Université Victor Segalen Bordeaux 2Année 2010                                                                            ...
THÈSE                                   pour le     DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2                 Mention : Sciences...
A mon père
Remerciements          Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de l’Unité Mixte de Recherche 1090 Génomique et Divers...
Aux « serristes », Kaelig et Denis, pour s’occuper de toutes nos bizarreries, pour leurs connaissances pour lesecours et l...
Liste des publications et des communications à des congrèsLabroussaa, F.; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & ...
Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N.*; Dubrana, M.P. & Saillard, C.La phosphoglycérate kinase inhibe linternalisation de S...
Table des matières
INTRODUCTIONI.   Les mollicutes .............................................................................................
2.3.2.    Libération de la vacuole .................................................................................... 42...
3.Recherche du site d’intégration du pGOTpgk dans le chromosome de S. citri ................ 83     3.1.   Approche par PC...
5.  Analyse des fragments d’ADN sur gel d’agarose ........................................................... 114   6.  Am...
10.     Etude des complexes protéines chez S. citri ............................................................... 133   ...
Introduction
Classification                     Guanine+Cytosine               Taille du génome                                Besoin e...
Introduction                                       IntroductionI. Les mollicutes        Les mollicutes sont des eubactérie...
Figure I.2: Arbre phylogénétique basé sur les séquences d’ADNr des Mollicutes.(D’après Sirand-Pugnet, 2007.)
Introductionleur morphologie hélicoïdale et leur motilité. Ils sont plus ou moins exigeants en stérols. Leshabitats des sp...
Introductionpar l’absence de paroi rigide à peptidoglycane ce qui les rend constitutivement résistants àtous les antibioti...
Introductionporte maintenant le nom de Candidatus Phytoplasma aurantifolia (Zreik et al., 1995).Depuis, 25 autres espèces ...
IntroductionStolbur phytoplasma (Marcone et al., 1999) avec une teneur en G+C de l’ordre de 25 à 30moles %. Depuis le séqu...
Introduction            2.2. Spiroplasma citri                     2.2.1. Description de la maladie et mise en culture    ...
Introduction       En plus d’être l’agent du stubborn des agrumes, S. citri est également responsable dela maladie des rac...
Introductionpaire de « kink » le long du corps cellulaire, structures générées par des changements del’hélicité du spiropl...
Introductioninstables, dans le sens où des phénomènes de recombinaisons homologues entre le vecteur etles copies virales p...
IntroductionIII. Transmission de microorganismes intracellulaires           1. Transmission par insecte vecteur           ...
Classe        Ordre           Famille           Genre                 Espèce              Pathogène                  Malad...
Introductionobtenir par prise de nourriture tandis que ce dernier fournit à la bactérie un milieu riche luipermettant de s...
Figure I.4: Phylogénie de l’ordre des Hemiptera basée sur les études de phylogénie moléculaire.(D’après Campbell et al., 1...
Introduction            1.2. Insectes vecteurs       Les insectes vecteurs de microorganismes appartiennent tous à l’embra...
Bactérie                                   Insecte vecteur              Famille taxonomique             Référence         ...
Introductionet al., 1983). Les vecteur identifiés dans le pourtour méditerranéen sont C. haematoceps(figure I.6) (Fos et a...
Figure I.6: Principaux insectes vecteurs de Spiroplasma citri.Photographies de Circulifer tenellus (à gauche) et de Circul...
IntroductionMalpighi. Ils sont au nombre de quatre chez les cicadelles et sont composés de cellulesépithéliales très mince...
Passage de la barrière intestinale        A                                                BA A: S. citri pénétrant dans l...
Introductionintestinal par un mécanisme d’endocytose/exocytose au cours duquel il se retrouve dans unevacuole d’endocytose...
Figure I.9: Représentation des principaux types de pili décrits chez les bactéries   àGram-négatif et à Gram-positif.(D’ap...
Introduction        Le succès d’une invasion réside dans les signaux que les deux acteurs, la cellule etl’agent pathogène,...
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  1. 1. Université Victor Segalen Bordeaux 2Année 2010 Thèse n° THÈSE pour le DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Mention : Sciences Biologiques et Médicales Option : Biologie-Santé Présentée et soutenue publiquement Le 20 Décembre 2010 Par Fabien LABROUSSAA Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques) INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRI ET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPS La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein » impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelleMembres du JuryM. BONNEU M., Professeur à l’IPB ENSTBB de Bordeaux ............................ PrésidentMme. BRAULT V., Directrice de Recherche à l’INRA de Colmar ................... RapporteurM. HEDDI A., Professeur à l’INSA de Lyon ..................................................... RapporteurMme. MARZACHI C., Chercheur à l’Institut de Virologie Végétale de Turin . ExaminateurM. LANDRY M., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 ............................... ExaminateurMme. SAILLARD C., Maître de Conférence à l’Université de Bordeaux 2 Directrice de thèse
  2. 2. THÈSE pour le DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Mention : Sciences Biologiques et Médicales Option : Biologie-Santé Présentée et soutenue publiquement Le 20 Décembre 2010 Par Fabien LABROUSSAA Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques) INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRIET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPSLa phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein » impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle
  3. 3. A mon père
  4. 4. Remerciements Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de l’Unité Mixte de Recherche 1090 Génomique et Diversitédu Pouvoir Pathogène (Institut National de la Recherche Agronomique et Université Victor Ségalen Bordeaux2), dirigé par Mr Alain Blanchard, sous la direction de Mme Colette Saillard. Je tiens tout d’abord à remercier Mr Blanchard pour m’avoir permis de réaliser ma thèse, ainsi que mesprécédents stages de Master 1 et 2, dans son laboratoire. Je souhaite également remercier Mr Bonneu de me faire l’honneur de présider ce jury. Je tiens à adresser mes plus sincères remerciements à Mme V. Brault et Mr A. Heddi d’avoir acceptéd’examiner et de juger ce manuscrit. Je remercie également Mme C. Marzachi et Mr M. Landry d’avoir accepté de participer à ce jury dethèse. Un grand merci à Colette pour m’avoir accompagné pendant ces quatre dernières années. Merci pourson encadrement de chaque instant, pour m’avoir laissé la liberté de m’exprimer pleinement dans mon travail.Merci également pour les nombreuses heures passées à la correction de ce manuscrit et aussi lors de chacune demes présentations orales. Si ces années de thèse ont été un réel plaisir pour moi, c’est en grande partie grâce àelle. J’espère que si j’avais à être le dernier thésard de ta carrière, j’aurais été à la hauteur de mes prédécesseurs. J’adresse aussi un grand merci à Joël et Sybille pour leur encadrement pendant mon stage de M1. Mercià Joël pour toutes les discussions scientifiques ou non, très utiles tout au long de ces années. Merci à Sybillepour son encadrement et sa rigueur qui m’ont apporté toutes les bases indispensables au travail de laboratoire.Merci à vous deux pour votre soutien. Je tiens à remercier Marie-Pierre pour sa formidable gentillesse et sa disponibilité sans failles. Mercipour m’avoir formé à toutes les techniques de Protéomique. Merci aussi pour m’avoir épargné de nombreusestaches chronophages (commandes, micro-injections des insectes, solutions, etc…). J’adresse un grand merci à Nathalie, ma nouvelle voisine de bureau, pour tout ce temps consacré auxmanips de microscopie confocale. Merci aussi pour les cellules de Circulifer haematoceps. Mon travail n’auraitpas été le même sans le tien. Promis ! A la fin de ma thèse, je te donne mon bureau que tu jalouses depuis cesderniers mois ! Je remercie énormément Laure, une des rares personnes au monde à se battre pour faire des testsstatistiques ! Merçi d’avoir consacrer du temps à l’éveil d’un néo-biochimiste. Je remercie ici une sourceintarissable d’idées, de conseils et de connaissances dans de nombreux domaines scientifiques. Je tiens également à remercier Michel Castroviejo pour avoir accepté de me prêter pour quelques heurestous ses appareils de chromato mais aussi pour sa gentillesse au cours de chacune de mes visites. Un grand Merci collectif et sincère à tout le labo « Molli ».Aux « IPPistes », Pascal SP, Claire et Guillaume et pour le travail sur Mycoplasma mycoïdes.A toute l’équipe « Phyto » au sens large : Xavier, Sylvie, Delphine, Anne, Gulnara, Sandrine, Christophe, Jam,Pascal S et Jean-Luc.A Jacqueline pour ces conseils et pour tous les autoclavages réalisés en « urgence ». 3
  5. 5. Aux « serristes », Kaelig et Denis, pour s’occuper de toutes nos bizarreries, pour leurs connaissances pour lesecours et le dépannage d’appareils défectueux, sans oublier leurs talents pour le barbecue ! Vous êtes dignes devotre illustre prédécesseur, Patrick, que je remercie également sincèrement pour son travail et sa personnalité.Aux secrétaires, Evelyne et Isa, pour leurs disponibilités et leurs sourires. Peut-être que j’arriverais un jour àvous pardonner pour les pérégrinations italiennes….Merci aussi à Marc, Laure, Clothilde et Cédric pour les moments « détente » : pause-café, Sodexo et quelquessoirées. Je me souviendrais encore longtemps des discussions non-scientifiques improbables et variées quianimaient ces moments-là. Merci à Marc pour m’avoir enseigné tous les secrets du « Bob Whitcomb Award » !J’ai une pleine bacholle de souvenirs, y’en aura de reste ! Je tiens à remercier Suzann pour avoir mis à ma disposition ses indéniables talents artistiques pour ledessin de Circulifer haematoceps. J’espère arriver à le mettre aussi bien en valeur que ce qu’il le mérite. Toutesles brèves discussions de fin d’après-midi étaient un réel plaisir. Je remercie également Lise et Laura pour leur travail au cours de leurs stages de M1. Bonne chance àvous pour la suite. Anne, Claire et Jam, compagnons de thèse, une pensée spéciale pour vous. Bonne chance pour la suite etj’espère qu’on aura la chance de se revoir plus tard dans quelques congrès sur quelques îles paradisiaques…. En résumé, un grand merci à vous tous qui m’avait permis d’évoluer dans un cadre agréable et propiceau travail et fait de ma thèse une superbe expérience et un tremplin pour ma carrière. Assez parlé travail ! Je remercie, du fond du cœur, mes parents qui m’ont toujours permis d’étudier en toute sérénité. Mercipour l’intérêt que vous avez toujours porté à mes études. Je vous en serais éternellement reconnaissant. Je remercie toute ma « famille ». Merci de votre soutien pendant toutes ces années et de m’avoir permisde m’échapper du monde de la Recherche à chaque fois. Yves, Marie-Lucienne, Ben, Carole, Arnaud (compagnonde galère…Courage !) et Poys, merci de m’avoir accueilli dans votre tribu et fait partager de si bons moments. Un grand merci à tous mes amis et plus particulièrement Flo, Céc, David, Camille et Lio. Que ce soit àParis, Brive, Seignosse ou Pau, il y avait toujours une bonne excuse pour fêter quelque chose ! Bonne nouvelle,voilà une nouvelle raison de faire la fête ! Même si mes recherches restent relativement floues et obscures pour beaucoup d’entre vous, je n’auraisrien réussi sans vous ! Une dernière pensée toute particulière pour Marie qui m’a supporté avant la thèse, pendant ma thèse(miracle !) et qui, j’espère, me supportera encore de longues années après. 4
