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2001 french paper mol mech controling cell cycle
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  1. 1. Cancer/Radiother 2001 ; 5 : 109-29© 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservésS1278321801000877/SSU Mise au point Mécanismes moléculaires contrôlant le cycle cellulaire : aspects fondamentaux et implications en cancérologie J.F. Viallard1,2*, F. Lacombe2, F. Belloc2, J.L. Pellegrin1, J. Reiffers2 1 Service de médecine interne et maladies infectieuses, centre François-Magendie, hôpital du Haut-Lévêque, 5, avenue Magellan, 33604 Pessac, France ; 2laboratoire de greffe de moelle, UMR-CNRS 5540, université Victor-Segalen, 146, rue Léo-Saignat, 33076 Bordeaux, France (Reçu le 16 juin 2000 ; accepté le 13 décembre 2000) ´RESUME ´ (p16INK4A, p15 INK4B, p18INK4C, p19INK4D) qui interagissentIntroduction. – La connaissance des mécanismes régulant la spécifiquement avec CDK4 et CDK6, et les membres de ladivision des cellules eucaryotes a progressé très rapidement famille CIP/KIP (p21CIP1/WAF1, p27KIP1 et p57KIP2) qui inhi-au cours des dernières années et les molécules régulatrices bent un grand nombre de CDK. L’interaction entre p16INK4A,du cycle cellulaire jouent un rôle de plus en plus important cycline D/CDK, et pRb/E2F constitue une unité fonctionnelledans les processus cancéreux. Nous nous proposons dans connue sous le nom de « voie pRb ». Chacun des compo-cette revue de décrire les principaux mécanismes de contrôle sants de cette voie peut être déréglé dans un processus can-du cycle cellulaire. Nous aborderons, par quelques exem- céreux, et de plus en plus de données désignent cette voieples, les liens entre la dérégulation du cycle cellulaire et comme une cible obligatoire des étapes de l’oncogénèsel’oncogénèse. dans pratiquement tous les cancers.Actualités et points forts. – Le cycle cellulaire des cellules de Perspectives et projets. – Les progrès réalisés dans lamammifères est divisé en quatre phases survenant selon un connaissance des mécanismes régulateurs du cycle cellu-ordre établi, chaque phase ne pouvant débuter que si la pré- laire ont permis une meilleure compréhension des mécanis-cédente est totalement terminée. Le déroulement correct des mes moléculaires de la cancérisation. Ces progrès ontphases successives du cycle cellulaire est assuré par une débouché sur la découverte de nouveaux leviers thérapeuti-famille de kinases sérine–thréonine dites kinases dépendan- ques, et de nouvelles molécules sont en développement.tes des cyclines (CDK). La chronologie de leur activation est Enfin, le rôle des molécules régulatrices du cycle dansdéterminée par leurs modifications post-traductionnelles d’autres pathologies que le cancer est probable et reste à défi-(phosphorylations/déphosphorylations), et par l’association à nir. © 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SASune cycline, qui constitue la sous-unité régulatrice du com- cycle cellulaire / cycline / inhibiteurs des CDK / kinasesplexe enzymatique. On distingue les cyclines dites G1 (cycli- dépendantes des cyclines (CDK)nes C, D1-3 et E) qui contrôlent la progression en phase G1 etla transition G1/S, et les cyclines dites mitotiques (cyclines Aet B) qui interviennent à la transition G2/M et en mitose. Lescomplexes cycline/CDK activés phosphorylent (et en consé- ABSTRACTquence inhibent), entre autres, la protéine suppresseur de Molecular mechanisms controling the cell cycle: main con- siderations and implications in oncology.tumeur pRb qui bloque le passage vers la phase S en répri- Introduction. – Comprehension of cell cycle regulationmant l’activité transcriptionnelle des facteurs de la famille mechanisms has progressed very quickly these past few yearsE2F. Les cyclines D et leurs partenaires CDK4 et CDK6 ont and regulators of the cell cycle have gained widespreaddes propriétés pro-oncogènes mais leur fonction est régulée importance in cancer. This review first summarizes majorpar une série d’inhibiteurs qui se lient à eux et inhibent leur advances in the understanding of the control of cell cycleactivité kinase. On distingue les membres de la famille INK4 mechanisms. Examples of how this control is altered in tumoral cells are then described. Current knowledge and key points. – The typical mamma-*Correspondance et tirés à part.Adresse e-mail : jean-françois.viallard@chu-bordeaux.fr lian cell cycle consists of four distinct phases occurring in a(J.F. Viallard). well-defined order, each of which should be completed
  2. 2. 110 J.F. Viallard et al.successfully before the next begins. Progression of eukaryotic laire » faisant de la cellule l’unité de base de tout orga-cells through major cell cycle transitions is mediated by nisme vivant. En 1858, l’Allemand Rudolf Virchowsequential assembly and activation of a family of serine- (1821–1902) a complété cette théorie en formulant lethreonine protein kinases, the cyclin dependent kinases célèbre axiome : « toute cellule provient d’une cellule »,(CDK). The timing of their activation is determined by their conduisant au concept de multiplication cellulaire parpost-translational modifications (phosphorylations/ division. L’œuf issu de la fécondation d’une celluledephosphorylations), and by the association of a protein sexuelle femelle par un gamète mâle, et qui donne nais-called cyclin, which is the regulatory subunit of the kinase sance à un embryon à partir duquel se construit, divisioncomplex. The cyclin family is divided into two main classes. après division, un organisme aussi complexe queThe ‘G1 cyclins’ include cyclins C, D1-3, and E, and their l’homme, est devenu, à la fin du XIXe siècle, le symboleaccumulation is rate-limiting for progression from the G1 to S de ce processus vital.phase. The ‘mitotic or G2 cyclins’, which include cyclin A Cependant, au cours du développement embryonnaire,and cyclin B, are involved in the control of G2/M transition les cellules se différencient pour permettre la formationand mitosis. The cyclins bind to and activate the CDK, which des divers organes. Au cours de ce processus, la divisionleads to phosphorylation (and then inhibition) of the tumor cellulaire est inhibée dans certaines régions de l’embryon.suppressor protein, pRb. pRb controls commitment to De même, chez les organismes pluricellulaires adultes, ilprogress from the G1 to S phase, at least in part by repressing existe une hétérogénéité parmi les cellules. Certaines cel-the activity of the E2F transcription factors known to promote lules différenciées ne se divisent plus (cellules du musclecell proliferation. Both the D-type cyclins and their partner squelettique par exemple), d’autres continuent à se divi-kinases CDK4/6 have proto-oncogenic properties, and their ser pendant toute la vie de l’organisme (c’est le cas desactivity is carefully regulated at multiple levels including cellules souches hématopoïétiques), d’autres enfin ne senegative control by two families of CDK inhibitors. Whilemembers of the INK4 family (p16INK4A, p15 INK4B, p18INK4C, divisent que pour réparer une lésion ou compenser la mortp19INK4D) interact specifically with CDK4 and CDK6, the d’autres cellules (cellules de la peau par exemple). ToutesCIP/KIP inhibitors p21CIP1/WAF1, p27KIP1 and p57KIP2 inhibit ces différences ne peuvent s’expliquer que par l’existencea broader spectrum of CDK. The interplay between p16INK4A, d’un mécanisme de contrôle de la division cellulaire. Ilcyclin D/CDK, and pRb/E2F together constitute a functional fallait donc identifier les molécules participant à la crois-unit collectively known as the ‘pRb pathway’. Each of the sance et à la division de la cellule pour ensuite élucidermajor components of this mechanism may become deregu- les mécanismes de régulation du cycle de division. Ceslated in cancer, and accumulating evidence points to the molécules ont été découvertes dans les levures, les œufs‘pRb pathway’ as a candidate obligatory target in multistep d’amphibiens puis dans les cellules de mammifères. Lesoncogenesis of possibly all human tumor types. 