel laboratorio di Lucio Luzzatto, allora presso il Dip. di Ematologia
presso l’Università di Ibadan, Nigeria, fu dimostrato che i globuli rossi degli
eterozigoti HbA/HbS non assumono la forma falciforme in condizioni normali,
ma hanno questo fenotipo quando sono infettati dal plasmodio.
Inoltre, lo sviluppo della forma falciforme del globulo rosso determina la perdita
di micronutrienti come il K+ che causa la morte del parassita.
Ciò dimostra una relazione diretta tra la mutazione S e l ’ aumento della
frequenza di questo allele nella popolazione in quanto gli eritrociti normali non
formano strutture falciformi.
Livingston propose anche che dovessero essere condotti studi sulla frequenza
genica dell’allele HbS in particolare nelle popolazioni dell’Africa occidentale
sulla base dei diversi gruppi linguistici e delle diverse ondate migratorie
avvenute in quelle regioni nel corso dei millenni.
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39. The malaria hypothesis:
l’agricoltura, la linguistica e l’evoluzione biologica e socioculturale
Livingston propose anche che dovessero essere condotti studi sulla frequenza
genica dell’allele HbS in particolare nelle popolazioni dell’Africa occidentale
sulla base dei diversi gruppi linguistici e delle diverse ondate migratorie
avvenute in quelle regioni nel corso dei millenni.
Lo studio fu effettuato da William H. Durham negli anni ’80 proprio nell’Africa
occidentale in quanto le popolazioni locali presentano una grande diversità
etnolinguistica. Queste popolazioni sono divise in tre gruppi linguistici principali,
a loro volta suddivisi in famiglie e sottofamiglie. Inoltre, la produzione agricola
dell’Africa occidentale è chiaramente divisa in tre regioni, comprese tra il 5° e
il 17° parallelo Nord, con zone climatiche ed ecologiche ben distinte in cui
vengono coltivati separatamente la patata dolce, il riso e il sorgo insieme con il
miglio. Analisi esaustive sia della genetica dei diversi gruppi etnolinguisitici che
dei dati sul tipo di agricoltura praticata hanno permesso di dimostrare che
l’allele S è stato introdotto in queste regioni dal Sud-Centro della Nigeria verso
l’Ovest dell’Africa occidentale da un’ondata di migrazioni verso queste regioni
oltre 2 000 anni fa. Inoltre, nelle regioni del gruppo linguistico Kwa la diffusione
dell’allele S coincideva con l’introduzione della coltivazione del riso avvenuta
intorno a 3 500 anni fa nella regione da loro occupata, mentre nelle aree dove
gli abitanti sino rimasti cacciatori/raccoglitori la frequenza era molto bassa. 39
40. Leishmania
Le leishmanie sono protozoi emoflagellati del genere dei tripanosomatidi che
infettano il sangue dell’uomo e i suoi tessuti determinando diverse forme della
malattia denominata leishmaniosi. La Leishmania viene diffusa da ditteri
ematofagi (pappataci) del genere Phlebotomus nel Vecchio Mondo, e del
genere Lutzomyia nel Nuovo Mondo.
Ogni anno muoiono circa 60 000 dei 12 milioni di individui infetti.
Oltre l’uomo, la Leishmania infetta i canidi e i roditori e in genere i vertebrati.
Phlebotomus
41. Il ciclo vitale della Leishmania
La leishmaniosi è trasmessa dalla puntura di almeno una trentina di specie diverse di pappataci che sono i
vettori naturali del parassita. Le femmine dei pappataci (come le femmine della zanzara Anopheles, vettore
della malaria) hanno bisogno di nutrirsi di sangue per la maturazione delle uova.
I pappataci pungono l'ospite verso sera e si nutrono del sangue che esce dalla puntura. Nelle zone tropicali
la trasmissione avviene tutto l'anno mentre nelle regioni temperate la trasmissione avviene prevalentemente
in estate. Il parassita ha due stadi vitali: uno extracellulare, nell’insetto vettore, e uno intracellulare,
nell’ospite. L’insetto vettore inietta durante la puntura lo stadio infettivo della Leishmania, i promastigoti
metaciclici (cellule allungate dotate di un flagello) che nel circolo sanguigno si ricoprono di proteine del
complemento e sono fagocitati dai macrofagi e da altre cellule fagocitiche mononucleari. In queste cellule i
promastigoti si trasformano in amastigoti che si dividono per scissione binaria e infettano altre cellule
fagocitiche mononucleari. Gli amastigoti vengono poi ingeriti da un altro Phlebotomus nel quale si
trasformano di nuovo in promastigoti nell’intestino medio dove si moltiplicano e migrano nelle ghiandole
salivari (promastigoti metaciclici).
43. Il ciclo vitale della Leishmania
Gli amastigoti che vengono succhiati dall ’ insetto, non si trovano
normalmente nel sangue periferico dell’individuo infetto e quelli presenti in
organi quali fegato e milza non sono accessibili.
Il pappatacio inserendo la proboscide (che ha una forma di sega) e
agitandola nella ferita induce l’ingresso di sangue dai capillari superficiali in
cui sono presenti i macrofagi che contengono gli amastigoti.
L’ingestione del sangue dopo la puntura (circa 10 ore) da parte del
Phlebotomus induce la sintesi di diversi enzimi digestivi (tripsina,
chimotripsina aminopeptidasi, carbossipeptidasi, e α-glucosidasi).
L ’ attacco proteolitico sembra essere efficace solo contro specie di
Leishmania che non sono compatibili con l’insetto mentre nelle specie
compatibili la resistenza agli enzimi digestivi sembra sia dovuta a un ritardo
di alcune ore a trasformarsi nella forma suscettibile.