  6. 6. Liste des publications et des communications à des congrèsLabroussaa, F.; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C.A minimal actin-binding region of the S.citri phosphoglycerate kinase is implicated in thetransmission process by the insect vector Circulifer haematoceps.Soumis à publication à Applied and Environmental Microbiology .Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C.Entry of Spiroplasma citri into Circulifer haematoceps cells involves interaction betweenspiroplasma phosphoglycerate kinase and leafhopper actin.Applied and Environmental Microbiology. 2010, 76(6); 1879-1886.Labroussaa, F., Arricau-Bouvery, N., Breton, M., Dubrana, M.P., Duret, S., Bové, J.M.,Renaudin, J. & Saillard, C*.Transmission of the phytopathogenic mollicute “Spiroplasma citri” by its leafhopper vector“Circulifer haematoceps” involves plasmid-encoded determinants and phosphoglycerate kinaseprotein from the spiroplasma.18th Conference of the International Oraganization of Citrus Virologists (IOCV), 8-12/11/2010,Campiñas (Brésil). COMMUNICATION ORALE.Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C.Deciphering the role of the Spiroplasma citri phosphoglycerate kinase in the internalization intoits insect vector cells.16ème colloque Biologie de l’Insecte, 18-20/09/2010, Lyon. COMMUNICATION ORALE.Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C.Interactions between Spiroplasma citri and its insect vector Circulifer haematoceps: the dual roleof the phosphoglycerate kinase.18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010,Chianciano (Italie). COMMUNICATION ORALE récompensée par le prix Robert Whitcomb.Béven, L., Bouyssou, G., Charenton, C., Dautant, A., Labroussaa, F., Sköllermo, A., Perrson,A., Blanchard, A. & Sirand-Pugnet, P.Putative membrane ATPase of mycoplasmas: a specific evolution of ATP synthase F1 subunit.18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010,Chianciano (Italie). POSTER.Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C.Transmission de S.citri par son insecte vecteur: rôle de la phosphoglycérate kinase dansl’invasion des cellules de l’hôte.10ème Journée scientifique de lEcole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 28/04/2010;Arcachon. POSTER.Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C.Interactions entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur, la cicadelle Circulifer haematoceps : ledouble jeu de la phosphoglycérate kinase.9ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 18-22/01/2010, Aussois. COMMUNICATION ORALE. 5
  7. 7. Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N.*; Dubrana, M.P. & Saillard, C.La phosphoglycérate kinase inhibe linternalisation de Spiroplasma citri dans les cellules enculture de son insecte vecteur Circulifer haematoceps.Congrès IMMUNINV; 21-23/10/2009; Poitiers. COMMUNICATION ORALE.Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N.Interactions protéine-protéine entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circuliferhaematoceps.1ère Journées des doctorants du Département SPE, 2-3/09/2009, Rennes. COMMUNICATIONORALE.Labroussaa, F. ; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N*.La phosphoglycérate kinase de Spiroplasma citri, une actin-binding protein impliquée danslinternalisation du spiroplasme dans les cellules de son insecte vecteur.7ème Colloque national de la Société Française de Phytopathologie (SFP); 08-11/06/2009; Lyon.COMMUNICATION ORALE.Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C.Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circuliferhaematoceps : identification de protéines dinsectes potentiellement impliquées dans latransmission.9ème Journée scientifique de lEcole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 08/04/2009;Arcachon. POSTER.Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C.Mise en évidence chez la cicadelle Circulifer haematoceps, de protéines potentiellementimpliquées dans la transmission de Spiroplasma citri.8ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 14-18/01/2008; Aussois. COMMUNICATION ORALErécompensée par le prix de la meilleure communication orale.Labroussaa, F. ; Bouvery, N. ; Dubrana-Ourabah, M.P. & Saillard, C*.Interaction between Spiroplasma citri and the actin cytoskeleton of its insect vectors salivarygland cells.17ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM); 06-11/07/2008;Tianjin (Chine). COMMUNICATION ORALE.Labroussaa, F. ; Dubrana-Ourabah, M.P.*; Bouvery, N. & Saillard, C.Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circuliferhaematoceps : identification de protéines dinsectes potentiellement impliquées dans latransmission.7ème Rencontre francophone de Mycoplasmologie; 17-18/07/2007; Lyon. COMMUNICATIONORALE.Bouvery, N.*; Labroussaa, F. ; Martin, E. ; Dubrana, M.P. ; Renaudin, J. & Saillard, C.Interaction entre les protéines de Spiroplasma citri et celles du cytosquelette des cellules desglandes salivaires de son insecte vecteur Circulifer haematoceps.15ème Colloque Physiologie de lInsecte; 09-11/07/2007; Rennes. COMMUNICATION ORALE.* auteur qui a présenté la communication ou le poster. 6
  8. 8. Table des matières
  9. 9. INTRODUCTIONI. Les mollicutes .................................................................................................................. 12 1. Taxonomie......................................................................................................................... 12 2. Phylogénie......................................................................................................................... 13 3. Evolution et caractéristiques importantes ......................................................................... 13II. Mollicutes phytopathogènes............................................................................................. 14 1. Phytoplasmes..................................................................................................................... 15 2. Spiroplasmes phytopathogènes ......................................................................................... 16 2.1. Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii.................................................... 16 2.2. Spiroplasma citri ....................................................................................................... 17 2.2.1. Description de la maladie et mise en culture..................................................... 17 2.2.2. Caractéristiques de S. citri................................................................................. 18 2.2.3. S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration d’outils génétiques............... 19III. Transmission de microorganismes intracellulaires .......................................................... 21 1. Transmission par insecte vecteur ...................................................................................... 21 1.1. Relation entre le microorganisme et son insecte ....................................................... 21 1.1.1. Transmission externe......................................................................................... 21 1.1.2. Transmission intracellulaire .............................................................................. 21 1.1.3. Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes............................................... 22 1.2. Insectes vecteurs........................................................................................................ 23 1.2.1. Vecteurs mollicutes phytopathogènes ............................................................... 23 1.2.1.1. Classification................................................................................................. 23 1.2.1.2. Vecteurs de S. citri ........................................................................................ 23 1.2.1.3. Morphologie des cicadelles ........................................................................... 24 1.2.2. Circuit du spiroplasme dans l’insecte................................................................ 25 2. Cycle cellulaire de la transmission.................................................................................... 26 2.1. Adhésion.................................................................................................................... 27 2.1.1. Adhésines de type fibrillaire ............................................................................. 27 2.1.1.1. Bactéries à Gram-négatif............................................................................... 27 2.1.1.2. Bactéries à Gram-positif................................................................................ 29 2.1.2. Adhésines de type non-fibrillaire ...................................................................... 30 2.1.2.1. Autotransporteurs .......................................................................................... 30 2.1.2.2. Effecteur Tir (translocated intimin receptor) ................................................ 30 2.1.2.3. Hémagglutinine filamenteuse (FHA) ............................................................ 31 2.1.2.4. Système de sécrétion de type 3 (SSTT) ........................................................ 31 2.1.3. Adhésion chez les mollicutes ............................................................................ 33 2.1.3.1. Mycoplasmes................................................................................................. 33 2.1.3.2. Phytoplasmes................................................................................................. 33 2.1.3.3. Spiroplasmes ................................................................................................. 35 2.2. Internalisation............................................................................................................ 35 2.2.1. Voie clathrine-dépendante................................................................................. 35 2.2.2. Phagocytose....................................................................................................... 36 2.2.2.1. « Zipper » mécanisme ................................................................................... 36 2.2.2.2. « Trigger » mécanisme.................................................................................. 37 2.2.2.3. Voie dépendante des microtubules................................................................ 37 2.2.3. Mycoplasmes..................................................................................................... 38 2.2.4. Virus .................................................................................................................. 39 2.2.5. Franchissement de la barrière des glandes salivaires ........................................ 40 2.3. Echappement à la machinerie lysosomiale................................................................ 41 2.3.1. Arrêt de la maturation des phagosomes ............................................................ 41 7