15 dernières années ont connu une véritable explosion desFuture prospects and projects. – Major advances in the connaissances des mécanismes qui régulent le cycle cel-understanding of cell cycle regulation mechanisms provided lulaire. Cela a permis de proposer des principes générauxa better knowledge of the molecular interactions involved in qui semblent régler la division cellulaire chez des êtreshuman cancer. This progress has led to the promotion of new vivants aussi différents que l’homme, la levure de bièretherapeutic agents presently in clinical trials or under devel- (saccharomyces cerevisiae) ou encore la levure fissileopment. Moreover, the components of the cell cycle are (saccharomyces pombe). Du coup ces découvertes ontprobably involved in other non-cancerous diseases and their ouvert la voie à une meilleure compréhension des méca-role must be defined. © 2001 Éditions scientifiques et médi- nismes moléculaires de la cancérisation qui découle de lacales Elsevier SAS multiplication de cellules anormales. Le déroulement ordonné des différentes phases ducell cycle / cyclin / cyclin dependent kinase (CDK) / inhibitors ofCDK cycle cellulaire ainsi que leur régulation par les stimuli intra- et extracellulaires sont régulés par des protéines sérine/thréonine kinases : les kinases dépendantes desJusqu’au XIXe siècle, les scientifiques n’avaient qu’une cyclines ou CDK (cyclin dependent kinase) [120]. Lesvague idée des éléments qui constituent les êtres vivants CDK subissent des phosphorylations qui modulent leuret de la façon dont ceux-ci peuvent se développer et croî- activité. Cette activité est de plus dépendante de l’asso-tre. En 1665, l’Anglais Robert Hooke avait bien décrit les ciation avec des protéines appelées cyclines dont l’expres-unités microscopiques qu’il discernait, avec un micros- sion (synthèse et dégradation) est régulée lors de la pro-cope de sa fabrication, dans des coupes de liège. Il les gression dans le cycle. À ce jour, pas moins de huit CDKnomma cellules, du latin cellula, petite chambre. À la fin (CDK1 à CDK8) et huit différents types de cyclines ontdes années 1830, deux Allemands, le botaniste Matthias été mis en évidence et clonés chez les mammifères. Enfin,Schleiden (1804–1881), puis le zoologiste Théodor l’activité des CDK est négativement régulée par des inhi-Schwann (1810–1882), ont proposé la « théorie cellu- biteurs (cyclin dependant kinase inhibitor ou CKI). Ainsi,
  3. 3. Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 111les mécanismes de régulation du cycle font intervenir troisgroupes de protéines : les CDK, les cyclines et les CKI. Nous nous proposons dans cette revue de décrire lesprincipaux aspects fondamentaux qui régissent la progres-sion dans le cycle cellulaire. Par ailleurs, nous verrons,par quelques exemples, quelles répercussions les altéra-tions survenant dans ces mécanismes contribuent au pro-cessus de cancérisation. Il ne s’agit pas ici de faire unerevue exhaustive mais d’apporter les bases fondamentalesnécessaires à la compréhension du rôle oncologique desprotéines du cycle cellulaire. LES ÉTAPES DU CYCLE CELLULAIRELes eucaryotes, de la levure à l’homme, ont des cycles dedivision similaires. Les premières études par microscopieoptique ont permis de définir cinq étapes dans le cycle Figure 1. Les étapes du cycle cellulaire.cellulaire : G0, G1, S, G2 et M (figure 1). G1 signifie« pause 1 » (gap = pause, d’où le G) car il s’agit d’unepause dans le cycle durant laquelle on n’observe, au contrôlent la croissance cellulaire et la différenciationmicroscope, aucun phénomène lié au cycle cellulaire. La dans les organismes multicellulaires semblent donc liés àplupart des cellules adultes, différenciées, ne se divisant la machinerie du cycle cellulaire présente en phase G1.pas, se trouvent en phase G1 ou en état de quiescence qui Il y a 20 ans, Temin a montré que des cellules de pouletdéfinit la phase G0. S signifie « synthèse » d’ADN. C’est deviennent indépendantes des signaux mitogènes exté-pendant cette phase que les chromosomes se répliquent. rieurs plusieurs heures avant d’entrer en phase S [166].Le brin nouvellement synthétisé est exactement complé- Cette notion a été reprise et développée plus tard par Par-mentaire à la matrice. G2 signifie « pause 2 », c’est le dee qui a introduit le terme de point de restriction (R)second arrêt du cycle cellulaire, la cellule se préparant à [113]. R est le moment de G1 après lequel les cellules peu-la mitose. L’étape M est la mitose. Les chromosomes se vent proliférer indépendamment des stimuli extérieurs.condensent et deviennent visibles sous la forme d’entités La progression en début de phase G1 des cellules quiindépendantes. Les deux organisateurs des microtubules, sortent de la mitose (cellules dites postmitotiques, pm) estou corps polaires, se déplacent pour se retrouver chacun rapidement interrompue si on enlève les facteurs de crois-d’un côté du noyau. Des faisceaux de microtubules se sance du milieu de culture ou si on inhibe la synthèse pro-développent à partir des corps polaires pour former le téique (20 à 50 % d’inhibition) [184]. Néanmoins, au-delàfuseau mitotique. Quelques-uns de ces microtubules d’un certain temps après la mitose (qui diffère selon les’attachent aux kinétochores des chromosomes qui, ainsi type de cellule, fibroblastique ou épithéliale par exemple)attachés, s’alignent alors sur la plaque métaphasique qui les cellules ne s’arrêtent plus, même si les facteurs mito-est un plan situé à mi-chemin entre les corps polaires. gènes sont retirés du milieu, mais avancent et effectuentLorsque tous les kinétochores sont attachés aux microtu- un cycle complet. On distingue donc les cellules ditesbules et alignés sur la plaque métaphasique, un signal est G1-pm (cellules postmitotiques arrêtées par la privationdonné et l’anaphase débute. Les chromosomes commen- en facteurs de croissance) et les cellules dites G1-ps (pré-cent à se déplacer vers les pôles qui s’éloignent par phase S) qui sont capables d’initier une réplication deailleurs l’un de l’autre. Enfin, la cellule se divise (c’est la l’ADN en absence de facteurs mitogènes (figure 2). Lacytodiérèse) pour produire deux cellules filles en phase transition qui fait passer une cellule de la phase G1-pm àG1. la phase G1-ps correspond au terme anglo-saxon commit- ment : c’est l’engagement irréversible de la cellule vers LA NOTION DE POINT DE RESTRICTION un cycle chromosomique complet. Cette transition corres- pond au point R dit de restriction.Une cellule ne peut entrer en cycle que sous l’effet de fac-teurs stimulateurs appelés mitogènes. Pendant la phase LES CYCLINESG1, la cellule décide si elle continue à progresser dans lecycle cellulaire, ce qui aboutira à la division cellulaire, ou Les cyclines sont une famille de protéines qui subissentsi elle quitte le cycle et entre alors dans un état de quies- des variations de leur taux au cours du cycle et qui parta-cence (G0) ou de différenciation. Les mécanismes qui gent toutes un degré de similitude quant à leur composi-
  4. 4. 112 J.F. Viallard et al. Figure 2. Modèle du cycle cellulaire basé sur des expériences faites sur des fibroblastes humains. Les cellules sortent de la mitose et entrent à nouveau en phase G1-pm. La progression jusqu’au point R est dépendante des facteurs de croissance (FC). Si les FC sont enlevés du milieu, les cellules entrent dans un état de quiescence (G0). Lorsque les FC sont réintroduits, les cellules retournent au même point de la phase G1-pm qu’elles ont quitté lors de leur entrée en quiescence (d’après Zetterberg et al. [184]).tion en acides aminés. En effet, les cyclines sont définies se situe en G2/M [119]. La figure 3B est un exemple dupar une région commune d’environ 100 acides aminés profil d’expression des principales cyclines dans la lignéeappelée cyclin box qui sert à lier et à activer les CDK [68, HeLa au cours du cycle cellulaire.78] (figure 3A). On distingue d’une part les cyclines dites Ces deux types de cyclines varient dans leur structure« START » ou G1 qui atteignent leur pic d’expression en générale : les cyclines mitotiques ont environ 200 acidesphase G1 (cycline C, cyclines D : D1, D2 et D3) ou à la aminés situés dans la partie N-terminale (figure 3A) alorstransition G1/S (cycline E) et d’autre part les cyclines que les cyclines START s’étendent en C-terminal pour for-dites mitotiques (cyclines A et B) dont le pic d’expression mer une région riche en proline, acide glutamique, sérine Figure 3. A : schéma général de la composition des cyclines. B : exemple d’expression des cyclines au cours du cycle cel- lulaire dans la lignée cellulaire HeLa.
