Descripción de pruebas de laboratorio ELISA PCR Western Blot

1. Pruebas de Laboratorio
ELISA
Western Blot
Reacción en Cadena de
Polimerasa (PCR)
Dr. Luis Aragón D.

2. ELISA
Enzyme
Linked
Immuno
Sorvent
Assay

3. Qué es?
Prueba de inmunoanálisis empleada para el estudio
cuantitativo de antigenos y anticuerpos específicos.
Se basa en el uso de antígenos o anticuerpos
marcados con una enzima, e insolubilizado sobre un
soporte (inmunoadsorbente) en donde la reacción
antígeno-anticuerpo queda inmovilizada, se le
agrega un substrato especifico que al actuar con la
enzima produce un color cuantificable mediante el
uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

4. Tipos
• ELISA Directo (Ac marcados con enzima)
• ELISA Indirecto (suero – Antígenos
fijados)
• ELISA Competitivo (Ac específicos del
agente patógeno a detectar )
• ELISA sándwich
– Doble (DAS)
– Heterólogo (HADAS)

5. En qué consiste?
 Pasos generales de un ELISA.
1.Se agrega el antígeno o anticuerpo.
2.Se mezcla la muestra con los antígenos o
anticuerpos. Se unen
3.Se lava el exceso no unido
4.Se agrega el anticuerpo (2) marcado con la
enzima y se une al antígeno
5.Lavado eliminar el exceso de enzima no unida
6.Por ultimo se agrega el substrato este su une a la
enzima desarrollando el color, listo para cuantificar

6. Aplicaciones
 Hormonas
 Gonadotropina coriónica
 Progesterona
 Testosterona
 Hormonas tiroideas (T3, T4)
 Cuantificación de inmunoglobulinas
 IgG (rubeola)
 IgE
 IgA
 IgM (toxoplasma)
 Inmunopatología
 Anticuerpos contra HIV-1
 Anticuerpos contra antígeno de superficie (anti Hbs)
 Antígeno superficie (AgH- Bs)
 Factor reumatoide
 Inmunocomplejos circulantes

7. Aplicaciones
 Enfermedades producidas por parásitos
 Babesias y tripanosomas
 Toxocara canis
 Toxoplasmosis
 Enfermedades producidas por Micoplasmas
 Enfermedades producidas por bacterias
 Mycobacterium tuberculosis
 Enterotoxinas Vibrio cholerae
 Estreptococos
 Salmonela
 Enfermedades producidas por virus

8. Western Blot
 El término “blotting” hace
referencia a la
transferencia de
macromoléculas biológicas
desde un gel hasta una
membrana y su posterior
detección en la superficie
de la misma.

9. Qué es?

• La técnica del Western Blot también llamado
“inmunoblotting” utiliza anticuerpos para detectar el
antígeno o los antígenos específicos de interés.
• La especificidad de la unión antígeno –anticuerpo permite
la detección de una única proteína dentro de una mezcla
compleja de otras proteínas. En la actualidad se utiliza
como criterio de identificación positivo de una proteína
especifica en una mezcla compleja y para obtener datos
cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.

10. Método Directo
El anticuerpo
primario
marcado se une al
antígeno de la
membrana y
reacciona
con el sustrato
originando una señal
detectable.

11. Método Indirecto
El anticuerpo
primario sin
marcar reacciona
con el antígeno.
Luego, un
anticuerpo(2)
marcado se une
al primario y
reacciona con el
sustrato.

12.  1.Separación de las macromoléculas mediante geles de
electroforesis.
 2.Las macromoléculas ya separadas en función de su diferente
peso molecular se transfieren a una segunda matriz(membrana de
nitrocelulosa). Posteriormente, se bloquea la membrana para
evitar la unión inespecífica a su superficie de los anticuerpos que
se van a utilizar para la detección de la proteína de interés.
 3.Se une a dicha proteína transferida un anticuerpo especifico
marcado con una enzima
 4.Finalmente se añade un sustrato para dicha enzima con lo que
se produce un producto detectable
 Se utilizan sustratos quimioluminiscentes que cuando se combinan
con la enzima correspondiente, producen luz como producto final,
que se detecta con una película o una cámara especializada.
 La intensidad de la señal se correlaciona con la cantidad del
antígeno en la superficie de la membrana.

14. PCR
Reacción en
Cadena de
Polimerasa

15. Qué es?
• Prueba de amplificación genética, que permite
detectar en sangre o en ganglios linfáticos células
malignas.
• Hace posible la multiplicación de segmentos de
ADN por un factor de hasta 10 a la sexta potencia
• A partir de cantidades pequeñas como una sola
célula es posible identificar elementos específicos
que faciliten el diagnóstico de procesos neoplásicos.

16. En qué consiste?
• Transcripción inversa: se amplifican las secuencias
mensajeras ARNm para convertirlas a ADN
complementaria (enzima reversa transcriptasa-
polimerasa)
• Mediante la técnica RT-PCR la ADNc es amplificada
y esto permite identificar una población celular que
porte la molécula ARNm especifica.

17. Aplicaciones
• Diagnóstico enfermedades infecciosas
• Diagnóstico infección por VIH (neonatal)
• Anemia células falciformes
• Leucemias
• Melanomas
• Neoplasias

18. Bibliografía
• Angel G, Angel M, Interpretation Clínica de Laboratorio, 7a
Edición 2006
• Morrison K, Laboratorio Clínico y Pruebas de Diagnóstico,
1era Edición en Español
• Harrison T, Harrison Principios de Medicina Interna, 16a
Edición, 2006
• Masson, Diccionario Médico, 4a Edición, 2005

19. Playa Hermosa, Costa Rica