  10. 10. 2.3.2. Libération de la vacuole .................................................................................... 42 2.3.3. Détournement du système lysosomial............................................................... 42 2.4. Dissémination dans l’hôte ......................................................................................... 42 3. Déterminants génétiques de la transmission de Spiroplasma citri.................................... 43 3.1. Transmission expérimentale de S. citri ..................................................................... 43 3.2. Identification de protéines chez S. citri candidates dans la transmission.................. 44IV. Situation du sujet et objectifs de recherche ...................................................................... 46CHAPITRE 1: Interactions protéine-protéine entre S. citri et son insecte vecteur CirculiferhaematocepsI. Introduction et objectifs ................................................................................................... 48II. Résultats et discussion...................................................................................................... 51 1. Publication 1...................................................................................................................... 51 2. Résultats supplémentaires ................................................................................................. 52 2.1. Identification de protéines d’insectes impliquées dans une interaction avec S. citri 52 2.1.1. Comparaison des far Western monodimensionnels (1-D) réalisés avec les protéines totales et de glandes salivaires d’insectes.......................................................... 52 2.1.2. Far Western bi-dimensionnel (2-D) avec les protéines totales et celles des glandes salivaires d’insectes.............................................................................................. 53 2.1.3. Identification des protéines d’insectes impliquées par spectrométrie de masse 54 2.1.3.1. Signaux d’interaction communs aux deux far Western. ........................... 54 Signal d’interaction à 42 kDa : l’actine..................................................................... 54 Signal d’interaction à 50 kDa : la tubuline................................................................ 55 Signal d’interaction à 25 kDa : Rab GTPases ........................................................... 56 2.1.3.2. Signal spécifique du far Western réalisé avec les protéines des glandes salivaires d’insectes....................................................................................................... 57 Signal d’interaction à 27 kDa : la protéine 14-3-3 .................................................... 57 2.2. Recherche et identification du partenaire de l’actine chez S. citri ............................ 57 2.2.1.1. Transmembrane conserved hypothetical lipoprotein (SPICI 03-098)........... 58 2.2.1.2. La phosphoglycérate kinase (PGK)............................................................... 59III. Conclusion........................................................................................................................ 59CHAPITRE 2: Caractérisation de la région minimale de liaison à l’actine de la PGK de S. citri etimplication dans la transmissionI. Introduction et objectifs ................................................................................................... 62II. Résultats et discussion...................................................................................................... 64 1. Publication 2...................................................................................................................... 64 2. Résultats supplémentaires et discussion............................................................................ 74 2.1. Recherche du mécanisme d’interaction entre la PGK et l’actine.............................. 74 2.2. Recherche d’homologie de séquences chez la PGK d’autres organismes. ............... 76 2.3. Localisation de la PGK ............................................................................................. 77III. Conclusion........................................................................................................................ 78CHAPITRE 3: Réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de phosphoglycérate kinaseI. Introduction ...................................................................................................................... 80II. Résultats ........................................................................................................................... 81 1. Construction du vecteur pGOTpgk ................................................................................... 81 2. Obtention et sélection des clones délétés dans le gène pgk............................................... 82 8
  11. 11. 3.Recherche du site d’intégration du pGOTpgk dans le chromosome de S. citri ................ 83 3.1. Approche par PCR pour détecter une intégration au niveau de l’OriC ou du promoteur de la spiraline....................................................................................................... 84 3.2. Approche par PCR « aléatoire »................................................................................ 84 4. Identification des gènes dans le chromosome de S. citri ayant subi l’intégration ............ 85III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 86CHAPITRE 4: Étude préliminaire de complexes protéiques impliqués dans la transmission deS.citri par l’insecte vecteurI. Introduction et objectifs ................................................................................................... 88II. Résultats et discussion...................................................................................................... 90 1. Recherche de complexes par la technique de BN-PAGE chez S. citri. ............................ 90 1.1. Extraction et analyse des complexes membranaires. ................................................ 91 1.2. Extraction et analyse des complexes cytosoliques. ................................................... 92 2. Recherche chez S. citri des complexes impliquant la PGK .............................................. 94 2.1. Protéines associées à la PGK dans des complexes connus ....................................... 96III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 99DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVESI. Hypothèses concernant le cycle de S. citri dans linsecte C. haematoceps .................... 102 1. Franchissement de la barrière de lépithélium intestinal ................................................. 102 2. Franchissement de la barrière des glandes salivaires ...................................................... 102 2.1. Franchissement de la lame basale des glandes salivaires........................................ 102 2.2. Adhésion au plasmalemme des glandes salivaires .................................................. 103 2.3. Internalisation dans les cellules des glandes salivaires ........................................... 104 2.4. Devenir des vésicules dendocytose contenant S. citri ............................................ 105 2.5. Libération dans le canal salivaire ............................................................................ 105II. Perspectives .................................................................................................................... 106MATERIELS ET METHODESI. Matériel biologique ........................................................................................................ 109 1. Spiroplasma citri : souches et conditions de culture....................................................... 109 2. Escherichia coli : souches et utilisation .......................................................................... 109 3. L’insecte vecteur : la cicadelle Circulifer haematoceps ................................................. 110 3.1. Origine et conditions d’élevage............................................................................... 110 3.2. Capture et dissection des cicadelles ........................................................................ 110 3.3. Obtention d’une lignée cellulaire ............................................................................ 111II. Plasmides........................................................................................................................ 111 1. Commerciaux .................................................................................................................. 111 1.1. pBS .......................................................................................................................... 111 1.2. pET28a(+) ............................................................................................................... 112 2. Obtenus au laboratoire .................................................................................................... 112 2.1. pGOT1..................................................................................................................... 112III. Méthodes d’analyse d’ADN........................................................................................... 113 1. Purification de l’ADN génomique de S. citri.................................................................. 113 2. Purification de l’ADN plasmidique................................................................................. 113 3. Purification de fragments d’ADN à partir de gel d’agarose............................................ 113 4. Hydrolyse par les endonucléases de restriction............................................................... 114 9
  12. 12. 5. Analyse des fragments d’ADN sur gel d’agarose ........................................................... 114 6. Amplification d’ADN par PCR....................................................................................... 114 7. Mutagénèse dirigée ......................................................................................................... 115 8. Clonage de fragment d’ADN amplifié par PCR ............................................................. 115 8.1. Préparation du fragment PCR ................................................................................. 115 8.2. Préparation du vecteur............................................................................................. 116 8.3. Ligation du fragment PCR et de son vecteur .......................................................... 116 9. Transformation des bactéries .......................................................................................... 116 9.1. E. coli ...................................................................................................................... 116 9.1.1. Electrocompétentes ......................................................................................... 116 9.1.2. Chimiocompétentes......................................................................................... 117 9.2. S. citri ...................................................................................................................... 118 10. Marche sur le chromosome ......................................................................................... 118IV. Méthodes d’analyse des protéines.................................................................................. 119 1. Extraction des protéines .................................................................................................. 