  5. 5. Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 113et thréonine appelée « PEST ». Cette région PEST joue Les cyclines mitotiquesun rôle dans le renouvellement rapide de ces cyclines etleur confère une demi-vie très courte [69, 80]. Les cyclines mitotiques comprennent la cycline A et la cycline B. Elles possèdent une séquence d’acides aminés partiellement conservée (dénommée destruction box)Les cyclines D située en partie N-terminale, indispensable à leur destruc- tion rapide et soudaine spécifiquement pendant la mitose [39]. Cette destruction se fait par la voie de la protéolyseLes cyclines de type D sont au nombre de trois et sont les dépendante de l’ubiquitine [161]. Le taux des cyclinespremières à apparaître lors d’une stimulation par des mitotiques augmente progressivement au cours des pha-mitogènes. Elles sont synthétisées tout au long de la sti- ses S et G2 pour atteindre un pic en mitose. Les cyclinesmulation tant que le facteur de croissance reste dans le A et B interagissent toutes les deux avec la kinase CDK1milieu si bien que les taux des cyclines D varient peu au pour déclencher la mitose et la dégradation de ces deuxcours du cycle, avec néanmoins un pic d’expression en protéines est nécessaire pour que la cellule sorte de laG1–S. Inversement, dès que le mitogène est retiré du mitose [98, 135]. Cependant, la synthèse et la destructionmilieu, les cyclines D sont rapidement détruites, quelle de la cycline A ont toujours lieu en avance par rapport à laque soit la position de la cellule dans le cycle [151] : si la cycline B [98, 135].cellule a dépassé le point R, leur destruction est sanseffet ; si la cellule est en G1, la destruction des cyclines D La cycline Aempêche la cellule d’aller plus loin dans le cycle. Leur La cycline A est une protéine de 60 kD qui apparaît à lasynthèse débute en début de G1 et leur activité sur les transition G1/S. C’est la première cycline qui a été clonéekinases ne se fait qu’en milieu de G1 et augmente au fur et et séquencée [164]. Elle est située en position nucléaireà mesure que les cellules approchent de la transition G1-S [117]. Elle a d’abord été considérée comme une cycline[92, 96]. Les partenaires catalytiques majeurs des cycli- mitotique ne jouant un rôle qu’à la transition G2/M, maisnes D sont CDK4 et CDK6 [4, 92, 96]. La fonction pri- plusieurs expériences ont permis de démontrer que lamaire des cyclines D est de stimuler la progression en cycline A agissait plus précocement dans le cycle cellu-phase G1. En dépit de leur similitude, les membres de la laire, étant détectée et activée dès la fin de la phase G1famille des cyclines D sont différemment exprimés selon juste avant l’entrée en phase S [7]. L’activité kinase asso-la lignée cellulaire. Ainsi, la cycline D1 est absente des ciée à la cycline A à la transition G1/S est celle de CDK2cellules de la lignée lymphoïde [1]. et non pas CDK1 [28, 134]. La surexpression de la cycline A entraîne une entrée prématurée en phase S [133]. Les cyclines E et A sont nécessaires au passage enLa cycline E phase S mais ont des fonctions différentes. La cycline A serait utile pour débuter la réplication de l’ADN. Le com-La cycline E est une protéine nucléaire de 50 kD dont plexe cycline A/CDK2 se lie au facteur de transcriptionl’expression est maximale en fin de phase G1, après l’aug- PCNA (proliferating cell nuclear antigen, qui est unementation des cyclines D [69]. Elle agit en fin de phase sous-unité de la polymérase δ de l’ADN intervenant dansG1 en se complexant avec CDK2 [24, 70]. Le complexe la réplication et la réparation de l’ADN) au niveau de cer-cycline E/CDK2 a une forte activité kinase juste avant tains sites de réplication de l’ADN et l’inhibition de lal’entrée des cellules en phase S et phosphoryle la protéine cycline A par des anticorps inhibe la synthèse de l’ADNdu rétinoblastome (pRb) [49, 169]. La surexpression de la dans des cellules humaines [8, 109].cycline E raccourcit la durée de la phase G1, diminue lataille de la cellule, diminue la dépendance aux facteurs de La cycline Bcroissance et prolonge la durée de la phase S [106, 129]. Il existe trois cyclines B : B1, B2, B3. La cycline B1 estDes cellules bloquées en phase G1 débutent quand même la mieux connue et joue un rôle important dans les méca-la réplication de leur ADN quand la cycline E est surex- nismes de déclenchement de la mitose. La cycline B1 estprimée [129]. Des anticorps dirigés contre la cycline E cytoplasmique pendant l’interphase (en association avecinjectés dans des cellules en phase G1 inhibent l’entrée en les microtubules et les centrosomes) jusqu’à la fin de laphase S [106]. Cette inhibition n’a pas lieu si l’injection prophase où elle est transférée brutalement dans le noyause fait dans des cellules en phase S ce qui signifie que la alors que la cycline A reste nucléaire [117, 118]. Lacycline E est indispensable à la transition G1/S. Au cours cycline B1 est intéressante car c’est une des premièresde la phase S, l’expression de la cycline E diminue car protéines du cycle dont la régulation est non seulementelle est dégradée par le protéasome après action de l’ubi- temporelle mais aussi spatiale. En effet, les choses ne sontquitine [178]. pas figées. La cycline B1 circule continuellement entre le
  6. 6. 114 J.F. Viallard et al. phase, la destruction de la cycline B1 s’opère par la voie de la polyubiquitination ce qui est indispensable à l’inac- tivation du complexe cycline B1/CDK1 et à la sortie de la mitose [39]. La destruction est initiée par le cyclosome [65]. Les cyclines virales Les virus du groupe herpès dérèglent le cycle cellulaire. Ainsi, l’EBV (Epstein-Barr virus) immortalise les lym- phocytes B en exprimant deux protéines, EBNALP et EBNA2 qui permettent une surexpression de la cycline D2 [156]. D’autres mécanismes d’action interviennent et notamment la sécrétion de cyclines dites virales. Des tra- vaux récents ont été rapportés concernant l’herpès virus 8 (HHV8) agent du sarcome de Kaposi, mais qui est égale-Figure 4. La cycline B1 a une localisation cytoplasmique jusqu’à la ment associé à la maladie de Castleman et à certains lym-prophase (représentée en gris sur la figure). Il existe un va-et-vient per-manent de la cycline B1 entre le noyau et le cytoplasme mais l’import phomes survenant notamment chez les sujets infectés parnucléaire (assuré par l’importine β) est contrebalancé par l’export le virus de l’immunodéfiscience humaine (VIH). Lenucléaire (assuré par CRM1) qui est plus rapide si bien que la cycline génome de l’HHV8 contient plusieurs gènes qui parta-B1 est cytoplasmique. À la prophase, la phosphorylation de quatre rési-dus serine dans le site appelé CRS de la cycline B1 empêche la recon- gent de grandes similitudes avec des gènes impliqués dansnaissance de la cycline B1 par CRM1 si bien que la cycline B1 devient le contrôle du cycle cellulaire et de l’apoptose [138]. Unnucléaire. de ces gènes qui code pour une protéine homologue aux cyclines de mammifères est dénommé cycline K [11].noyau et le cytoplasme pendant l’interphase [41, 42, 167]. Deux autres cyclines virales ont été également identi-Cependant, la cycline B1 s’accumule dans le cytoplasme fiées : la cycline V et la cycline M qui sont codées par descar l’import nucléaire est contrebalancé par l’export herpès virus contaminant des animaux [163]. Ces cycli-nucléaire qui est plus rapide. En effet, pendant l’inter- nes ont une homologie de séquence étroite avec les cycli-phase, le complexe cycline B1/CDK1 est maintenu dans nes D ; par ailleurs, les cyclines K et V forment préféren-le cytoplasme grâce à l’activité d’un facteur nucléaire tiellement des complexes avec la kinase CDK6 [40]. Lesd’exportation appelé CRM1 ou exportine. En position cyclines virales ressemblent donc aux cyclines D tant parN-terminale, la cycline B1 possède un signal dit de réten- leur fonction que par leur séquence. Leur expressiontion cytoplasmique (CRS) qui correspond à une région de entraîne des dérèglements du cycle donnant un avantage42 acides aminés [118]. Si on injecte dans le noyau de prolifératif aux cellules infectées.cellules HeLa en phase G2, de la cycline B1 dépourvue duCRS, la protéine reste nucléaire. Le CRS est donc plus un Implications des cyclines en cancérologiesignal d’export nucléaire qu’un signal de rétention cyto-plasmique. Le CRS possède une région hydrophobe de 11 Parmi les cyclines jouant un rôle dans la progression de