Tutorat Associatif Toulousain                              Année universitaire 2010-2011                                  ...
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ATTENTION !    Ce polycopié a été relu sur la base des cours dispensés à lafaculté de Rangueil pour lannée 2009-2010.     ...
PlanI              Présentation de la biologie moléculaire                                                page 5II        ...
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II Fiches de cours        Voici un petit nombre de fiches explicatives de points du cours qui peuvent poser problème.Beauc...
Classification des acides aminés (aa)     1 AA = une fonction amine NH2 + un radical R + une fonction acide carboxylique C...
Dosage et densité optique         Pour mesurer la concentration (dans une solution) de certaines molécules organiques, on ...
Chromatographies échangeuses d’ions                                      Petit rappel essentiel :            Les CATIONS s...
Bases, nucléosides et nucléotidesI - LES BASESBases puriques et pyrimidiques :       Elles dérivent d’hétérocycles azotés ...
Ce sont des excitants au niveau cardiaque et du SNC :- effets inotrope ( force de contraction du cœur ) et chronotrope ( f...
Antimétabolites :6-mercaptopurine        Atome de soufre en 6, utilisé pour le traitement des leucémies.   Allopurinol    ...
Enzymes de restriction        Les enzymes de restriction coupent uniquement le DNA double brin ; ce sont des endonucléases...
SondesPartie 1 : DENATURATION = FUSIONDénaturation = Fusion = passage de l’ADN double brin à l’ADN simple brin par coupure...
Partie 2 : HYBRIDATION       = association de deux brins d’acides nucléiques complémentaires suite à un refroidissement le...
Partie 3 : TECHNIQUE DE MARQUAGE DES SONDESSonde = séquence polynucléotidique complémentaire d’une séquence d’ADN ou d’ARN...
2) MULTI-RANDOM PRIMING = Multi-amorçage au hasardBut : Synthétiser de l’ADN marquéa) Chauffage de l’ADN double brin puisr...
5) RIBOSONDES : sondes ARN                    Nick           Multi-Random        T4 polynucléotideTechnique               ...
AMPLIFICATION ELECTIVE IN VITRO :                   PCROBJECTIF : Amplifier la quantité d’ADN (uniquement l’ADN)OUTILS :  ...
RESULTATS :Qu’obtient-on au bout du 1er cycle ?                                   2 copies avec les extrémités 3’ variable...
Analyse du génome   Le génome comprend l’ADN génomique nucléaire et mitochondrial.         Southern Blot                 1...
- Détection : - de pseudo-gènes (gènes non fonctionnels car non transcrits) et de gènes               apparentés (apparten...
Séquençage nucléotidiqueAussi appelé méthode de SANGER, le séquençage utilise des 2’-3’didésoxynucléotides.            Mét...
Analyse de lexpression des gènesExpression des gènes => mRNA : fragiles (détruits par les ribonucléases), peu abondants et...
2. Cartographie à la nucléase S1 ou à la RNase A  Rappel : La nucléase S1 clive seulement l’ADN ou l’ARN simple brin.     ...
II.     Analyse quantitative des ARN                        Dot Blot                             On dépose des ARN issu de...
b. Exemples       1ère étape : synthèse et marquage de l’oligonucléotide au 32P (radioactif) puis électrophorèse.L’ON marq...
Analyse génotypique   I-        Pathologies de l’ADN : héréditaires (maladies génétiques) ou acquises (cancers, maladies  ...
ASO normal =                                 N = normal, M = mutéASO muté =                 N/N    N/M    M/MExemple :    ...
Rq :        L’apparition de bandes de faible intensité correspond à des amplifications parasites : les amorcesse sont hybr...
Cette méthode nécessite des sites de restriction polymorphes et l’étude d’un grand nombremembres d’une famille où les pers...
III QCM d’entraînement               -   GENERALITES SUR LES PROTEINES               -   NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES        ...
GENERALITES SUR LES PROTEINES                                                44 QCMQCM 1 : Parmi les propositions suivante...
QCM 11 : Les protéines :A/ Sont formées par combinaison linéaire d’acides aminésB/ Une molécule d’eau est éliminée lors de...
QCM 17 : Les protéines :A/ Ont un sens conventionnel d’orientation : l’extrémité N-terminale à gauche et l’extrémité C-ter...
QCM 24 : Calcul de rendement :Après une étape de broyage d’un extrait brut de cerveau de bœuf (à l’aide d’un appareil de P...
QCM 30 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. 7,42 est la valeur de référence du pH physiologique...
QCM 37 : On réalise une électrophorèse à pH 3 d’un mélange d’arginine, d’acide aspartique etd’asparagine. Quelle sera la m...
QCM 43 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Le phénol entraîne la précipitation des protéines t...