119 1.1. Préparation des protéines de S. citri ........................................................................ 119 1.1.1. Protéines pour l’électrophorèse mono-dimensionnelle ................................... 119 1.1.2. Protéines pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle ......................................... 120 1.1.3. Fractionnement des protéines membranaires .................................................. 120 1.2. Préparation des protéines de C. haematoceps ......................................................... 120 1.2.1. Totales ............................................................................................................. 120 1.2.2. Glandes salivaires............................................................................................ 121 1.2.3. Pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle......................................................... 121 2. Production de protéines recombinantes tagguées His6 .................................................... 121 2.1. His6-PGK................................................................................................................. 121 2.2. His6 PGK FL1, 2, 3, 4, 5 ......................................................................................... 122 3. Purification des protéines par chromatographie liquide.................................................. 123 3.1. Colonne de protein A Sépharose CL-4B................................................................. 123 3.2. Purification de protéines recombinantes ................................................................. 124 3.2.1. IMAC (immobilized metal affinity chromatography)..................................... 124 3.2.2. Chromatographie d’exclusion ......................................................................... 125 3.2.3. Fractionnement sur colonne échangeuse d’ions.............................................. 126 4. Dosage des protéines ....................................................................................................... 126 4.1. Bradford .................................................................................................................. 126 4.2. Bradford modifié ..................................................................................................... 126 5. Séparation des protéines en gel d’électrophorèse ........................................................... 127 5.1. Electrophorèse mono-dimensionnelle ..................................................................... 127 5.1.1. Gels de polyacrylamide à concentration constante ......................................... 127 5.1.2. Gels en gradient de polyacrylamide 4-15 % ................................................... 127 5.2. Electrophorèse bi-dimensionnelle ........................................................................... 128 6. Visualisation des protéines après électrophorèse ............................................................ 129 6.1. Coloration au bleu colloïdal .................................................................................... 129 6.2. Coloration au nitrate d’argent classique.................................................................. 129 6.3. Coloration au nitrate d’argent compatible avec la spectrométrie de masse ............ 130 6.3.1. Méthode O’Connell et al, 1997....................................................................... 130 6.3.2. Kit Proteosilver™ Silver Stain........................................................................ 130 7. Transfert des protéines et détection immunologique ...................................................... 131 7.1. Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose............................... 131 7.2. Détection immunologique des protéines sur membrane ......................................... 131 8. Etude d’interaction protéine-protéine par la technique de far Western .......................... 132 9. Identification des protéines par spectrométrie en masse................................................. 132 10
  13. 13. 10. Etude des complexes protéines chez S. citri ............................................................... 133 10.1. Technique de Blue-Native PAGE ....................................................................... 133 10.1.1. Préparation des protéines ................................................................................ 133 10.1.2. Electrophorèse des protéines ........................................................................... 133 10.1.2.1. 1ère dimension ............................................................................................ 133 10.1.2.2. 2ème dimension........................................................................................... 134 10.2. Pontage des complexes protéiques associant la PGK chez S. citri ..................... 134 10.2.1. Préparation des protéines ................................................................................ 134 10.2.2. Purification sur colonne de Nickel .................................................................. 135V. Etude de la transmission expérimentale de S. citri......................................................... 135 1. Transmission à la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus................................ 135 1.1. Insectes .................................................................................................................... 135 1.2. Les pervenches de Madagascar ............................................................................... 135 1.3. Micro-injection intra-abdominale des cicadelles .................................................... 135 1.4. Transmission à la pervenche de Madagascar .......................................................... 136 1.5. Symptomatologie .................................................................................................... 136 2. « Recrachage » à travers une membrane de Parafilm® .................................................. 137 2.1. Injection de la culture de S. citri GII3 dans l’insecte .............................................. 137 2.2. Injection des protéines recombinantes dans l’insecte ............................................. 137 2.3. Transmission à travers une membrane de Parafilm® ............................................. 137 2.4. Mise en culture des spiroplasmes à partir des insectes ........................................... 137 3. Effet de la PGK et des peptides sur l’adhésion et/ou l’internalisation............................ 138 3.1. Adhésion.................................................................................................................. 138 3.2. Internalisation.......................................................................................................... 138 4. Observations au microscope confocal............................................................................. 139 4.1. Glandes salivaires de C. haematoceps infectées ..................................................... 139 4.2. Cellules de C. haematoceps incubées avec la His6-PGK ........................................ 140REFERENCES………………………………………………………………………………….141 11
  14. 14. Introduction
  15. 15. Classification Guanine+Cytosine Taille du génome Besoin en (moles %) (kpb) Cholestérol Tween 80Ordre I: MYCOPLASMATALES Famille I: MYCOPLASMATACEAE Genre I: Mycoplasma 23-40 580-1350 Oui Non Genre II: Ureaplasma 27-30 760-1170 Oui NonOrdre II: ENTOMOPLASMATALES Famille I: ENTOMOPLASMATACEAE Genre I: Entomoplasma 27-29 790-1140 Oui Non Genre II: Mesoplasma 27-30 870-1100 Non Oui Famille II: SPIROPLASMATACEAE Genre I: Spiroplasma 25-30 780-2220 Oui∗ ∗ NonOrdre III: ACHOLEPLASMATALES Famille: ACHOLEPLASMATACEAE Genre: Acholeplasma 26-36 1500-2085 Non Non Candidatus Phytoplasma 25-30 600-1240Ordre IV: ANAEROPLASMATALES Famille: ANAEROPLASMATACEAE Genre I: Anaeroplasma 29-34 1500-1600 Oui Non Genre II: Asteroleplasma 40 1500 Non NonTableau I.1: Classification des membres de l’ordre des Mollicutes.∗: S. floricola, S. apis, S. chinense, et les spiroplasmes du groupe XII peuvent se multiplier dans un milieu sans sérum. (Rose et al., 1993)
  16. 16. Introduction IntroductionI. Les mollicutes Les mollicutes sont des eubactéries sans paroi présents chez l’homme, les animaux, lesinsectes et les plantes. Leur découverte date de la fin du 19ème siècle lorsque Nocard et Rouxcultivèrent pour la première fois l’agent de la péripneumonie contagieuse bovine,Mycoplasma mycoïdes (Nocard & Roux, 1898). Ce nom de mycoplasme ne sera donné qu’en1929 par Nowak, à la suite de l’apparition de filaments évoquant des formes mycéliennes quiapparaissent au cours de la culture de cette bactérie. Ce n’est qu’en 1967 que l’ensemble desmycoplasmes fut regroupé dans la classe des Mollicutes (Edward & Freundt, 1967). 1. Taxonomie La classe des Mollicutes est constituée de plusieurs centaines d’espèces réparties en 4ordres, eux-mêmes répartis en 5 familles et 8 genres (Tableau 1.1 ; (Tully et al., 1993; Razinet al., 1998)). L’ordre des Mycoplasmatales est constitué d’une seule famille, la famille desMycoplasmataceae comprenant deux genres: le genre Mycoplasma et le genre Ureaplasma.Dans cet ordre, les organismes ont besoin de cholestérol pour leur croissance et sontmajoritairement aérobies. Les mollicutes du genre Ureaplasma ont la capacité d’hydrolyserl’urée. Leurs hôtes sont préférentiellement l’homme et les animaux. L’ordre des Acholeplasmatales comprend une seule famille, les Acholeplasmataceae,ne contenant que le genre Acholeplasma dont les organismes n’ont pas besoin de cholestérolpour leur croissance. Ces organismes sont quant à eux présents chez les mammifères, lesinsectes et les plantes. L’ordre Anaeroplasmatales regroupe des bactéries, anaérobies, isolées uniquement dela panse des ruminants et classées en une famille, les Anaeroplasmataceae, comprenant deuxgenres. Les membres du genre Anaeroplasma ont besoin de cholestérol pour leur croissancecontrairement aux membres du genre Asteroleplasma. Les Entomoplasmatales sont des mollicutes isolés de la surface de plantes etd’arthropodes. Cet ordre est scindé en deux familles : la famille des Entomoplasmataceae,constituée des deux genres Mesoplasma et Entomoplasma, et celle des Spiroplasmataceae,représentée par un seul genre, le genre Spiroplasma. Les spiroplasmes sont caractérisés par 12
  17. 17. Figure I.2: Arbre phylogénétique basé sur les séquences d’ADNr des Mollicutes.(D’après Sirand-Pugnet, 2007.)