laacides aminés hautement conservée parmi les cyclines de phase G1 et dans le passage à la phase S (cyclines D,type B chez les mammifères. Dans cette région, il existe cycline E et cycline A), seules les cyclines D sont fré-quatre résidus sérine qui, s’ils sont phosphorylés, empê- quemment impliquées dans les tumeurs. L’exemple lechent la reconnaissance du CRS par CRM1. En consé- plus marquant est l’expression ectopique de la cycline D1quence, c’est la phosphorylation de ces quatre résidus dans les lymphomes B (notamment les lymphomes dusérine qui stoppe la sortie de la cycline B1 du noyau en manteau folliculaire) [144]. Cette expression anormale estprophase (figure 4). Les protéines kinases qui phospho- le plus souvent la conséquence de la juxtaposition du gènerylent la cycline B1 en CRS pour réguler sa rétention de la cycline D1 aux régions régulatrices des chaînes lour-nucléaire restent à identifier. des des immunoglobulines par une translocation Dès que la cycline B1 devient nucléaire, l’enveloppe t(11 ;14)(q13 ;q32).nucléaire explose, signifiant que le complexe cycline La cycline D1 a été la première cycline D à être iden-B1/CDK1 agit comme une kinase des lamines nucléaires. tifiée dans les macrophages de souris [93]. Elle a égale-La cycline B1 se lie alors à l’appareil mitotique, en par- ment été identifiée comme le produit du gène PRAD1, unticulier aux pôles du fuseau et à ses fibres principales. En réarrangement connu dans les adénomes humains para-début de métaphase, la cycline B1 s’associe transitoire- thyroïdiens [101] (inversion du chromosome 11, le gènement aux chromosomes condensés. Dès l’entrée en ana- de D1 devenant lié au gène codant pour la parathormone,
  7. 7. Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 115inv [11] [p15 ;q13]), le produit de l’oncogène bcl-1 [176] CDK2 a une masse moléculaire de 33 kDa. Son gène(translocation 11 ;14 [q13 ;q32]). La translocation (11 ; est localisé sur le chromosome 12 en 12q13 [19]. Elle14) est caractéristique des lymphomes du manteau et acquiert une activité kinase en association avec la cyclinedéplace l’enhancer du gène codant pour la chaîne lourde A ou E [121, 19]. Le complexe cycline A/CDK2 déve-des immunoglobulines dans le locus de la cycline D1, loppe une activité kinase dès la phase G1 tardive jusqu’àlaissant le codage de D1 ininterrompu. La cycline D1 est la métaphase, quand la cycline A est détruite. L’activitésurexprimée dans beaucoup de cancers soit par amplifi- kinase du complexe cycline E/CDK2 se manifeste aussication de son gène (43 % des carcinomes tête et cou, 34 % dès la phase G1, atteint son maximum en début de phasedes carcinomes de l’œsophage, 15 % cancers de la vési- S, puis disparaît [121, 19]. Cette kinase, en associationcule, 13 % des cancers du sein, 10 % des carcinomes avec la cycline E, est indispensable à la mise en route debronchiques à petites cellules et des hépatocarcinomes) la réplication de l’ADN [169]. Durant la phase S, lasoit par translocations ciblant le locus de D1 sur le chro- cycline E est remplacée dans ce complexe par la cyclinemosome 11q13 [44]. A [77]. La cycline D2 est codée par un gène situé sur le chro- À la différence de la plupart des CDK connues, CDK4mosome 12p13 [56]. Ce gène a été identifié comme le site n’a pas d’activité kinase sur les histones H1. Son gène estd’intégration d’un provirus murin responsable d’une leu- localisé sur le chromosome 12 en 12q13, dans la mêmecémie T chez la souris et qui entraîne une surexpression région que CDK2 [19]. Ses partenaires régulateurs sontde la cycline D2 [45]. La cycline D2 est parfois surexpri- les cyclines D [91]. Le complexe cycline D1/CDK4mée dans certaines proliférations malignes telles que les devient actif comme kinase au milieu de la phase G1, avechémopathies lymphoïdes chroniques B [18] ou dans les une activité maximale à la transition G1/S, et reste détec-lymphocytes B transformés par l’EBV [156]. table jusqu’à la mitose [92]. Les souris knock-out pour La cycline D3 est codée par un gène situé sur le chro- CDK4 sont viables, mais sont de petite taille et stérilesmosome 6p21 [56]. Ce gène n’a pas été identifié comme [128]. Ces souris développent un diabète en raison d’unun proto-oncogène bien qu’il soit réarrangé dans de mul- déficit en cellules pancréatiques. CDK4 pourrait être untiples désordres lymphoprolifératifs. régulateur spécifique de certains types de cellules. CDK5 est retrouvée à des taux élevés dans les neurones et joue un rôle essentiel dans le métabolisme cérébral. LES KINASES DÉPENDANTES DES CYCLINES CDK5 est particulière car elle n’est pas activée par une (CDK) cycline et possède des activateurs qui lui sont propres [146].Toutes les kinases ont dans leur extrémité NH2 terminale CDK6 est une protéine de 40 kDa formant des comple-une séquence xGxPxxxxREx (où x représente n’importe xes avec toutes les cyclines D. Elle a une activité kinasequel acide aminé). Il s’agit d’une région conservée qui sur pRb. Après la stimulation des lymphocytes T par lacorrespond au domaine de liaison aux cyclines [23, 30]. PHA, cette activité se manifeste dès le milieu de la phaseLes CDK sont au nombre de huit. G1 [96]. CDK1 (ou p34cdc2) est la première CDK décrite chez CDK7 phosphoryle CDK1, CDK2 et CDK4 respective-l’homme. CDK1 est absente des cellules quiescentes. ment sur les résidus thréonine (Thr) 161, 160 et 172, ceDans les cellules qui prolifèrent, elle peut être détectée qui conditionne leur activation comme kinase des histo-tout au long du cycle mitotique, mais son ARN messager nes H1. Elle se lie à la cycline H et subit une phospho-(ARNm) varie au cours du cycle, avec un minimum en rylation sur la Thr 170 pour acquérir l’activité kinasephase G1 [37]. Dans de nombreux types cellulaires, la (homologie avec les Thr 161 de CDK1, 160 de CDK2 etconcentration de la protéine varie peu au cours de l’inter- 172 de CDK4 toutes faisant l’objet de phosphorylationsphase mais dans les cellules lymphoïdes humaines, activatrices). Le complexe cycline H/CDK7 est dénommécelle-ci suit les mêmes variations au cours du cycle cel- CAK (CAK : CDK activating kinase). Ni l’expression delulaire que celles de son ARNm [177]. L’activité enzyma- la protéine CDK7, ni son activité enzymatique ne varienttique de CDK1 ne se manifeste que pendant une période au cours du cycle mitotique des cellules proliférantes, cetrès courte à la transition G2/M, entraînant le déclenche- qui suggérerait un mécanisme particulier gouvernant sonment de celle-ci. L’initiation de la mitose est dirigée de action sur les autres CDK [14].façon temporelle et spatiale par une cascade de phospho- CDK8 est le partenaire CDK de la cycline C.rylation de protéines qui aboutit à l’activation du com-plexe cycline B1/CDK1 [105]. Durant la phase S, CDK1 Régulation de l’activité CDKs’associe à la cycline B synthétisée de novo. CDK1 peutaussi être activée par la cycline A avant l’activation par la L’activation d’une CDK est régulée à trois niveaux :cycline B. – la liaison à une cycline,
  8. 8. 116 J.F. Viallard et al.– la phosphorylation,– la liaison à des protéines aux fonctions variables maisen général inhibitrices.La liaison à une cycline est indispensableUne CDK a une structure bilobaire [15, 66, 67] et lie sonsubstrat et l’ATP dans une partie située entre les deuxlobes. Dans sa forme inactive monomérique, une CDK selie à l’ATP dans une conformation qui rend impossibleune attaque nucléophilique par un substrat hydroxyle surle pont β-γ phosphate de l’ATP. De plus, une partieconservée de la kinase (appelée boucle T), cache la fentecatalytique et empêche la liaison aux substrats. La liaisonà une cycline entraîne un changement de conformation dela CDK (figure 5A). Par exemple, en se liant à la kinaseCDK2, la cycline A modifie l’orientation de l’ATP dans lafente catalytique et provoque un déplacement de la bou-cle T [58, 60]. Ces deux événements ont pour consé-quence une neutralisation des deux facteurs principauxqui gardent CDK2 dans une forme inactive. Les régionsde la cycline A et de CDK2 qui interagissent entre ellessont conservées parmi les autres membres des cyclines etdes CDK.La liaison à la cycline permet la phosphorylationLa liaison à la cycline ne suffit pas pour activer une CDK(figure 5A). La liaison à une cycline fait qu’une CDKdevient accessible à l’action du complexe CAK qui phos-phoryle un résidu thréonine (Thr161 pour CDK1, 160pour CDK2) dans la boucle T [90]. La boucle T devientainsi positionnée en situation C-terminale loin de la fentecatalytique ce qui, dans l’exemple concernant CDK2 et lacycline A, stabilise le complexe cycline A/CDK2 [58]. Il existe une phosphatase qui réverse la phosphoryla- Figure 5. A : activation d’une CDK grâce à la liaison à une cycline ettion de la boucle T en Thr par CAK : c’est la KAP (CDK- grâce à l’action de CAK. B : exemple de régulation de l’activation deassociated phosphatase) [46, 125]. KAP peut se lier aux CDK1. CDK1 est activée si plusieurs conditions sont réunies : la liaisoncomplexes cycline/CDK, mais peut déphosphoryler une à une cycline, la phosphorylation en Thr161 par CAK et l’absence de phosphorylation en Thr14 et Tyr15. La phosphorylation de ces deux der-CDK seulement si elle est monomérique. Donc la déphos- niers résidus se fait par des kinases dont le nom varie selon les espèces.phorylation d’une CDK ne peut nécessairement que sui-vre la dégradation de la cycline. La phosphorylation d’une CDK n’est pas forcément CDC25A est impliquée dans la transition G1/S ; CDC25Bsynonyme d’activation. Seule la phosphorylation de Thr et C sont impliquées dans l’initiation de la mitose.