La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite amplificar pequeñas cantidades de ADN de manera masiva. Fue desarrollada por Kary Mullis en 1985 y ha revolucionado la biología molecular al permitir la producción rápida de grandes cantidades de una secuencia de ADN específica. La PCR en tiempo real utiliza sondas fluorescentes para cuantificar el ADN amplificado durante cada ciclo, proporcionando una medición cinética del proceso. Tiene numerosas aplicaciones en investigación, diagnóstico cl

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Dra. A. Villa Espinosa
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha sido la técnica más
revolucionaria de la biotecnología en los últimos 28 años y se ha convertido en
una importante plataforma analítica en la biología molecular.
La PCR se extendió rápidamente a miles de laboratorios, de investigación
básica, y de diagnóstico clínico ya que permitió producir in vitro grandes
cantidades de una secuencia de ADN concreta, y la amplificación selectiva de
cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Esta
técnica permite amplificar" pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles
y millones de veces.
Kary Banks Mullis
67 años
Bioquímico. Científico de Cetus
Premio Nobel de Química 1993
Lenoir, Carolina del norte, Estado Unidos,
Conocido por la invención de la técnica PCR
para amplificar secuencias de ADN en 1985
La PCR es una técnica que
consigue encontrar la aguja en el
pajar, al tiempo que produce un
pajar de agujas por amplificación
selectiva".

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También en 1985, Cetus se asoció con la corporación Perkin-Elmer e introdujo
la DNA Termal Cycler. En 1989, Cetus anunció acuerda colaborar con
Hoffman-LaRoche en el desarrollo y la comercialización de productos de
diagnóstico humanos in vitro y de servicios basados en tecnología de PCR.
En 1990, los científicos alcanzan la primera amplificación y detección
simultánea de las secuencias específicas de DNA usando un colorante
fluorescente, creando los principios de la PCR en tiempo real o PCR "cinético"
y en 1991 Hoffmann-La Roche Inc. adquiere los derechos y las patentes
mundiales de la PCR.
Una de las características más atractivas de la PCR es que la cantidad y
calidad de las muestras de DNA sujeta a amplificación no necesitan ser alta.
Una sola célula o un lisado celular crudo o especímenes con una longitud
promedio de unos pocos cientos de pares de bases son usualmente adecuadas
para una amplificación exitosa.
El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA
intacta que abarque la región que va a ser amplificada y que las impurezas
sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerización.
PCR EN TIEMPO REAL O PCR CUANTITATIVA
La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction;
qPCR o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR; RT-qPCR o RT-Q-PCR)
es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para
amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la
amplificación del los ácidos nucleícos
Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde
de ADN, al menos un par de cebadores específicos dNTPs, un tampón de
reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le
adiciona una sonda marcada con un fluoróforo que, en un termociclador con
sensores para medir fluorescencia, y capaz de excitar el fluoróforo a la longitud
de onda apropiada, permitirá medir la tasa de generación de uno o más
productos específicos.
Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por
esto que también se le denomina PCR EN TIEMPO REAL, es decir, PCR
inmediata, simultánea. En muchos casos el molde que se emplea para la PCR
cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN
complementario (cADN), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción del
ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa
o en tiempo real, o RT-qPCR. (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR).
Con esta técnica se consigue alta precisión y exactitud. También hay la
posibilidad de PCR múltiplex. No requiere de análisis posterior a la PCR
(electroforesis, etc.), lo que reduce la posibilidad de contaminación eliminando

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así fuentes potenciales de error. Se puede realizar un mayor número de
reacciones por día, pero el diseño de primers y sondas es más exigente.
El ciclo en el cual cantidad de producto de PCR es detectada o alcanza
un umbral preestablecido se denomina Cq La cuantificación relativa puede
determinarse en comparando el valor Cq del control de cuantificación, el valor
de los controles internos, con el de las muestras desconocidas. La cantidad de
gDNA y cDNA en las muestras, se puede evaluar con un grado razonable de
exactitud usando un buen control de cuantificación.
Aunque la determinación de la cantidad relativa es ampliamente
aceptada como un medio fiable de medir las diferencias entre las muestras, la
qPCR tiene la ventaja de determinar el número absoluto de copias de una
diana determinada. El método para la cuantificación absoluta se basa en la
construcción de una curva estándar y precisa empleando concentraciones
conocidas de controles externos.
Para determinar el número de copias absolutas que requiere el control
de cuantificación, la cantidad conocida ha de ser evaluada varias veces en el
mismo ensayo. Los valores Cq obtenidos de las diluciones pueden ser
utilizados para generar una curva estándar a partir de la cual la cantidad de
DNA o RNA en las muestras desconocidas pueden ser calculados. Se
requieren varios experimentos intra ensayos e inter ensayos para determinar
los coeficientes de variación y el patrón estadístico. El uso de controles
negativos y positivo de cuantificación, no excluye la necesidad de controles de
referencias endógenos apropiados, que supervisen los aspectos de la
preparación de la muestra, tales como el aislamiento de DNA y RNA y
eficiencia de la RT.
La incorporación de fluoróforos útiles para los sistemas de detección en
tiempo real, el desarrollo de instrumentos PCR que permiten la detección
cinética del producto acumulado, le ha proporcionando a la qPCR una mayor
sensibilidad en comparación con las PCR convencionales a tiempo final.

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La qPCR requiere el diseño de primer y sondas específicas que
produzcan amplificaciones de alta eficiencia: la eficiencia de la amplificación
puede determinarse E % = (10 (-- 1 / pendiente) -- 1) × 100 %, utilizando la
pendiente de una curva estándar (Cq versus log número de copias). Una
eficiencia de 100%, es definida por una pendiente de -3,32. Normalmente hay
que utilizar pares de primers que generen curvas de calibración con pendientes
entre -2,92 y -3,92 (Eficiencia = 100 ± 10%) Y un coeficiente de correlación R 2
cercano a 1.
La eficiencia de la qPCR se puede ver afectada por la complejidad del
material de partida que se amplifica. Esto incluye tanto la cantidad, como la
composición del fondo de ADN. PCR en tiempo real se inhibe a altas
concentraciones de fondo gDNA y / o en presencia de largas hebras de ADN
estructuralmente complejas.
Los plots de disociación se generan lentamente al final de la qPCR, por
el aumento de la temperatura de reacción y la disminución de la fluorescencia.
La disociación debe constar de un solo pico para indicar un solo producto, y el
pico de la curva debe corresponder a la temperatura de fusión esperada para el
amplicón. La fluorescencia que se produce es específica a la amplificación que
estemos estudiando, aunque se usen varios fluoróforos en la misma reacción
para detectar varios DNA o RNA al mismo tiempo.
Campo de aplicaciones de la PCR
- Permite muchos estudios de expresión génica
- Secuenciación directa de secuencias amplificadas
- Análisis de expresión diferencial de mRNA
- Detección de mutaciones
- Marcadores cuantitativos de cáncer
- Seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades
- Diagnósticos de enfermedades genéticas
- Diagnósticos de enfermedades infecciosas
- Cuantificación y genotipado de patógenos
- Cuantificación de carga microbiana alimentos o en material vegetal,
- La detección de OGM (organismos genéticamente modificados)
- Calidad alimentaria y pureza de origen
- Medio ambiente aguas residuales y profundas, aire, suelos, vectores
- En ciencia forense: identificación de restos biológicos,
- Determinación de paternidad,
- Pruebas periciales en criminalística
- En arqueología y paleontología
- Museos
- Agricultura, sanidad animal
- etc