O documento descreve os fundamentos e aplicações da técnica de eletroforese. A eletroforese permite separar moléculas como DNA, RNA e proteínas com base em seu tamanho e carga elétrica através da aplicação de um campo elétrico. Os principais tipos de gel utilizados são gel de agarose e gel de poliacrilamida. A eletroforese tem diversas aplicações em áreas como identificação de pessoas, indústria farmacêutica e agropecuária.

1. Eletroforese
Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Departamento de Biologia
Prof. Hugo Henrique Pádua M.Sc.
Fundamentos de Biofísica

2.  Eletroforese  migração de moléculas ionizadas, de
acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em
campo elétrico.
 Na rotina laboratorial os suportes podem ser:
 Gel de agarose
 Gel de poliacrilamida
 A migração das partículas depende do seu tamanho e carga,
além da DDP a que foram submetidas
Introdução a Eletroforese

3. Técnica de separação de partículas de DNA, RNA ou
proteínas, através da aplicação de uma diferença de
potencial (corrente elétrica)
• as partículas são separadas de acordo com o tamanho
(massa)
Introdução a Eletroforese

4. • Acetato de celulose
• Gel de agarose
• Gel de amido
• Gel de poliacrilamida
• Eletroforese capilar
Introdução a Eletroforese

5.  Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de
partículas de acordo com o seu tamanho.
 Gel de poliacrilamida
 Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas
 Gel de agarose
 Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas
grandes
 O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo
positivo
 Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha,
portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
Introdução a Eletroforese
Eletroforese em gel

6. A amostra é inserida
nos “pocinhos”
Uma corrente
elétrica é aplicada
Partículas de menor
tamanho ou carga
mais negativa corre
primeiro
Eletroforese em gel

7. Eletroforese em gel

8. CORRENTE ELÉTRICA:
A passagem da corrente elétrica através de uma
solução segue a lei de Ohm, na qual:
V = R . I
V = voltagem, R = resistência e I = amperagem
Para que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sob
voltagem (V), corrente (I) e potência (W) constantes.
VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO:
* Diretamente proporcional: ao campo elétrico e à carga
líquida.
* Inversamente proporcional: ao raio, à distância entre os
dois eletrodos e à viscosidade.

9.  PROTEÍNAS: corante “coomasie blue”
 ENZIMAS: solução específica (substrato,
coenzimas, solução-tampão e sais)
 DNA e RNA: vários sistemas de revelação, tais
como:
- Fluorescência (Brometo de Etídio);
- Radioatividade;
- Nitrato de prata;
VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS

10.  Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um
padrão de bandas. Cada banda é um fragmento de
DNA de determinado tamanho.
 O ladder é formado por diferentes
tamanhos de DNA e serve como
marcador de peso molecular
VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS

11. AGAROSE POLIACRILAMIDA
COMPOSIÇÃO
Pó matriz AGA
(Alga marinha)
Acrilamida (I) +
Bisacrilamida (T)
CARACTERÍSTICAS Malha frouxa Malha complexa
OBJETIVO Longos fragmentos Deleção de bases
SOLIDIFICAÇÃO 15 – 20 minutos 24 horas

12. • Brometo de etídio
• Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
• Composto fluorescente à luz UV
• Nitrato de prata
• Gel Red
Eletroforese em gel

13. • A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha
vermelha;
• Dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria;
• Mais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA
Eletroforese em gel de agarose

14. • É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte
• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manter
estáveis as condições de pH do meio
Eletroforese em gel de agarose

15. Visualização do gel de agarose em luz UV

17. 17
Eletroforese
 Marcadores de peso molecular são usados
para estimar o tamanho das moléculas das
amostras.
Eletroforese em gel

18. GEL DE AGAROSE

33.  A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel
para a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de
dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;
 Utilizada para observação de fragmentos menores
(poucos pares de bases ou proteínas);
 Melhor resolução do que a eletroforese em gel de
agarose;
 Desvantagem: Neurotóxica
Eletroforese em gel de poliacrilamida

34. • É realizada em uma cuba de eletroforese vertical.
Eletroforese em gel de poliacrilamida

35. Eletroforese em gel de poliacrilamida

36. 36
• Gel de poliacrilamida
Eletroforese em gel de poliacrilamida

37. GEL DE POLIACRILAMIDA

40. Gel acrilamida

52. 52
Eletroforese: métodos de leitura
Densitometria

53. Aplicações
• Identificação de pessoas: em testes de
paternidade, comparando o DNA do suposto pai,
da mãe e do filho.
• Na identificação de criminosos.
• Na Industria farmacêutica (vacinas, reagentes
de diagnóstico).
• Na agropecuária (animais e plantas
transgênicos).

54. • Na rotina:
• Análise do paciente
• Pesquisa genética
• Conduta terapêutica
• Prognóstico
• Aconselhamento
Aplicações

55. • Tamanho da molécula
• Tipo de molécula
• Concentração
• Conformação do DNA
• Voltagem
• Tampão (TAE, TPE, TBE, PBS, etc)
Fatores determinantes