  18. 18. Introductionleur morphologie hélicoïdale et leur motilité. Ils sont plus ou moins exigeants en stérols. Leshabitats des spiroplasmes sont les invertébrés, la surface des plantes mais également, pourtrois d’entre eux uniquement, les tubes criblés du phloème. De nombreux mollicutes n’ont pas encore été cultivés en milieu acellulaire. De ce fait,leur statut taxonomique n’a pu être établi selon les standards minimaux de définitiond’espèce. C’est en particulier le cas des phytoplasmes qui se multiplient dans les insectes etles tubes criblés du phloème. 2. Phylogénie Des études phylogénétiques basées sur l’ADN 16S de ces bactéries ont montré que lesmollicutes ont évolué de manière régressive à partir d’un ancêtre bactérien à Gram-positif et àfaible pourcentage en base G+C (Woese, 1987). Cet ancêtre serait commun avec certainesClostridia, comme Clostridium innocuum et Clostridium ramosum, dont ils partagent lapropriété d’être insensible à la rifampicine (Gadeau et al., 1986). Cette évolution régressiveest marquée notamment par une réduction de la taille de leur génome engendrée par la pertemassive de gènes non essentiels à l’autoréplication. Ces études ont également permis de situer les phytoplasmes par rapport aux autresmollicutes (Woese, 1987). Selon ces critères, les phytoplasmes sont apparentés auxacholéplasmes. De manière plus surprenante, les mycoplasmes du groupe mycoïdes, ainsi queMycoplasma capricolum, appartiennent à la même branche phylogénétique que lesspiroplasmes, bien que se trouvant dans des ordres différents dans la classificationtaxonomique. La classification phylogénétique des mollicutes est représentée figure I.2 où cesderniers sont regroupés en 4 groupes phylogénétiques distincts : les groupes pneumoniae,hominis, spiroplasma et phytoplasma/acholeplasma (Sirand-Pugnet et al., 2007). 3. Evolution et caractéristiques importantes Il a été suggéré que les mollicutes évoluent plus rapidement que les autres bactéries(Woese et al., 1984). Cette vitesse d’évolution rendrait compte de leur positionnement sur lesplus longues branches de l’arbre universel de la vie (Ciccarelli et al., 2006). De plus, leurévolution par la perte de certains gènes a influencé certaines propriétés particulièrescommunes à ces bactéries (tableau I.1). En effet, les mollicutes se distinguent en premier lieu 13
  19. 19. Introductionpar l’absence de paroi rigide à peptidoglycane ce qui les rend constitutivement résistants àtous les antibiotiques ayant pour cible la paroi bactérienne. Ils se caractérisent également parune taille de génome réduite qui varie de 580 kpb pour Mycoplasma genitalium à 2200 kpbpour Spiroplasma ixodetis. Ils possèdent un nombre limité de voies métaboliques ce quiimplique que leur culture in vitro ne peut être obtenue que dans un milieu complexe contenantnotamment du sérum d’origine animale. De plus, l’adaptation de ces organismes à des nichesécologiques précises a certainement joué un rôle prépondérant au cours de leur évolutionentraînant notamment la perte de la capacité à synthétiser certains acides aminés (Pollack etal., 1996) voire la totalité dans le cas de Spiroplasma citri (Chang & Chen, 1981). Leur pourcentage de moles de paires de bases G+C est faible, de 23 à 41 % (Razin etal., 1998). De ce fait, les mollicutes ont développé un biais dans l’utilisation des codons. Pourun même acide aminé, les codons terminés par A ou T sont utilisés préférentiellement à ceuxterminés par G ou C (Razin et al., 1998). Dans tous les genres, hormis le genre Acholeplasma,le tryptophane est codé par le codon UGA et, dans une moindre proportion par le codon UGG(Renaudin et al., 1986; Blanchard, 1990). UGA étant un codon de terminaison dans le codegénétique universel, l’expression de protéines dans un système hétérologue de productioncomme Escherichia coli, s’avère impossible sans muter l’ensemble de ces codons dans lesgènes correspondants. Les mollicutes sont présents dans des habitats très variés, mais toujours associés à unhôte vivant, que ce soit l’homme, l’animal (mammifère, poisson, oiseau, insecte) ou la plante(Razin et al., 1998). En milieu naturel, ces organismes sont des parasites obligatoires et, à cetitre, peuvent posséder un ou plusieurs hôtes. Les mollicutes phytopathogènes ont, de ce fait,deux hôtes que sont la plante et l’insecte vecteur par lequel ils sont transmis.II. Mollicutes phytopathogènes C’est en 1967 qu’une équipe japonaise observe pour la première fois, en microscopieélectronique, des organismes ressemblant à des mycoplasmes dans les tubes criblés d’uneplante atteinte de jaunisse (Doi et al., 1967). Ces organismes ont alors été nommés MLO pourMycoplasma-Like Organism. Le comité de taxonomie des mycoplasmes a repris, en 1994, laproposition de Murray et Schleifer (Murray & Schleifer, 1994) de désigner, sous le nom degenre Candidatus Phytoplasma, les différents groupes phylogénétiques des phytoplasmes(IRPCM., 2004). Le phytoplasme associé à la maladie des balais de sorcières du limettier duSultanat dOman est le premier phytoplasme pour lequel cette proposition a été retenue. Il 14
  20. 20. Introductionporte maintenant le nom de Candidatus Phytoplasma aurantifolia (Zreik et al., 1995).Depuis, 25 autres espèces de Candidatus Phytoplasma ont été décrites (Hogenhout et al.,2008). Les mollicutes phytopathogènes regroupent aujourd’hui les phytoplasmes appartenantau genre Candidatus phytoplasma et les spiroplasmes appartenant au genre Spiroplasma. Lesphytoplasmes sont les plus nombreux et les plus importants du point de vue économique.Cependant, ils résistent toujours à la mise en culture. En revanche, trois espèces despiroplasmes phytopathogènes sont connues et disponibles en culture pure : Spiroplasma citri,Spiroplasma kunkelii et Spiroplasma phoeniceum. Parmi ceux-là, S. citri a fait l’objet denombreuses études biologiques et biochimiques et est devenu un organisme modèle pourl’étude des mollicutes phytopathogènes (Garnier et al., 2001; Bove et al., 2003). 1. Phytoplasmes Au niveau mondial, les phytoplasmes sont responsables de plus de 300 maladies deplantes appartenant à plus de 100 familles botaniques différentes (McCoy et al., 1989). Les symptômes provoqués sur les plantes infectées sont variables et incluent desjaunisses foliaires, un enroulement et/ou une diminution de la taille des feuilles, unevirescence (pétales non segmentés), une phyllodie (morphologie foliaire des sépales), laprolifération de bourgeons axillaires, un raccourcissement des entre-nœuds, etc…. Les pertes économiques provoquées par des infections à phytoplasmes sontimportantes dans nos régions françaises lorsque ces infections touchent des cultures pérennescomme la Flavescence dorée de la vigne (Daire et al., 1993b), la maladie du Stolbur (Daire etal., 1993a), l’enroulement chlorotique de l’abricotier (Jaraush et al., 1999) et la maladie de laprolifération du pommier (Lee et al., 2000). L’analyse de leur ADN ribosomique 16S a permis de démontrer que ces organismessont phylogénétiquement proches des acholéplasmes (Lim & Sears, 1989; Seemüller et al.,1994) avec lesquels ils partagent l’utilisation du code génétique universel contrairement auxautres mollicutes (Lim & Sears, 1992). Le séquençage systématique de leurs ARNr 16S,associé à la mise au point de techniques de RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism), ont permis d’établir une classification des phytoplasmes (Lee et al., 1998). Les premières données disponibles sur le génome des phytoplasmes révèlent, en sebasant sur des études d’électrophorèse en champ pulsé, que celui-ci aurait une taille compriseentre 530 kpb pour le Bermuda grass white leaf phytoplasma, et 1350 kpb pour le Tomato 15
  21. 21. IntroductionStolbur phytoplasma (Marcone et al., 1999) avec une teneur en G+C de l’ordre de 25 à 30moles %. Depuis le séquençage, en 2004, de Candidatus Phytoplasma asteris souche OnionYellows (OY) (Oshima et al., 2004), trois nouveaux génomes sont disponibles dont celui deCandidatus Phytoplasma asteris Aster Yellows (AY) (Bai et al., 2006), CandidatusPhytoplasma australiense (Tran-Nguyen et al., 2008) et Candidatus Phytoplasma mali (Kubeet al., 2008). La taille du génome de Candidatus Phytoplasma australiense est d’environ 20kpb supérieure à ceux des deux phytoplasmes de l’ordre des Candidatus Phytoplasma asterisqui atteignent environ 860 kpb. De ce fait, son génome possède environ 200 gènes « souche-spécifique », qui ne sont pas présents chez les deux autres phytoplasmes séquencés, et quicodent de nombreuses protéines hypothétiques mais aussi des transposases ou encore desintégrases (Tran-Nguyen et al., 2008). Le génome de Candidatus Phytoplasma mali a révéléune caractéristique particulière par rapport aux autres phytoplasmes déjà séquencés. En effet,son génome de 600 kpb est linéaire. De plus, l’analyse des régions codantes de ce dernier arévélé que la voie de la glycolyse, principale source d’énergie d’un organisme, est incomplèteet, de plus, aucune ATP synthase de type F n’a été retrouvée (Kube et al., 2008). 2. Spiroplasmes phytopathogènes 2.1. Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii Spiroplasma phoeniceum a été isolé en 1986 de pervenches de Madagascar atteintes dejaunisse provenant de Syrie (Saillard et al., 1987). Il provoque des symptômes très similairesà ceux observés sur des plantes infectées par S. citri. Il appartient au sérogroupe I-8 de ladernière classification des spiroplasmes établie en 1998 (Williamson et al., 1998). Songénome de 1860 kpb (Carle et al., 1995) possède 26 % de bases G+C (Saillard et al., 1987).Son optimum de croissance dans un milieu riche en cholestérol est de 32°C. S. kunkelii (sérogroupe I-3), observé pour la première fois en 1972, est l’agentresponsable de la maladie du rabougrissement du maïs ou « corn stunt », une maladie quis’étend depuis le sud des Etats-Unis jusqu’en Argentine. S. kunkelii, cultivé pour la premièrefois en 1975 (Chen & Liao, 1975; Whitcomb & Williamson, 1975) a été caractérisé en 1986(Whitcomb et al., 1986). Son génome, partiellement séquencé, est constitué d’un chromosomecirculaire de 1610 kpb (Carle et al., 1995) et possède 26 % de bases G+C (Whitcomb et al.,1986). Les séquences disponibles sont accessibles sur le site web suivant:(http://www.genome.ou.edu/ spiro_blast.html). 16
  22. 22. Introduction 2.2. Spiroplasma citri 2.2.1. Description de la maladie et mise en culture En 1970, deux équipes observent pour la première fois des organismes de typemollicute dans les tubes criblés dorangers atteints de la maladie du stubborn (Igwegbe &Calavan, 1970; Laflèche & Bové, 1970). Contrairement à un arbre sain dont la forme estgénéralement pyramidale, larbre très atteint présente un aspect buissonneux provenant dunraccourcissement général des entre-noeuds. Les feuilles des arbres malades présentent unechlorose foliaire. La floraison et la maturation des fruits sont perturbées. La floraisonséchelonne tout le long de lannée et survient donc à contre saison. Les fruits sont déformésen forme de glands et les pépins avortés ou nécrosés. Obtenu en culture pure en France (Saglio et al., 1971) et en Californie (Fudl-Allah etal., 1972), la caractérisation biochimique et immunologique du pathogène responsable de lamaladie du stubborn révèle que lorganisme cultivé est bien un mycoplasme du fait delabsence de paroi à peptidoglycane (Bébéar et al., 1974) mais, qu’il sagit dun mycoplasmenouveau de par sa morphologie hélicoïdale et sa motilité (Saglio et al., 1973). Il fut nomméSpiroplasma citri en 1973 (Saglio et al., 1973). La transmission de S. citri à l’oranger Citrus sinensis (Markham et al., 1974) par lacicadelle Euscelis plebejus (Fallen), infectée par micro-injection d’une culture duspiroplasme, a permis de vérifier les postulats de Koch, démontrant ainsi le rôle de S. citricomme agent phytopathogène. La mise au point dun milieu de culture de composition définie a permis de connaîtreles exigences nutritionnelles de S. citri (Chang & Chen, 1981). Ainsi, il a été établi que saculture nécessite lajout de cholestérol, dacides gras, de vitamines, de co-facteurs (acidefolique, acide p-aminobenzoïque, etc...), de source de carbone et dacides aminés sauf lesacides aspartique et glutamique. Les sucres fermentés par S. citri sont le glucose, le fructose etle tréhalose; les autres sucres comme le mannose ou le sorbitol ne sont pas utilisés. Lecomportement de S. citri envers le saccharose nest pas bien défini. Les milieux courammentutilisés, comme le milieu SP4, contiennent nécessairement du sérum animal (poulain ou veaufoetal) qui apporte les stérols et lipides, ainsi que des sucres, glucose, fructose et saccharosecomme source dénergie (Tully et al., 1977). Ce milieu possède une pression osmotiqueélevée et contrôlée de 600 mOsm du fait de l’absence de paroi du spiroplasme. Latempérature optimale pour la croissance de S. citri est 32°C (Saglio et al., 1973). Cettecroissance est fortement ralentie à 37°C (Garnier et al., 1984). 17