CorrectionQCM 1 : DA/ ADN nucléaire + ADN mitochondrialB/ Au moins un rôle dans la régulationC/ Beaucoup plus de protéines...
QCM 11 : ABCEA/ Oui, il n’y a jamais de ramifications d’acides aminés !D/ Non, les protéines qui ont une structure quatern...
QCM 18 : CA pH 5 seul Glu est chargé négativement (anion), les autres (Asn, Lys, Pro, Phe) sont tous chargéspositivement. ...
QCM 27 : AEB. 1 atome de FerC. Structure tertiaireD. Entre 2 CystéinesQCM 28 : EA. PM supérieur à 10 000B. Polaire neutreC...
QCM 39 : ADEB. La phase aqueuse correspond à la phase supérieure. La phase inférieure comprendra le phénol avec lesprotéin...
NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES                               43 QCMParmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants :A/ t...
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  1. 1. Tutorat Associatif Toulousain Année universitaire 2010-2011 PACES UE 1 : Chimie, Organisation, évolution et fonction du génome humain. Structure, diversité et fonction des biomolécules. Organisation, évolution et fonction du génome (Biologie Moléculaire) Fiches de cours et QCM Partenaire du Tutorat Associatif Toulousain© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 1
  2. 2. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 2
  3. 3. ATTENTION ! Ce polycopié a été relu sur la base des cours dispensés à lafaculté de Rangueil pour lannée 2009-2010. Cependant, suite à la réforme de la PACES, le programme deBiologie Moléculaire a été quelque peu modifié. Par conséquent,certains éléments présents dans ce polycopié peuvent ne plus êtredactualité. A vous de trier parmi les différentes fiches de cours et lesdifférents items proposés ceux qui restent en accord avec les coursdispensés par mesdames et messieurs les professeurs. Nhésitez pas à signaler toutes les erreurs éventuelles ouremarques concernant ce polycopié sur tutoweb dans la rubrique« Forum polycopiés » ou lors de lune des permanences du tutorat.En aucun cas le contenu de ce polycopié ne pourraengager la responsabilité de la faculté de médecine oude mesdames et messieurs les professeurs.Ce polycopié a été réalisé par :Mirvat Hamdan, Nicolas BernabeuYohann Vergès, Claire BuiretteJulie Calonge ,Marine HermanCapucine TatinRelecture par les tuteurs des années 2010-2011Compilé par Guillaume Gilbert© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 3
  4. 4. PlanI Présentation de la biologie moléculaire page 5II Notions de cours page 6III QCM d’entraînement page 32IV Correction détaillée du concours officiel de janvier 2006 page 173V QCM supplémentaires du Tutorat 2005 - 2006 page 181© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 4
  5. 5. I Présentation de la biologie moléculaire et du polycopié La biologie est une matière qui n’est pas des plus difficiles pour le concours d’après lesétudiants. Cependant, la partie qui pose généralement le plus de problème est celle quiconcerne les techniques et animaux transgéniques. Il y a de nombreuses notions à apprendre par cœur mais relativement peu par rapport àl’ensemble des autres matières. Il s’agit en fait plus d’exercices de compréhension et delogique. L’entraînement à ces exercices est primordial, d’où l’importance d’assister auxséances de TD durant lesquelles les réponses des QCM du polycopié d’entraînement de lafaculté vous serons données ; vous pourrez aussi y posez vos questions et suivre quelquesrappels de cours. Ce polycopié que nous avons réalisé pour le T.A.T a pour vocation de vouspermettre un entraînement varié et optimal pour le concours. Nous avons essayé de suivredirectement le modèle des QCM de la faculté, mais il est fort possible qu’un petit nombredes QCM que vous trouverez ici sont plus ardus et font référence à des détails pluspoussés que ceux demandés le jour du concours. Ne vous focalisez pas sur ces éléments. Si vous avez des questions, consultez le forum http://www.tutoweb.org ou lestuteurs que vous trouverez pendant les permanences du Tutorat. Dans les cas éventuels où il y aurait des erreurs concernant les QCM ou les fiches decours de ce polycopié, nous mettrons en ligne (sur le site) les errata correspondant et nousvous en informerons par l’intermédiaire des colles. Bonne chance à tous ! NB : vous aurez besoin du tableau du code génétique et de la correspondance desbases wobble (qui ne sont pas inclus dans ce poly, mais qui sont présents sur la premièrepage de chaque sujet de concours de la fac) pour répondre à certains QCM.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 5