44. Il ciclo vitale della Leishmania
Il flagello, posto nella regione anteriore del parassita, oltre ad avere un ruolo di
locomozione è coinvolto nei meccanismi di adesione all’intestino del pappatacio.
I promastigoti rispondono a stimoli chimici nuotando verso basse concentrazioni
di zuccheri o elevate di sali.
Il flagello ha delle strutture che interagiscono con un recettore dell’intestino
chiamato galectina, che permette l ’ adesione che utilizza per ancorarsi ai
microvilli dell ’ epitelio dell ’ intestino. La formazione e
l ’ assemblaggio/disassemblaggio del flagello richiedono un sofisticato
meccanismo molecolare e di controllo.
La lunghezza è regolata dalla polimerizzazione della tubulina che avviene nella
porzione terminale del flagello che è regolata da KIN13-2, una proteina della
famiglia delle kinesine.
La Leishmania ha un numero elevato di queste proteine che si legano ai
microtubuli e sono coinvolte nella regolazione della lunghezza del flagello. La
funzionalità e lunghezza del flagello è quindi fondamentale per la sopravvivenza
dei promastigoti per poter muoversi all’interno dell’intestino del pappatacio e
per raggiungere la parte anteriore dell‘intestino stesso in una posizione adatta
per la trasmissione attraverso una puntura.
I promastigoti si trasformano quindi in promastigoti metaciclici e si localizzano
nelle ghiandole salivari dell’insetto. La regolazione del passaggio alla forma
46. Il ciclo vitale e virulenza della Leishmania
Per la trasmissione della Leishmania via insetto da un individuo a un altro è
essenziale che il parassita sia nella forma di promastigote metaciclico. In
genere, non tutti i promastigoti si trasformano nella forma metaciclica, ma solo
circa il 50 % di essi.
Inoltre, deve essere assicurato il passaggio dal vettore a un altro individuo.
Infatti, è cruciale che nel momento in cui l’insetto punge un nuovo individuo, i
parassiti presenti nelle ghiandole salivari siano nella fase di promastigote
metaciclico, altrimenti se i promastigoti si trovano in una fase precoce o
tardiva di questo processo ciò ne impedisce la disseminazione.
I promastigoti internalizzati dai macrofagi vengono circondati dal fagolisosoma
nel quale si trasformano in una forma piccola e ovale senza flagello.
La Leishmania è in grado non solo di sopravvivere ma anche di proliferare
all'interno dei macrofagi. Periodicamente, gli amastigoti fuoriescono dal
macrofago e infettano altre cellule fagocitiche e alcune non fagocitiche come i
fibroblasti.
Gli amastigoti sono responsabili di tutte le forme di leishmaniosi, da quelle
autolimitante, alla forma sfigurante mucocutanea, a quella viscerale letale,
sino alle forme croniche 46
47. Minicircoli e maxicircoli in un chinetoplasto di
Leishmania terentolae
Leishmania (come i tripanosomi) contiene
dei mitocondri atipici chiamati chinetoplasti
che contengono due tipi di DNA circolare:
da 25 a 50 maxicircoli di 20 - 40 Kb che
codificano per geni mitocondriali, e
circa 10 000 minicircoli di 1 - 3 Kb che sono
coinvolti nel processamento dei geni
mitocondriali.
Si è visto che mRNA codificati dal genoma
mitocondriale possono mancare di alcuni
nucleotidi che ne impediscono la corretta
traduzione. Tali mRNA vengono trascritti da
geni incompleti (criptogeni) e poi modificati
(mRNA editing) con l’aggiunta di sequenze
di RNA (RNA guida) che vengono
sintetizzati dai minicircoli.
48. Genomica ed espressione genica degli amastigoti
Il genoma della Leishmania contiene 36 cromosomi ognuno organizzato in
gruppi di un centinaio di geni localizzati sullo stessa elica di DNA.
Dalla sequenza dei genomi delle 3 specie di Leishmania specifiche per
l’uomo si è visto che essi codificano per circa 8 300 proteine e per 900
geni che codificano per RNA non tradotti.
Circa 6.200 geni presenti nei genomi delle tre leishmanie sono simili a
corrispondenti geni di Trypanosoma brucei e T. cruzi, mentre circa 1.000
geni sono specifici per la Leishmania che sono distribuiti in maniera
casuale nel genoma.
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49. Genomica ed espressione genica degli amastigoti
Il profilo della trascrizione dei geni totale di Leishmania è simile a quello dei
tripanosomi in quanto la maggior parte delle sequenze geniche nei diversi
stadi di crescita di L. major, L. mexicana e L. donovani sono trascritte
costitutivamente, e meno del 5 % variano di almeno due volte quando si
paragonano mRMA di promastigoti con quelli di amastigoti.
Questi dati sono molto in contrasto con altri organismi unicellulari come
Saccharomyces in cui più del 25 % della trascrizione genica varia durante
le fasi di crescita (come per esempio, dalla logaritmica a quella
stazionaria).
Tra i geni che sono regolati trascrizionalmente la maggior parte sono
sequenze che codificano per proteine di membrana, mentre quelle
codificanti per proteine del metabolismo rimangono pressoché costanti.
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50. • Old world:
• Phlebotomus sp.
• New world:
• Lutzomyia sp.
2-4 mm, femmine ematofaghe (non obbligato). Ghiandole salivari rilasciano
fattori vasodilatatori.
Diffuse nei tropicici, sub-tropicali, anche in S. Europa
Notturna