  23. 23. Introduction En plus d’être l’agent du stubborn des agrumes, S. citri est également responsable dela maladie des racines cassantes du radis noir (Fletcher et al., 1981). Au total, au moins 38espèces végétales regroupant 12 familles botaniques sont naturellement infectées par S. citri.La première plante découverte infectée par S. citri en Californie (Granett et al., 1976), enArizona (Allen & Donndelinger, 1981) ainsi quau Maroc (Bove et al., 1978) nappartenantpas à la famille des agrumes (rutacées) est la pervenche de Madagascar (Catharanthusroseus). Par ailleurs, en Californie, S. citri a été isolé de mauvaises herbes comme le plantin(Plantago sp.), de plantes ornementales comme le souci (Tagetes erecta), la reine-marguerite(Callistephus chinensis), de plantes cultivées comme la laitue (Lactuca sp.), le radis(Raphanus sativum), la pastèque (Citrullus vulgaris) et de certains arbres fruitiers, cerisiers,pêchers et poiriers (Calavan & Bove, 1989). Plus récemment, ce spiroplasme a également étéisolé de la carotte (Mello et al., 2009 ; Cebrian et al., 2010). S. citri a pu être transmisexpérimentalement par greffage ou insecte vecteur à environ 80 espèces végétales différentes. 2.2.2. Caractéristiques de S. citri Depuis son obtention en culture pure, S. citri est devenu le mollicute phytopathogènele mieux caractérisé à l’heure actuelle. Les premières observations au microscope à fond noir révèlent que S. citri possède unemorphologie hélicoïdale et est doué de motilité malgré l’absence de flagelle ou de filamentaxial normalement présent chez les bactéries mobiles (Cole et al., 1973). S. citri doit samotilité à deux types de mouvements, un mouvement de flexion du corps cellulaire et unmouvement de rotation autour de l’hélice (Davis & Worley, 1973; Daniels et al., 1980). Cemouvement de rotation associé à sa morphologie hélicoïdale permet au spiroplasme de sedéplacer en milieu visqueux. Sur milieu solide, cette motilité a des répercussions sur l’aspectdes colonies qui sont diffuses et entourées de colonies satellites. Plus récemment, les travauxde Trachtenberg et collaborateurs ont permis de mettre en évidence l’implication ducytosquelette de S. citri dans sa motilité (Trachtenberg & Gilad, 2001; Trachtenberg et al.,2003; Trachtenberg, 2004). Ce cytosquelette est composé de la protéine de fibrille(Williamson et al., 1991) et de la protéine « actin-like » MreB (Maccheroni et al., 2001). Cecytosquelette agirait comme un moteur linéaire capable de se contracter permettant ainsi undéplacement directionnel contrôlé (Trachtenberg, 2004). Des travaux complémentaires ontmontré que le déplacement du spiroplasme était également dépendant de la propagation d’une 18
  24. 24. Introductionpaire de « kink » le long du corps cellulaire, structures générées par des changements del’hélicité du spiroplasme (Shaevitz et al., 2005). La croissance de S. citri s’effectue par allongement d’une hélice élémentaireconstituée de 2 tours donnant une hélice parentale à quatre tours. L’hélice parentale se diviseensuite, par constriction, en deux hélices élémentaires (Garnier et al., 1984). Aujourd’hui, 92 % de la séquence du génome de S. citri GII3 sont connus (Carle et al.,2010). Ce génome se compose d’un chromosome de 1820 kpb avec 26 % de bases G+C et desept plasmides (pSciA et pSci1 à 6) qui ne possèdent pas d’homologues connus (Saillard etal., 2008). La taille de ces plasmides varie de 7,8 kpb pour le pSciA à 35,3 kpb pour le pSci6et leurs nombres de copies par spiroplasmes ont été estimés entre 10 et 14. LADNplasmidique représenterait ainsi près de 1,6 Mpb soit 47 % de lADN total de S. citri GII3. LespSci1-6 possèdent un pourcentage en G+C (25,6 à 29 %) proche de celui du chromosome (26%) alors que le pSciA à un pourcentage plus faible de 21,3 %. De manière intéressante,aucune des CDS portées par les pSci ne présente d’homologie avec une protéine deréplication (Saillard et al., 2008). Des travaux récents ont néanmoins pu restreindre l’originede réplication des plasmides pSci de S. citri à une région contenant une seule CDS, nomméepE, et à sa séquence en aval présentant des motifs de fixation à la protéine initiatrice DnaA(Breton et al., 2008). De plus, trois formes réplicatives virales SpV1, SpV2 et SpV3 ont été identifiées dansle chromosome de S. citri (Renaudin et al., 1990; Renaudin & Bove, 1994). Les virus SpV2 etSpV3 ressemblent à des bactériophages classiques, alors que le virus SpV1 est filamenteuxavec un ADN monocaténaire circulaire de 8,3 kb (Renaudin et al., 1990). Une descaractéristiques de ce virus SpV1 est le grand nombre de copies de son ADN, plus ou moinscomplètes, réparties dans tout le chromosome (Carle et al., 2010). 2.2.3. S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration d’outils génétiques Un des premiers grands challenges concernant l’étude de S. citri fut le développementde vecteurs d’expression de gènes, outil indispensable à la caractérisation fonctionnelle de cesderniers. Dès le début, la présence des formes réplicatives virales a été mise à profit. A partirde la forme réplicative SpV1, un vecteur a été développé parallèlement à une méthode detransformation par électroporation (Stamburski et al., 1991). Cette première approche detransfert de gènes chez S. citri n’a pas été jugée satisfaisante car ces vecteurs viraux sont 19
  25. 25. Introductioninstables, dans le sens où des phénomènes de recombinaisons homologues entre le vecteur etles copies virales portées par le chromosome sont observés (Marais et al., 1996). En 1994, Yeet collaborateurs clonent l’origine de réplication chromosomique de la souche R8A2 de S.citri (Ye et al., 1994) qui sera utilisée plus tard pour la construction de vecteurs, tels que leplasmide pBOT (Renaudin et al., 1995). Ce plasmide navette, dans les cas decomplémentation fonctionnelle in vivo, s’intègre dans le chromosome par simplerecombinaison homologue entre les origines de réplication (Renaudin et al., 1995).L’ensemble de ces vecteurs navettes, et notamment le plasmide pGOT (Duret et al., 2005),développés récemment au laboratoire dans le but d’obtenir des mutants par simplerecombinaison homologue, seront détaillés au chapitre 3. Parallèlement, une technique de mutagénèse aléatoire par transposition avec letransposon Tn4001 a également vu le jour au laboratoire (Foissac et al., 1997). Cette approchea permis d’obtenir plusieurs mutants de S. citri, à savoir un mutant non motile G540 (Jacob etal., 1997), un mutant déficient pour une ATPase de type P transporteur de calcium, un mutantnon-phytopathogène (Gaurivaud et al., 2000; Gaurivaud et al., 2001) et un mutant affectédans sa transmission (Boutareaud et al., 2004). Plus récemment, une nouvelle approche basée sur l’incompatibilité plasmidiquepermet de modifier le contenu plasmidique de S. citri et d’obtenir des mutants afin decaractériser l’ensemble des gènes présents sur les plasmides pSci (Breton et al., 2010). Ces dernières années, les travaux du laboratoire se sont orientés sur les déterminismesgénétiques impliqués dans la transmission de S. citri. En effet, S. citri est transmis de plante àplante par des cicadelles, insectes piqueurs suceurs de sève élaborée, selon un mode circulantmultipliant, impliquant des relations étroites avec l’insecte. De nombreuses étapes clés, régissant ce mode de transmission par l’insecte, restent àêtre élucidées. En revanche, pour de nombreux microorganismes pathogènes (bactéries, virus,champignons), les mécanismes gouvernant les étapes clefs nécessaires à leur transmission ontété particulièrement étudiés et sont, à l’heure actuelle, parfaitement décrits. La suite de cette introduction fait le point sur les connaissances acquises sur lesrelations des spiroplasmes avec leurs insectes vecteurs puis, décrit les différentes étapes ainsique les mécanismes mis en jeu au cours de la transmission de pathogènes intracellulairesqu’ils soient transmis par des insectes vecteurs ou non. 20
  26. 26. IntroductionIII. Transmission de microorganismes intracellulaires 1. Transmission par insecte vecteur 1.1. Relation entre le microorganisme et son insecte Il existe plusieurs types de relation entre un microorganisme et son hôte. 1.1.1. Transmission externe Lors d’une transmission externe du microorganisme, c’est-à-dire lorsque celui-ci ne sefixe que sur des parties externes de l’insecte (pattes, thorax, stylet), l’association entre lesdeux partenaires est limitée. Aucun des deux partenaires n’influence le comportement del’autre. 1.1.2. Transmission intracellulaire Lorsque l’interaction entre les deux partenaires persiste, comme cela est le cas aucours d’une transmission intracellulaire, cette relation entre le microorganisme et son hôte secomplexifie et certaines associations peuvent engendrer une modification du comportementde l’insecte, pouvant aller jusqu’à la mort de ce dernier. Les Baculoviridae sont lespathogènes dinsectes les plus représentés. Ils infectent notamment les larves de lépidoptèreset d’hyménoptères (Blissard, 1996). Linfection survient une fois que des larves dinsectessensibles ont absorbé des aliments contaminés par le virus. Le virus sattaque alors àlhémolymphe, aux tissus adipeux et à lintestin moyen. Linsecte est ensuite paralysé et meurt. Des interactions mutualistes entre les deux partenaires ont également été découvertes ;le microorganisme, dans ce cas appelé endosymbiote d’insecte, peut être classé en deuxcatégories. Les endosymbiotes primaires ont été associés avec leur insecte hôte depuis desmillions dannées. Ils ont une forme dassociation obligatoire et ils affichent une co-spéciationavec leur hôte. Cette association, bénéfique aux deux organismes, permet à chacun des deuxpartenaires de profiter des avantages de l’autre. Le rôle élémentaire de l’endosymbiote est defournir les nutriments, que lhôte ne pourrait obtenir seul, en catabolisant la nourritureinassimilable par linsecte. Parmi ces endosymbiotes primaires des insectes, le plus étudiéreste la bactérie Buchnera qui colonise le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Buchnera estcapable de synthétiser les acides aminés essentiels que le puceron ne peut naturellement 21
  27. 27. Classe Ordre Famille Genre Espèce Pathogène Maladies Aedes aegypti Dengue Culicidae Aedes Flavivirus Aedes albopictus Chikungunya Anopheles Anopheles gambiae Plasmodium falciparum Paludisme Culex pipiens Plasmodium Paludisme aviaire Culex Culex quinquefasciatus Nématodes parasites Filariose Diptera Psychodidae Phlebotomus Phlebotomus major Leishmania Leishmaniose Drosophilidae Drosophila Drosophila Non pathogènes Insecta Muscidae Musca Musca domestica > 100 pathogènes Typhoïde, choléra, Glossina Glossinidae Glossina palpalis Trypanosoma brucei Maladie du Sommeil Mouche « tsé tsé » Reduviidae Triatoma Triatoma infestans Trypanoma cruzi Maladie de Chagas Hemiptera Buchnera aphidicola Aphididae Acyrthosiphon Acyrthosiphon pisum Non pathogène Yersinia pestis Peste Siphonaptera Pulicidae Xenopsylla Xenopsylla cheopis Ricketssia typhi Typhus murinArachnida Ixodida Ixodidae Ixodes Ixodes scapularis Borrelia burgdorferi Maladie de Lyme Figure I.3: Quelques exemples d’insectes vecteur de l’Embranchement des arthropodes associés à l’organisme qu’ils transportent et la maladie provoquée (s’il y a lieu).