(160 ou 161 selon la kinase) est activatrice. La phospho-rylation de Thr14 et tyrosine (Tyr) 15 (qui s’effectue pardes kinases telles que wee1 ou Myt1 ou Mik1 selon les LA PROTÉINE DU RÉTINOBLASTOME (pRb)espèces) inhibe la CDK (figure 5B). Pour être active, uneCDK doit donc être déphosphorylée sur la Thr 14 et la pRb gardienne du point RTyr 15 ; c’est le rôle de CDC25 qui est une phosphatase[25, 141]. L’activité kinase n’apparaît que lorsque la phos- La protéine du rétinoblastome (pRb) est une sorte de gar-phatase codée par le gène CDC25 déphosphoryle ces deux dienne moléculaire qui empêche la progression en phaseacides aminés, débloquant ainsi l’enzyme. Le début de la G1 [175]. pRb semble agir au point R : c’est la gardiennemitose est donc déclenchée par l’activation de CDC25 et de la porte du point R après lequel la cellule est engagéel’inactivation de Wee1 (kinase qui phosphoryle la Tyr15). irréversiblement dans les autres phases du cycle et doncIl existe trois isoformes de CDC25 [38] : A, B et C. la division cellulaire. pRb est hypophosphorylée (forme
  9. 9. Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 117 cet hétérodimère est importante pour la liaison à l’ADN et la transactivation des gènes. L’activité des facteurs E2F est très strictement contrôlée au cours du cycle cellulaire : ils sont inactifs pendant les deux premiers tiers (environ) de la phase G1 (car les facteurs E2F sont liés à pRb) ; ils sont activés lorsque la cellule passe le point de restriction R. La molécule qui contrôle les facteurs E2F et autorise leur activation est pRb qui se lie physiquement au domaine transactivateur des protéines E2F. Cette interac- tion se fait via la région de pRb dans laquelle sont loca- lisées la plupart des mutations observées dans les tumeurs, la « poche A/B » [174]. La « poche A/B » est également le domaine de pRb avec lequel interagissent certaines protéines transformantes qui inactivent pRb, comme l’antigène T de SV40 ou la protéine E1A de l’adé- novirus. pRb est donc un répresseur de la transcription qui mas-Figure 6. Les complexes cycline/CDK, en phosphorylant pRb en fin de que le domaine transactivateur des facteurs E2F avecphase G1, rendent possible l’expression des gènes dépendants des fac-teurs de transcription de la famille E2F. lequel la protéine pRb interagit directement, les empê- chant ainsi de remplir leur fonction transactivatrice. La phosphorylation de pRb libère les protéines E2F leur per-active de la molécule) lors de la première partie de G1 et mettant de se lier aux promoteurs des gènes cités. Ladevient hyperphosphorylée (et donc inactive) aux alen- transcription peut avoir lieu et la progression dans le cycletours du point R. La cellule, lorsqu’elle arrive au point R, se poursuit au-delà du point R. Les protéines E2F ont unne peut progresser que si pRb devient phosphorylée. rôle primordial dans la transition de G1 à S, le facteurSelon le schéma le plus probable, les complexes cyclines E2F-1 pouvant par exemple à lui seul promouvoir l’entréeD/CDK4-CDK6 et cycline E/CDK2 phosphorylent pRb, en phase S de fibroblastes quiescents [59]. Le promoteurinhibant ainsi son activité antiproliférative. Seules les de E2F-1 a plusieurs sites de fixation pour les autres fac-cyclines de type D (pas les cyclines E ni A) peuvent se teurs E2F, suggérant que E2F-1 régule sa propre expres-lier directement à pRb [22, 31]. Il est probable que pRb sion d’une façon dépendante du cycle, provoquant alorsreste phosphorylée au cours des phases S, G2 et M par les une forte augmentation des taux des protéines E2F libresCDK dépendantes des cyclines A et B, et ne se déphos- en fin de phase G1 [26].phoryle qu’une fois la mitose terminée, les cellules Une fois la cellule passée en phase S, les membres de lamigrant vers la phase G1 (ou G0). famille E2F sont inactivés. Les complexes cycline A/CDK2 (pas les complexes cycline E/CDK2 qui n’ontpRb se lie aux membres de la famille E2F pas cette fonction) se lient aux membres de la famille E2F et phosphorylent DP-1, empêchant ainsi leur liaison àpRb sous forme déphosphorylée exerce une action anti- l’ADN [71, 72].proliférative par son association aux facteurs de transcrip-tion de la famille E2F et les empêche ainsi de transactiver LES INHIBITEURS DES KINASESdes gènes nécessaires à la réplication de l’ADN. La phos- DÉPENDANTES DES CYCLINES (CKI)phorylation de pRb, en fin de phase G1 libère les facteursE2F de l’action inhibitrice de pRb (figure 6) [87, 162]. Quelle stratégie la cellule peut-elle mettre en jeu pour En effet, pRb contrôle l’activité de plusieurs protéines freiner l’activité kinase des complexes cycline/CDK ?notamment celles de la famille E2F qui sont des facteurs Durant l’année 1993, une réponse à cette question a étéde transcription régulateurs de la transcription de plu- apportée par la mise en évidence dans les cellules desieurs gènes requis pour la progression à travers le cycle mammifères d’une série de petites protéines capables decellulaire (par exemple les gènes codant pour la thymi- lier les complexes cycline/CDK et d’inhiber leur activitédine kinase ou pour les cyclines A ou E) ou impliqués kinase. Cela fournit à la cellule un moyen d’inhiber lesdans la réplication de l’ADN (gènes codant par exemple complexes cycline/CDK en réponse à divers stimuli etpour l’ADN polymérase α ou PCNA) [17, 79, 102, 103]. réduit ses possibilités de passer le point R. Ces protéines Les protéines E2F sont des hétérodimères composés inhibitrices peuvent participer à la régulation du cycle cel-d’une molécule E2F (E2F-1 à E2F6) et d’une des protéi- lulaire en retardant l’activation des divers complexesnes de la famille DP (DP1 ou DP2) [74]. La formation de cycline/CDK spécifiques de G1/S jusqu’au temps adéquat
  10. 10. 118 J.F. Viallard et al.et en assurant leur mise en œuvre ordonnée. Ainsi, une ne s’exerçant que lorsque le taux de la protéine modula-lésion de l’ADN déclenche l’accumulation de p53 qui trice devient supérieur à celui des complexes cycline/induit l’expression de p21WAF1/CIP1 qui se lie à tous les CDK. Bien que la saturation du complexe par p21 puissecomplexes cycline/CDK, et l’arrêt en G1 permettant la ainsi bloquer leur activation par CAK, p21 peut égale-réparation de l’ADN [139]. ment inhiber l’activité du complexe qui a déjà subi la Deux grandes familles d’inhibiteurs des complexes phosphorylation par CAK.cycline/CDK ont été décrites. La famille des inhibiteurs L’expression de p21 est universelle et l’expression deKIP/CIP (pour CDK inhibiting protein) est constituée des son gène est régulée par p53 [47, 180, 27]. Dans les cel-protéines p21WAF1/CIP1 (p21), p27KIP1/ICK/PIC2 (p27) et lules des patients atteints du syndrome de Li-Fraumenip57KIP2. Ces protéines partagent la propriété d’inhiber la (maladie caractérisée par une absence d’expression deplupart des complexes cycline/CDK. À l’opposé, les pro- p53), p21 est absente des complexes cycline/CDK [182].téines de la famille INK4 (pour INhibitor of CDK4), Inversement, la synthèse de p21 augmente quand p53 estp16INK4a/MTS1/CDKN2/CDK4I (p16), p15INK4b/MTS2, induite par une lésion de l’ADN (radiations ionisantes). INK4c/INK6A INK4d/INK6Bp18 , et p19 inhibent spécifique- En inhibant indirectement l’activité CDK, p53 empêchement