  28. 28. Introductionobtenir par prise de nourriture tandis que ce dernier fournit à la bactérie un milieu riche luipermettant de se répliquer (Douglas, 1998). L’association entre les endosymbiotes secondaires et leurs insectes s’est développéeplus récemment. Ces associations ne sont pas obligatoires et, dans la plupart des cas, on parlede relations commensales, l’insecte ne tirant aucun bénéfice de leur interaction. 1.1.3. Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes La plupart des espèces de spiroplasmes sont retrouvées dans l’intestin oul’hémolymphe de moustiques, mouches (tabanides) ou encore de tiques. De manière plussurprenante, S. clarkii a été isolé de l’intestin d’une larve de scarabée (Whitcomb et al., 1993)tandis que S. penaei a lui été retrouvé dans l’hémolymphe de la crevette grise, Penaeusvannamei (Nunan et al., 2005). Plusieurs espèces de spiroplasmes ont également étéretrouvées infectant au moins 16 espèces différentes de Drosophila (Haselkorn et al., 2009). Quelques espèces ont également été décrites influençant le comportement de l’hôte.Un spiroplasme a été caractérisé chez le puceron du pois. Il provoque une diminution de lacroissance et de la durée de vie du puceron ainsi qu’une baisse de la fertilité (Fukatsu et al.,2001). S. poulsonii, l’agent du « sex-ratio », supprime la descendance mâle de plusieursespèces de drosophiles et se transmet de manière verticale (Williamson et al., 1999). S. apis etS. melliferum sont des pathogènes de l’abeille Apis mellifera (Mouchès et al., 1982; Moucheset al., 1984). D’autres encore, comme S. culiciola, S. sabaudiense, S. taiwanense sontpathogènes pour le moustique Aedes aegypti dont ils réduisent la durée de vie et la fécondité.De plus, S. taiwanense entraîne aussi un changement du sex-ratio en favorisant ladescendance mâle (Vazeille-Falcoz et al., 1994). La présence intracellulaire de S. mirum amême été décrite dans des lésions cérébrales d’un patient atteint d’encéphalopathie (Bastian,1979). Plus récemment, des expériences menées par le même groupe ont également montréque ce spiroplasme, injecté de manière intracrânienne, produisait des symptômes comparablesavec ceux d’une encéphalopathie spongiforme (Bastian et al., 2007). Néanmoins, la plupart des mollicutes phytopathogènes ne semblent pas perturber lecomportement de l’insecte. S. citri ne semble avoir aucun effet sur la cicadelle au cours de soncircuit à l’intérieur de celle-ci. De même, lors de l’infection de Cacopsylla melanoneura parCandidatus phytoplasma mali, le phytoplasme n’influence pas le développement ou lalongévité de ces insectes cependant il semble avoir quelques effets sur le fitness de cesderniers (Malagnini et al., 2010). 22
  29. 29. Figure I.4: Phylogénie de l’ordre des Hemiptera basée sur les études de phylogénie moléculaire.(D’après Campbell et al., 1995 ; Sforza, 1998).
  30. 30. Introduction 1.2. Insectes vecteurs Les insectes vecteurs de microorganismes appartiennent tous à l’embranchement desarthropodes. Quelques familles d’insectes responsables de la vection de microorganismes, àl’exception des mollicutes phytopathogènes, sont regroupées dans le tableau I.3. 1.2.1. Vecteurs mollicutes phytopathogènes 1.2.1.1. Classification Les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent à l’ordre desHemiptera. La classification de ces insectes a longtemps été basée sur des caractèresmorphologiques (couleur, taille, ailes antérieures, tête, thorax, abdomen, parties génitalesetc...). Les hemiptères ont un développement du type hémimétabole, c’est à dire que lanymphe est mobile et ressemble aux larves, et possèdent plusieurs caractéristiques proprescomme des antennes longues, des pièces buccales avec un long rostre et deux paires d’ailesdont l’une peut être cornée et durcie (hémiélytre). Ce n’est qu’en 1995, lors des travaux de Campbell et collaborateurs portant sur lacomparaison de séquences d’ADN ribosomiques 18S de ces insectes, que la classification deshémiptères a été modifiée et est restée depuis, identique à celle présentée dans le tableau I.4(Campbell et al., 1995). Dès lors, les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent, au seindu sous-ordre des Cicadomorpha, à la famille des Cicadellidae (cicadelles) ; au sein del’infra-ordre des Fulguromorpha, à la famille des Cixiidae (cixides) et enfin, au sein del’ordre des Sternorrhyncha, à la famille des Psyllidae (psylles). Au sein de la famille desCicadellidae, les vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent principalement à lasous-famille des Deltocephalinae. Dans la littérature, les membres de la famille des Cicadellidae sont regroupés sous leterme de « leafhopper » tandis que l’infra-ordre des Fulguromorpha renferme deux famillesprincipales que sont les Cixiidae et les Delphacidae regroupée sous le terme de« planthopper ». Quelques exemples de mollicutes phytopathogènes associés à leur insectevecteur sont présentés dans le tableau I.5. 1.2.1.2. Vecteurs de S. citri Pour sa part, S. citri est transmis naturellement et expérimentalement par plusieursinsectes (tableau I.5). De toutes les cicadelles précédemment décrites, C. tenellus (figure I.6)est le vecteur majeur du spiroplasme dans le Sud-ouest des Etats-Unis (Rana et al., 1975; Liu 23
  31. 31. Bactérie Insecte vecteur Famille taxonomique Référence Circulifer haematoceps Fos et al. , 1986 Circulifer tenellus (Baker) Oldfield et al. , 1976 Circulifer opacipennis (Lethierry) Sengonca et al. , 1991 Macrosteles fascifrons (stål) O’Hayer et al ., 1983 Spiroplasma citri Scaphytopius nitridus (DeLong) Cicadellidae Oldfield, 1977 Scaphytopius acutus delongii (Young) Kaloostian et al. , 1979 Scaphytopius coliforniensis (Hepner) Oldfield, 1987 Euscelis plebejus Marckam et al ., 1974 Euscelidius variegatus Marckam & Townsend, 1979 Dalbulus maidis Kunkel, 1946 Spiroplasma kunkelii Cicadellidae Chen & Liao, 1975 Dalbulus elimatus Williamson et Whitcomb, 1975 Phytoplasma Stolbur Hyalesthes obsoletus Cixiidae Fos et al. , 1992 Phytoplasme de la Flavescence Dorée Scaphoideus titanus Ball Cicadellidae Caudwell, 1983 Phytoplasme de l’ESFY Cacopsylla pruni Psyllidae Carraro et al., 1998b Phytoplasme du Pear Decline Cacopsylla pyri Psyllidae Carraro et al ., 1998a Phytoplasme de la proliferation du pommier Cacopsylla melanoneura Psyllidae Alma et al ., 2000 Candidatus phytoplasma ziziphi Hishimonus sellatus Deltocephalidae La & Woo, 1980 Scaphoideus luteolus Baker, 1949 Candidatus phytoplasma ulmi Cicadellidae Macropsis mendax Carraro, 2004 Phytoplasme du rabougrissement du roncier Macropsis fuscula Cicadellidae De Fluiter & Van der Meer, 1953Phytoplasme de la jaunisse de la vigne du Palatinat Oncopsis alni Cicadellidae Maixnert, 2000 Phytoplasme de la jaunisse de l’aulne Oncopsis alni Cicadellidae Maixnert & Reinert, 1999Figure I.5: Quelques exemples d’insectes vecteurs de Mollicutes phytopathogènes avec leur maladies associées.
  32. 32. Introductionet al., 1983). Les vecteur identifiés dans le pourtour méditerranéen sont C. haematoceps(figure I.6) (Fos et al., 1986) et C. tenellus (Rasooly et al., 1994). Ces cicadelles polyphagesse développent principalement sur des hôtes herbacés et sur les agrumes (rutacées) qui,lorsqu’ils sont infectés par S. citri, présentent des taux d’infection élevés. La transmission de plante à plante se déroule selon un mode circulant multipliant. Dece fait, dans l’insecte, S. citri effectue un circuit au cours duquel il passe successivement ducanal alimentaire, dans l’intestin moyen puis dans l’hémolymphe et gagne les glandessalivaires de la cicadelle afin d’être excrété avec les sécrétions salivaires. La description anatomique de ces tissus nous permettra de mieux appréhender lesmécanismes mis en place par S. citri au cours de son trajet et notamment lors desfranchissements des deux barrières, que sont l’épithélium intestinal et celui des glandessalivaires, indispensables à sa propagation. 1.2.1.3. Morphologie des cicadelles Les pièces buccales des cicadelles sont composées du labrum, du labium et des stylets.Seul les stylets pénétrent dans la plante lors du repas de l’insecte. Ils sont au nombre de quatreet sont les vestiges des mandibules et des maxilles. La paire de stylets maxillaires se rejointpour former le canal salivaire et le canal alimentaire. Les stylets mandibulaires entourent enpartie les stylets maxillaires. Au niveau de la tête, les deux stylets maxillaires se séparent l’unde l’autre et les fluides ingérés se retrouvent dans une chambre filtrante appelée precibarium.Sa fonction est de réguler le flux de liquide avant qu’il n’entre dans le cibarium. Il estcomposé d’une valve qui empêche notamment la régurgitation de fluides dans les stylets.Le cibarium est une sorte de pompe qui constitue un sac situé dans la tête et composé d’unecouche de cellules épithéliales. Les fluides passent alors dans l’intestin antérieur de l’insectequi est relativement étroit avec une paroi mince et recouvert de chitine qui s’étend jusqu’aumésothorax ou bien même jusqu’au premier fragment abdominal. Les cellules intestinalespossèdent des microvillosités à leur surface qui sont recouvertes d’une fine matrice de naturepolysaccharidique, le glycocalyx. L’épithélium intestinal est bordé d’une lame basalecomposée d’un assemblage de filaments de collagène et d’une matrice amorphe constituée depolysaccharides (Gouranton & Folliot, 1970). Chez les insectes se nourrissant de xylème et de phloème, une chambre filtrante s’estformée permettant le passage direct de l’eau ingérée, contenant les substances en solution, del’intestin antérieur à l’intestin postérieur dans le but de concentrer la solution nutritive(Forbes, 1969). A la jonction de l’intestin moyen et postérieur se trouvent les tubes de 24
  33. 33. Figure I.6: Principaux insectes vecteurs de Spiroplasma citri.Photographies de Circulifer tenellus (à gauche) et de Circulifer haematoceps (à droite). Figure I.7: Représentation schématique de l’appareil salivaire de cicadelles. AG: glande salivaire accessoire. I à VIII: types cellulaires différents de la glande salivaire principale. (D’après Wayadande & Fletcher, 1995).
  34. 34. IntroductionMalpighi. Ils sont au nombre de quatre chez les cicadelles et sont composés de cellulesépithéliales très minces qui se divisent en deux parties, une partie distale qui servirait à lasécrétion d’ions et à l’excrétion tandis que la partie proximale aurait une fonction dans laréabsorption des solutés. Les cicadelles possèdent une paire de glandes salivaires situées de part et d’autre del’œsophage. De chaque côté, il y a une glande principale et une glande accessoire toutes lesdeux composées de cellules conductrices et sécrétrices. Chaque glande salivaire principale estcomposée de 8 types cellulaires différents et organisés en lobes concentriques. Ces cellulessont différenciées en fonction de leur morphologie et de leur densité aux électrons. Elles sontbinucléées et regroupées en deux lobes. Le lobe antérieur est composé de 10 cellules de typeI, 6 cellules de type II, 4 cellules de type III et IV et 2 cellules de type V. Le lobe postérieurest constitué de 5 cellules de type VI, 3 cellules de type VII et 4 cellules de type VIII (figureI.7) (Wayadande et al., 1997). Les glandes salivaires accessoires sont reliées aux glandes salivaires principales par uncanal lui-même inséré dans le canal faisant la jonction avec le lobe antérieur et le lobepostérieur des glandes salivaires principales. Ici, les cellules sont uninucléées. Les deux principaux canaux formés par chacune des deux glandes s’unissent pourformer un canal salivaire commun qui se dévide dans la pompe salivaire. Tous ces organes baignent dans l’hémolymphe, un fluide extracellulaire qui transporteles métabolites vers les différents tissus de l’insecte. L’osmolarité de l’hémolymphe estrelativement élevée et comprise entre 240 et 600 mOsm. La principale source de carbone estle tréhalose, sucre non réducteur composé de deux molécules de glucose. Ce fluide contientégalement des lipides, des acides aminés libres, des acides inorganiques tel que l’acideascorbique et des ions Mg2+ et PO43- (Saglio & Whitcomb, 1979). Cette composition estrelativement proche de la composition du phloème de la plante à l’exception du sucremajoritaire qui est le saccharose au lieu du tréhalose. 1.2.2. Circuit du spiroplasme dans l’insecte Après ingestion et un passage dans la pompe alimentaire, les spiroplasmes seretrouvent dans l’intestin où la plupart sont digérés par les enzymes présentes. Les survivantspoursuivent leur route jusqu’au niveau de l’intestin moyen ou ils pénètrent dans les cellulesconstituant l’épithélium intestinal situées dans une région dépourvue de chitine. ChezCirculifer tenellus, S. citri pénètre dans ces cellules épithéliales en passant entre lesmicrovillosités (figure I.8A; (Kwon et al., 1999). Le spiroplasme franchit l’épithélium 25
  35. 35. Passage de la barrière intestinale A BA A: S. citri pénétrant dans les cellules de l’épithélium intestinal de C. tenellus à travers les microvillosités. L: lumière intestinale, MV: microvillosités, S: spiroplasme. B: Zone proche du plasmalemme basal montrant les spiroplasmes dans des vacuoles d’endocytose. H: hémolymphe. Echelle: 0,5 µm. (Kwon et al., 1999) Libération dans l’hémolymphe D C C: S. kunkelii franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium intestinal de D. maidis (flèche avec l’étoile) ou bien libre dans l’hémolymphe de l’insecte (flèche à gauche). Bl: lame basale, Mt: tubes de Malpighi, Mi: mitochondrie, Gc: cellule intestinale, Pl: plasmalemme basal. Echelle: 0,5 µm. D: Agrandissement de la région encadrée montrant S. kunkelii avec une protubérance en forme de « tip » proche de la lame basale. (Ozbek et al., 2003). Passage de la barrière des glandes salivaires E F E: S. citri franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium des glandes salivaires de C. tenellus dans une vacule d’endocytose. Bl: lame basale, S: spiroplasme, Er: réticulum endoplasmique. F: S. citri libre dans le canaliculus des glandes salivaires de C. tenellus. Echelle: 0,5 µm. (Kwon et al., 1999).Figure I.8: Etapes clés du cycle des spiroplasmes dans leurs insectes vecteurs.
  36. 36. Introductionintestinal par un mécanisme d’endocytose/exocytose au cours duquel il se retrouve dans unevacuole d’endocytose où il adopte une forme ovoïde (figure I.8B ; (Ozbek et al., 2003)). Aumoment du passage dans l’hémolymphe de l’insecte, une protubérance de 70 nm de diamètreest observée traversant la membrane de la vacuole (figure I.8C et D ; (Ozbek et al., 2003)).Cette protubérance, non sans rappeler le « tip » observé chez plusieurs mycoplasmes (Rottem,2003), regrouperait plusieurs protéines qui seraient les premières impliquées dans un rôle dereconnaissance et de franchissement du plasmalemme intestinal (Ammar et al., 2004). Grâce àl’intermédiaire de ce « tip », les vésicules d’endocytose fusionnent avec le plasmalemmebasal et les spiroplasmes sont donc libérés par exocytose. Ils se retrouvent alors dansl’hémolymphe où ils se multiplient massivement. Un nouveau mécanismed’endocytose/exocytose leur permet de franchir la barrière des glandes salivaires puis, aprèsune nouvelle multiplication, ils sont expulsés dans le canal salivaire (figure I.8E et F; (Kwonet al., 1999)). En résumé, pour sa transmission, le spiroplasme a besoin de franchir deux barrières, labarrière intestinale et la barrière des glandes salivaires. Les franchissements de ces barrièresnécessitent des interactions entre S. citri et son insecte vecteur afin de pénétrer à l’intérieurdes cellules de son hôte. Or, les mécanismes moléculaires ainsi que les protéines impliquéesdans ces étapes d’adhésion aux cellules et d’internalisation dans celle-ci, restent encoreinconnus à ce jour. Pour d’autres organismes, les descriptions concernant ce processus d’invasionpermettraient de cerner les différents acteurs intervenant au cours de ces étapes et, paranalogie, faire un lien avec ce qui est connu concernant la transmission du spiroplasme. 2. Cycle cellulaire de la transmission Le pouvoir pathogène d’un microorganisme intracellulaire repose sur sa capacité àcoloniser son hôte et, de ce fait, à envahir les cellules de celui-ci afin de s’y multiplier et des’y disséminer. L’ensemble de ce processus, nommé « invasion » tout au long de ce manuscrit, sedécompose en plusieurs étapes successives. Après avoir été ingéré par leur hôte, lesmicroorganismes doivent (i) adhérer aux cellules de leur hôte, (ii) pénétrer à l’intérieur decelles-ci, (iii) se développer tout en évitant les mécanismes de défense mis en place puis (iv)se disséminer de cellule à cellule afin d’être transmis à un nouvel hôte. 26
  37. 37. Figure I.9: Représentation des principaux types de pili décrits chez les bactéries àGram-négatif et à Gram-positif.(D’après Kline et al, 2009).
  38. 38. Introduction Le succès d’une invasion réside dans les signaux que les deux acteurs, la cellule etl’agent pathogène, s’échangent perpétuellement. A chaque étape du processus d’infection,l’agent pathogène exploite la machinerie cellulaire de l’hôte à son propre profit. 2.1. Adhésion L’adhésion des microorganismes à des cellules eucaryotes est souvent une premièreétape essentielle dans la mise en place de la maladie. En effet, étant de manière générale uneétape spécifique, l’adhésion permet au pathogène de se retrouver au niveau de tissusappropriés, à partir desquels, il peut initier son processus d’entrée. De nombreuses molécules et de structures macromoléculaires, regroupées sous leterme d’adhésines, permettent aux pathogènes d’assurer cette fonction. Ces adhésines peuventêtre divisées en deux familles : les adhésines de type fibrillaire et les adhésines de type non-fibrillaire. 2.1.1. Adhésines de type fibrillaire Les adhésines de type fibrillaire sont des structures filamenteuses visibles à la surfacedes bactéries. Ces structures ont été pour la première fois observées dans le début des années50 par deux équipes. La première, dirigée par James Duguid, appela ces structures fimbriae(« frange ») (Duguid et al., 1955), tandis que la seconde, dirigée par Charles Brinton, décidade les nommer pili (« cheveux ») (Brinton, 1965). Bien que les deux termes soientsynonymes, et toujours d’actualité, le terme de pili sera préféré au cours de ce manuscrit. Lesprincipaux types de pili, décrits aussi bien chez les bactéries à Gram-négatif qu’à Gram-positif, sont représentés sur la figure I.9. 2.1.1.1. Bactéries à Gram-négatif Les pili ont été, pour la première fois, décrits chez les bactéries à Gram-négatif. Cesont des structures de 1 à 2 µm de long, formées par l’association de plusieurs sous-unités,généralement regroupées sous le terme de « pilines », formant des structures polymériques quipermettent d’éviter la répulsion des charges négatives présentes à la surface des cellules de labactérie et de celles de l’hôte, retardant ainsi l’activation du système immunitaire de l’hôte(Kline et al., 2009). Trois principaux types de pili sont connus et se distinguent essentiellement par leursstructures, mais aussi par leurs mécanismes de formation et de régulation qui, bien 27

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