CDK4/6. Chacune de ces protéines est codée par un la phosphorylation de pRb et la libération des facteursunique gène et constituent ainsi les principaux régulateurs E2F. Dans les cellules normales, p21 se trouve dans unde la phosphorylation de pRb. complexe quaternaire incluant la kinase, la cycline, p21 et PCNA [181]. p21 est capable d’inhiber directement laLa famille des inhibiteurs KIP/CIP réplication de l’ADN dépendante de PCNA lors de l’absence de complexes cycline/CDK [171]. p21 est doncLes protéines de cette famille sont nucléaires et ont toutes un médiateur central du point de contrôle G1 induit parla propriété de réprimer l’activité de toutes les CDK de p53.façon universelle. Leur action d’inhibition se fait parl’intermédiaire d’un domaine situé en position p27kip1N-terminale et relativement conservé entre les trois pro- Le gène codant pour p27 est localisé sur le chromosometéines [122, 168]. La fixation de p27 sur une CDK 12p13 [124]. Il a été cloné par divers groupes [122, 157,entraîne des changements de conformation du domaine 168] et son analyse structurale a été publiée en 1996catalytique de la CDK bloquant ainsi l’accès à l’ATP [137]. p27 a été découvert dans les cellules épithéliales de[137]. Par ailleurs, les trois protéines de cette famille CIP/ poumon de vison (Mv1 Lu) par Koff et Massagué lorsKIP dirigent les complexes cycline D/CDK vers le noyau. d’études concernant l’inhibition de la prolifération cellu- laire par TGF-β. Le TGF-β induit un arrêt des cellulesp21CIP1/WAF1 Mv1 Lu en fin de phase G1 et empêche la phosphorylationp21 est indispensable à l’arrêt du cycle cellulaire au point de pRb qui précède l’entrée en phase S dans les cellulesde contrôle G1 en réponse à des lésions de l’ADN [20]. en cycle. En avril 1993, Koff et Massagué ont démontréElle inhibe en effet la progression du cycle cellulaire en que ces effets étaient la conséquence de l’incapacité desse liant, par son domaine aminoterminal, aux complexes cellules traitées par TGF-β de former des complexescycline/CDK de la phase G1 et, par son domaine carboxy- cycline E/CDK2 actifs. C’est une protéine dénommée p27terminal, à l’antigène nucléaire PCNA, bloquant ainsi qui, en se liant aux complexes cycline E/CDK2, empêchel’activation de l’ADN polymérase δ [9]. Des études plus leur activation par phosphorylation de CDK2 sur larécentes ont montré que, parallèlement à cette action anti- Thr160.proliférative, p21 exerce aussi une action antiapoptotique[57, 159]. L’ARNm codant pour la protéine p21 est induit dans les Mécanismes d’action de p27fibroblastes durant la transition de G0 à G1 [81]. p21 se lie Dans les cellules quiescentes, les taux de p27 sont relati-aux complexes cycline D/CDK4 et cycline E/CDK2 vement élevés alors que ceux de p21 sont bas mais aug-durant la phase G1 donnant à penser qu’elle agirait mentent en réponse aux signaux mitogéniques durant lacomme un facteur d’union de la cycline et de la kinase. progression en G1. La stimulation de lymphocytes TAlors que les complexes ne contenant qu’une seule molé- humains par l’interleukine (IL)-2 entraîne une chute ducule de p21 sont actifs (activité catalytique), ceux qui en taux de p27 [36]. p27 chute lors de la stimulation decontiennent plusieurs sont inactifs et les changements macrophages par CSF1 (colony stimulating factor), maisdans la stœchiométrie de p21 sont suffisants pour rendre la costimulation de ces mêmes cellules avec des substan-compte de cette conversion [185]. En effet, des comple- ces analogues ou inducteurs d’AMPc augmente le taux dexes p21-CDK2-cycline A existent sous forme active ou synthèse de p27 empêchant l’activation des complexesinactive selon la stœchiométrie de p21, l’effet inhibiteur cyclines D/CDK et entraînant l’arrêt en G1 [63].
  11. 11. Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 119 Figure 7. Représentation schématique de la régulation des protéines CIP/KIP. Après stimulation mitogènique, les com- plexes cycline D/CDK séquestrent les protéines CIP/KIP ce qui empêche ces dernières d’inhiber les complexes cycline E/CDK qui dès lors peuvent phosphoryler pRb. Les facteurs transcriptionnels de la famille E2F sont alors libérés et aug- mentent la transcription du gène de la cycline E. Les comple- xes cycline E/CDK phosphorylent alors les protéines CIP/KIP qui vont être détruites par le protéasome. Quand la cellule entre en cycle, p27 est captée par les premier temps l’activité des complexes cycline D/CDKcomplexes cyclines D/CDK. La séquestration des molé- en permettant l’assemblage de la cycline D et de la CDKcules de p21 et de p27 libres (non liées) par les complexes et en stabilisant le complexe [12]. Dans un second temps,cycline D/CDK allège la contrainte des molécules CIP/ quand le nombre de molécules p27 fixées sur les comple-KIP sur les complexes cycline E/CDK2 facilitant ainsi xes cycline D/CDK augmente, l’effet d’inhibition est misl’activation de ces derniers (figure 7). Il y a une compéti- en jeu.tion entre les complexes cycline D/CDK et cycline La régulation de p27 est traductionnelle [52] et post-E/CDK2 vis-à-vis des protéines CIP/KIP. Dès que le pro- traductionnelle [110]. Quand des fibroblastes en prolifé-cessus de séquestration de ces protéines diminue le taux ration sont privés de sérum la synthèse de p27 augmente,de p27 « actif » en-dessous d’un seuil, le complexe mais p27 est également libérée des complexes cyclinecycline E/CDK2 facilite sa propre activation en phospho- D/CDK car la cycline D est dégradée. La perte de l’acti-rylant p27 en Thr187 déclenchant ainsi sa dégradation vité des CDK dépendantes des cyclines D couplée à[147, 170]. Les molécules résiduelles de p27 et de p21 l’inhibition de CDK2 par p27 induit l’arrêt en G1/S. L’uti-restent liées aux complexes cycline D/CDK tout au long lisation de nucléotides antisens dirigés contre la synthèsedes cycles successifs et le pool de ces molécules CIP/KIP de p27 peut empêcher les cellules de devenir quiescentesliées est libéré quand les facteurs de croissance sont reti- [13, 132].rés du milieu inhibant ainsi les complexes cycline E/CDKet arrêtant la cellule en phase G1. Dans les cellules épi- Rôles de p27 en pathologiethéliales de poumon de souris, le TGF-β inhibe la syn- Les souris knock-out pour p27 développent beaucoup dethèse de CDK4 [32] ce qui augmente le taux de p27 libre tumeurs notamment hypophysaires (avec 100 % de péné-(qui n’est pas captée par les complexes cycline D/CDK4) trance) [34]. Le nombre de tumeurs dépend du nombre dequi va donc se fixer sur les complexes cycline E/CDK2 copies du gène (les souris p27-/- développent plus dedonnant lieu à un arrêt en G1 [122]. Ainsi la captation de tumeurs que les souris p27-/+) [33]. De plus, les sourisp27 par les complexes cycline D/CDK4 permet de pro- knock-out pour p27 sont très sensibles aux agents carci-mouvoir l’activité kinase des complexes cycline E/CDK2 nogènes. La perte de l’expression de la protéine pourraitaidant à établir l’ordre d’activation. favoriser le développement et/ou la progression d’une Comme pour p21, la stœchiométrie de p27 détermine tumeur si bien que p27 a été étudié dans beaucoup de can-s’il est activateur ou inhibiteur. Les protéines CIP/KIP se cers. Néanmoins, à la différence des gènes suppresseurslient d’abord aux cyclines D ce qui permet l’assemblage de tumeurs, les anomalies (mutations, délétions homo-avec CDK4 ou CDK6 et conduit non pas à l’inhibition zygotes) concernant le gène sont exceptionnelles dans lesmais à l’activation et à la stabilisation du complexe. Dans tumeurs [124, 64]. En revanche, l’absence ou la diminu-des souris knock-out pour p27, les taux de complexes tion d’expression de p27 (ou l’augmentation de la dégra-cycline D1/CDK assemblés est diminué de plus de dix dation de p27) est un facteur pronostic péjoratif puissantfois [12]. En fait, les protéines CIP/KIP facilitent dans un dans plusieurs cancers (cancers du sein ou colorectaux par
  12. 12. 120 J.F. Viallard et al.exemple) [84]. À la différence des autres CKI dont locus INK4a/ARF) est remarquable par son organisationl’abondance est régulée par le taux de transcription de la génomique, puisqu’un exon est partagé par deux gènesprotéine, les taux de p27 sont surtout régulés par un méca- qui codent pour des protéines fonctionnellement différen-nisme post-traductionnel, c’est-à-dire par les voies qui tes (figure 8) [126, 160]. Alors que les virus utilisent sou-assurent sa dégradation [2]. La dégradation de p27 se fait vent cette organisation de gènes se chevauchant dans lepar la voie de l’ubiquitine et du protéasome [85] et néces- but d’optimiser au maximum les séquences codantes, unesite d’une part sa phosphorylation, et d’autre part son telle organisation est très inhabituelle dans le génometransfert du noyau vers le cytoplasme. Il existe donc une humain. En effet, le locus INK4a/ARF a une structurerégulation temporelle et spatiale. Dans une récente étude, pour le moment unique : un premier transcrit (correspon-Loda et al. montrent le caractère significativement péjo- dant à p16) est généré à partir d’un exon 1α et des exonsratif de l’absence de p27 chez des patients affectés d’un 2 et 3 [126, 160]. Un deuxième transcrit dénommécancer du côlon, et prouvent que cette perte d’expression p19ARF est également généré à partir des exons 2 et 3 maisde la protéine est liée non pas à une anomalie du gène aussi par un deuxième exon 1 situé 13 kb en amont demais à une forte activation des mécanismes de dégrada- l’exon 1α et dénommé exon 1β. La protéine appeléetion de la protéine [85]. Ce mécanisme est tout à fait ori- p19ARF (ARF pour alternative open reading frame) estginal et doit se vérifier dans d’autres tumeurs. donc traduite par un autre cadre de lecture [76]. Il n’y a Par ailleurs, p27 aurait un rôle dans la différenciation donc aucune homologie de p19ARF avec les protéines demais aussi dans la protection contre l’inflammation. la famille INK4. La protéine p19ARF a en revanche la pro-Récemment, Ophascharoensur et al. montrent que les priété de bloquer les cellules en phase G1 et G2, par unlésions de glomérulonéphrite induites expérimentalement mécanisme récemment élucidé (figure 8) [62, 123, 186].chez les souris knock-out pour p27 sont significativement La protéine p19ARF participe à la dégradation de la pro-plus importantes que chez les souris normales suggérant téine mdm2, cette dernière ayant pour fonction de bloquerun rôle de p27 dans la protection contre l’inflammation l’activité transactivatrice de p53 [149]. p19ARF serait donc[108]. un activateur indirect de p53 [62]. Récemment, plusieurs groupes ont montré que p19ARF inhibe la proliférationLa famille des inhibiteurs INK4 cellulaire en activant p53. En effet, les signaux de proli- fération émanant de l’expression de certains oncogènesLes protéines INK4 sont des polypeptides de 15 à 19 kDa (tels que myc, E1A, E2F1 ou ras V12) aboutissent à l’aug-qui partagent près de 40 % d’homologie entre elles. Elles mentation des taux de p19ARF permettant ainsi d’initiersont largement conservées parmi les espèces, les protéi- une cascade d’événements qui aboutissent à la stabilisa-nes murines ayant 90 % d’identité avec les protéines cor- tion et à l’activation de la protéine p53 [62, 123, 16]. Parrespondantes de l’homme. Elles sont composées de motifs contraste, les signaux qui régulent p16 restent à identifier.ankyrine plusieurs fois répétés qui jouent un rôle dans les Cependant, l’intérêt de ce locus INK4/ARF semble cru-interactions protéine–protéine [142]. Le troisième motif cial en cancérologie car il code pour deux protéines quiest crucial pour l’interaction des protéines INK4 avec interviennent dans deux voies différentes d’inhibition desCDK4 ou CDK6 [104]. Les signaux qui conduisent à la tumeurs, la voie de pRb et celle de p53.synthèse de ces protéines sont peu connus, mais il est clairpar exemple que p15INK4b est induite par le TGF-β et Fonctions des protéines INK4contribue à sa capacité d’induire un arrêt en phase G1 Les protéines INK4 se lient spécifiquement à CDK4 et à[130, 131]. p16 s’accumule progressivement au fur et à CDK6 et inhibent leur activité [148]. Rappelons quemesure que les cellules vieillissent, jouant un rôle proba- CDK4 et CDK6 sont liées aux cyclines D et ont pourble dans la sénescence [143, 188] alors que p18INK4C et substrat principal pRb [144]. Dans les cellules proliféran-p19ARF sont focalement exprimées durant le développe- tes, CDK4 (ou CDK6) existe sous trois formes [89] :ment fœtal jouant un rôle dans la différenciation termi- – un complexe de 450-kDa composé de CDK4 (ounale [188, 100]. CDK6) et de Hsp90/cdc37 ; – un complexe de 150-170-kDa composé d’une cyclineMécanismes transcriptionnels D, de CDK4 (ou CDK6), et de p21 ou p27 ;La région 9p21 comporte deux gènes codant pour – un complexe de 50 kDa composé de CDK4 (ou CDK6)p16INK4a et p15INK4b. Les deux gènes ont une homologie et d’une protéine INK4.de séquence très importante suggérant une duplication Dans les cellules quiescentes, CDK4 est complexéeancestrale, et sont situés à environ 30 kb l’un de l’autre. avec Hsp90/cdc37 [75, 158]. Au fur et à mesure de la pro-Le gène codant pour p15INK4b comporte deux exons et gression en phase G1, CDK4 forme des complexes avecgénère deux transcrits, p15 et p10, utilisant le même cadre les cyclines D nouvellement synthétisées et p21 ou p27de lecture. En revanche, le gène codant pour p16 (appelé (figure 7). Plus en avant dans le cycle, p27 est libérée des
  13. 13. Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 121 protéines CIP/KIP couplées aux cyclines D de l’autre côté pour l’association à CDK4 [115]. L’induction et l’aug- mentation des taux de p16 non seulement entraîne un déplacement des molécules nouvellement synthétisées de CDK4 vers p16, mais peut également provoquer la rup- ture des complexes CDK4/cdc37/Hsp90 déjà formés libé- rant CDK4 qui sera ainsi pris en charge par p16 (figure 9B). En conséquence, il y a augmentation du nombre de complexes CDK4/INK4, les cyclines D non liées étant alors rapidement dégradées par la voie du protéasome [21]. La perte des cyclines D empêche alors la séquestra- tion des molécules p27 qui peuvent alors exercer libre- ment leur action inhibitrice sur les complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2, entraînant l’absence de phosphorylation de pRb et donc un arrêt de la cellule en G1. La surexpression des protéines de la famille INK4 est donc responsable d’un arrêt des cellules en G1 mais d’une façon dépendante de l’intégrité de pRb [87, 94]. En effet, la perte de la fonction de pRb empêche la capacité de blo- cage en G1 des protéines INK4. La perte de pRb libère les molécules E2F ce qui a pour conséquence l’augmentation du taux et de l’activité des complexes cycline E/CDK2 [53, 55] qui phosphorylent p27 dont la protéolyse est alors accélérée (figure 10) [147, 170, 112]. Les cellules qui n’ont pas une pRb fonctionnelle ont des taux très élevés de p16, suggérant que pRb régule p16 négativement [114]. Dans une cellule normale, le taux de p16 est maxi- mal en phase S. En fait, il existe physiologiquement une boucle de régulation positive entre pRb et p16. Après phosphorylation par les complexes cycline D/CDK4 ouFigure 8. Représentation schématique du locus INK4a/ARF situé entre CDK6, pRb libère les facteurs de transcription qui acti-les gènes de l’interféron et le gène MTAP dans la région chromosomi- vent la transcription de p16. Ainsi, p16 se lie et dissocieque 9p21. Le locus INK4a/ARF code pour deux protéines différentes, les complexes cyclines D/CDK4 ou CDK6.p16INK4a et p19ARF. p16INK4a est codée par les exons 1α, 2 et 3 (rectan-gles noirs) ; p19ARF est codée par les exons 1β, 2 et 3 (rectangles hachu- Quand l’action inhibitrice des membres de la famillerés). p16INK4a se lie aux complexes cycline D/CDK4-6 et les inhibe CIP/KIP sur les complexes cycline E/CDK2 et cyclineempêchant ainsi la phosphorylation de pRb ce qui entraîne un arrêt descellules en G1. p19ARF interagit avec mdm2, protéine qui inhibe p53. En A/CDK2 est neutralisée, les CDK dépendantes des cycli-permettant la dégradation de mdm2, p19ARF active indirectement p53 et nes D ne sont plus utiles pour la progression dans le cycleentraîne un arrêt de la cellule en G1 et en G2. cellulaire (figure 11). Les cellules n’exprimant ni p27 ni p21 n’ont pas pour autant des cycles perturbés en dépit du fait que l’activité des kinases dépendantes des cyclines Dcomplexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2, événe- soit faible [12]. Inversement, l’activité des complexesment qui permet l’activation de ces complexes cycline cycline E/CDK2 est très élevée et pRb est périodiquementE/CDK2 et cycline A/CDK2 qui, en retour, peuvent d’une phosphorylée pendant le cycle même sur les sites préfé-part phosphoryler p27 et promouvoir sa dégradation, et rentiellement reconnus par CDK4 ou CDK6. De tellesd’autre part phosphoryler pRb. Alors les cellules peuvent cellules sont évidemment résistantes à l’action inhibitriceentrer en phase S (figure 7). de p16 mais pas à l’action de p27. En l’absence des mem- Alternativement, dans l’hypothèse d’une situation où bres de la famille CIP/KIP, la fonction de séquestrationune protéine INK4 serait exprimée, une CDK4 nouvelle- des complexes cyclines D/CDK est rendue superflue et lesment synthétisée peut entrer en contact avec une protéine kinases dépendantes des cyclines E et A sont suffisantesINK4 et former un hétérodimère inactif (figure 9A) mais pour phosphoryler pRb. Ainsi, de telles cellules tolèrentstable car CDK4 ne peut plus alors être recrutée dans un parfaitement une réduction de l’activité des kinasescomplexe actif avec la cycline D [43, 114]. Il y a donc dépendantes des cyclines D. Ces observations sont à rap-une compétition entre les protéines INK4 d’un côté et les procher de celles constatées chez les souris déficientes en
  14. 14. 122 J.F. Viallard et al. A Figure 9. A : une molécule CDK4 nouvellement synthétisée se lie à cdc37 et Hsp90. Si elle se complexe à une cycline D elle devient active ; si elle est liée à une protéine de la famille INK4 elle est inactive. B : l’induction et l’augmentation des taux de p16INK4a peut également provoquer la rupture des complexes CDK4/cdc37/Hsp90 déjà formés libérant CDK4 qui sera ainsi pris en charge par p16INK4a. En conséquence, il y a augmentation du nombre de complexes CDK4/INK4, avec arrêt de la séquestration des protéines de la famille CIP/KIP qui sont libérées et qui vont donc pouvoir inhiber les comple- B xes cycline E/CDK2.cycline D1 et/ou D2 qui sont viables en dépit de quelques cycline D1 par la cycline E permet de corriger les anoma-anomalies de développement [153, 154]. De récentes lies du développement de ces animaux et sont compati-observations démontrent que le remplacement de la bles avec l’idée que la cycline E peut fonctionner sans la cycline D1. LA NOTION DE CHECKPOINT Il existe plusieurs transitions au cours du cycle cellulaire. Une transition correspond à un changement unidirection- nel de la cellule qui se déplace d’un état où elle effectuait un certain nombre de processus vers un autre état où elle va effectuer d’autres processus. Comment ces transitions sont-elles coordonnées pour survenir à un temps bien pré- cis et dans un ordre bien défini ? Pour que les événements cellulaires se fassent dans un ordre voulu, il faut que cha- que étape précédant un événement soit complètement et correctement effectuée. Il existe des circuits de régulation qui sont des mécanismes de surveillance qui surveillentFigure 10. Dans les cellules déficientes en pRb, les facteurs de trans-cription E2F ne sont pas inhibés par pRb si bien que leur activité se fait l’achèvement de certains événements cruciaux pour lapleinement notamment sur la transcription de la cycline E. Cela entraîne cellule et ainsi autorisent la survenue d’une transition etune augmentation du nombre de complexes cycline E/CDK2 qui phos- la progression dans le cycle. Il y a deux classes de cir-phorylent les protéines CIP/KIP dont la dégradation s’accélère. Lescomplexes cycline D/CDK se désunissent et les protéines CDK4 sont cuits : les mécanismes intrinsèques opérant à chaquealors mobilisées dans des complexes avec p16INK4a. cycle cellulaire pour ordonner des événements succes-
  15. 15. Mécanismes molléculaires contrôlant le cycle cellulaire 123 Le checkpoint G1/S Chez les mammifères, les réponses vis-à-vis d’une lésion de l’ADN sont les mêmes que chez la levure avec en plus la possibilité d’entrer en apoptose (le but n’est pas la sur- vie d’une cellule endommagée mais la survie de l’orga- nisme). Le checkpoint en G1 en réponse à une lésion de l’ADN est le mieux connu. Trois gènes le contrôlent : ATM (ataxia telangiectasia mutated, le gène muté dans la maladie ataxie télangiectasie) [111, 140], p53 [83] et p21 [5]. p53 est le gène suppresseur de tumeur le plus fréquem- ment muté dans les cancers humains [150]. Il code pourFigure 11. La perte des protéines CIP/KIP a pour conséquence une un facteur de transcription qui est activé en réponse à unedésunion des complexes cycline D/CDK4-6 entraînant une destructiondes cyclines D et une séquestration des molécules CDK4 dans des com- lésion de l’ADN ou une perturbation du pool de nucléo-plexes avec p16INK4a. Il en résulte une augmentation de l’activité des tides. p53 activée est capable d’inhiber le cycle cellulairecomplexes cycline E/CDK2 ce qui suffit pour phosphoryler pRb et com- et de promouvoir l’apoptose [99]. Les cellules dépourvuespenser la perte des complexes cycline D/CDK. de p53 sont incapables de s’arrêter en phase G1 en réponse à une irradiation γ et ont une apoptose réduite. Une partie de la capacité de p53 à arrêter la cellule en phase G1 vient de l’activation de la transcription de p21sifs ; les mécanismes extrinsèques induits seulement pour inhibiteur des CDK qui contrôlent l’entrée en phase Sagir quand un défaut est détecté (altération de l’ADN par [29]. Les fibroblastes embryonnaires de souris qui n’ontexemple). La perte de ces voies de contrôle réduit la fidé- pas p21 ne s’arrêtent que partiellement en phase G1 sug-lité des événements cellulaires tels que la réplication et la gérant l’existence d’une autre voie dépendante de p53ségrégation chromosomiques. De telles altérations peu- permettant l’arrêt en phase G1. Cette voie est inconnue.vent conduire à une prolifération non contrôlée et à la can-cérisation. Le produit du gène ATM a été impliqué dans la régula- Checkpoint est le nom donné à des sous-unités particu- tion de p53. Ce gène, qui code pour une protéine kinase,lières de ces mécanismes intrinsèques et extrinsèques est muté dans le syndrome ataxie télangiectasie. Les cel-[48]. C’est une voie biochimique qui s’assure de la dépen- lules qui n’ont pas ce gène ont une activation réduite etdance d’un processus vis-à-vis d’un autre. Cette défini- retardée de p53 en réponse à une lésion de l’ADN [86].tion est large mais dans le langage scientifique courant, L’action de la protéine kinase ATM ne passe pas paron parle de checkpoint en référence au contrôle des tran- p19ARF. Lors d’une lésion de l’ADN, ATM phosphorylesitions du cycle cellulaire. Le mot conjugue à la fois un la partie N-terminale de p53 ce qui stabilise p53 et empê-terme de lieu (frontière) et un terme d’examen. Parfois le che sa dégradation [155]. D’autres kinases (telles que laterme est utilisé à la place du mot transition mais il devrait DNA-PK, DNA-dependent protein kinase) capables deêtre restreint aux voies biochimiques qui assurent la phosphoryler p53 ont été mises en évidence et joueraientdépendance d’un processus vis-à-vis d’un autre. Par le même rôle qu’ATM en réponse à des lésions de l’ADNexemple, le DNA-damage checkpoint est le mécanisme [179].qui détecte une altération de l’ADN et génère un signal L’activation de p53 (par l’expression d’oncogènes ouqui arrête les cellules dans la phase du cycle où elles se par lésions de l’ADN) est associée à une stabilisationtrouvent et induit la transcription de gènes réparateurs. La post-translationnelle de la protéine. Cette stabilisationposition d’arrêt dans le cycle dépend de la phase à résulte en partie de l’inhibition de la protéine mdm2 quilaquelle la lésion de l’ADN a lieu. Les checkpoints sont promouvoit la dégradation de p53 [73].des points de décision où des mécanismes de contrôle Le fait que les gènes codant pour p53 et ATM soientopèrent et empêchent la progression dans le cycle si les fréquemment mutés dans les cancers humains [54] sug-étapes précédentes n’ont pas été complètes ou si l’ADN gère que la fonction des checkpoints est importante dansest altéré. Ainsi, en G1, une cellule doit surveiller sa taille, la prévention des cancers. On en sait plus sur les check-la présence de nutriments et l’intégrité de son ADN avant points de la levure que chez l’homme et tout va dépendrede commencer le processus d’initiation de la synthèse des degrés de conservation entre les mécanismes ded’ADN. En G2 il existe un checkpoint qui, dans le cas où l’homme et de la levure. Cela dit, la perte de p21 entraînel’ADN est endommagé ou non répliqué, empêche la cel- peu de cancers [5, 20] et les mutations de p21 sont rareslule d’entrer en mitose. dans les tumeurs [152]. Donc le fait de dire que la perte

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