  6. 6. II Fiches de cours Voici un petit nombre de fiches explicatives de points du cours qui peuvent poser problème.Beaucoup d’autres éléments indispensables à assimiler sont expliqués dans la correction des QCM quiconcernent directement ces points (partie IV). Les tuteurs éditerons des fiches explicatives au cours del’année s’il apparaît que certains points du cours ne sont pas bien compris par une grande partie desétudiants. Si certaines choses restent mystérieuses à vos yeux, le forum tutoweb.org et les permanencesdes tuteurs sont là pour vous les expliquer. - Classification des acides aminés page 7 - Dosage et densité optique page 8 - Chromatographies échangeuses d’ions page 9 - Bases, nucléosides et nucléotides page 10 - Enzymes de restriction page 13 - Sondes page 14 - Amplification élective in vitro : PCR page 19 - Analyse du génome page 21 - Séquençage nucléotidique page 23 - Analyse de lexpression des gènes page 24 - Analyse génotypique page 28© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 6
  7. 7. Classification des acides aminés (aa) 1 AA = une fonction amine NH2 + un radical R + une fonction acide carboxylique COOH R – CH – COOH le carbone lié a la fois au groupement COOH et / NH2 est dit « carbone α » NH2 Selon la nature de R on parle d’AA polaires ou apolaires, il s’agit de la réaction de l’AA vis-à-vis de l’eau. En effet le corps humain est constitué en grande majorité d’eau, il est logique d’envisagerla réaction des AA dans un milieu aqueux.  Polarité : tendance de la molécule à agir avec l’eau au pH physiologique de 7,42 ------------------------------------------/--------------------------------------------------> acide 7,42 alcalin AA apolaires AA polaires Neutres Acides Basiques Glycine G (Gly) Serine S (Ser) Ac. Aspartique Lysine K Alanine A (Ala) Thréonine T (Thr) D ( Asp) (Lys) Valine V (Val) Asparagine N (Asn) Leucine L (Leu) Glutamine Q (Gln) Ac. Glutamique Arginine R Isoleucine I (Ile) Cystéine C (Cys) E (Glu) (Arg) Phenylalanine F (Phe) Tyrosine Y (Tyr) Tryptohane W (Trp) Histidine H Méthionine M (Met) (His ) Proline P (Pro)Quelques petites précisions sur les AA qui tombent souvent dans les QCMs!Glycine ou Glycocolle: le plus petit des AA (R=H)Proline: iminoacide (fonction imine NH), cyclique donc jouant un rôle important dans la structure spatialedes protéines.Cystéine: présence dun groupement Thiol SH qui, par condensation de deux cystéines, permet laformation dun pont dissulfure et lobtention dune cystine.Asparagine et Glutamine: amidesAc aspartique et ac glutamique: ac dicarboxyliques ( 2 fonction COOH)Au sein d’une protéine dans un milieu aqueux :- les AA apolaires sont enfouis au cœur de la protéine- les AA polaires sont à la surface, en contact avec l’eau=> substituer un AA par un autre de la même polarité au sein d’une même protéine a moins d’effet surson éventuelle déformation que si les deux acides aminés nont pas la même polarité.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 7
  8. 8. Dosage et densité optique Pour mesurer la concentration (dans une solution) de certaines molécules organiques, on peututiliser la spectrophotométrie. Il s’agit de mesurer en unités arbitraires la D.O. (ou densité optique) d’unesolution traversée par un faisceau de lumière, et dont la longueur d’onde λ est fixée au préalable parl’expérimentateur. Pour calculer la D.O., on mesure l’intensité du faisceau lumineux avant et après la traversée de la 1,2 solution. Ainsi : D.O. = log I0 1 I 0,8 0,6 D.O. Retenir absolument que : 0,4 - les Bases azotées puriques et pyrimidiques 0,2 présentent un pic d’absorption à 260 nm 0 - le PHénol à 270 nm 250 260 270 280 nm nm nm nm - les Protéines à 280 nm (exemple de moyen mnémotechnique : BFP) NB : Présenter un pic d’absorption ne veut pas dire que le composé n’absorbe pas une lumière monochromatique d’une autre λ mais qu’il absorbe le plus la lumière à la λ qui donne le pic - 1 D.O. à 260 nm est équivalente à une concentration de 50 μg/ml de DNA double brin ou de 40 μg/ml de DNA simple brin ou de RNA. Donc l’ARN absorbe plus que l’ADN à 260 nm (parce que pour absorber la même valeur on a besoin de moins d’ARN que d’ADN).Applications : - Apprécier le degré de pureté du DNA : Pour savoir si une solution contient du DNA pur ou contaminé par des protéines, on fait 2 mesures, la 1ère à 260 et une 2nde 280 nm. Les protéines présentent un pic d’absorption à 280 nm mais absorbent aussi à 260 nm, même si l’absorption est moins importante. Après les 2 lectures, on fait le rapport D.O. 260 D.O. 280 Si le rapport est de l’ordre de 1,8-2 (ou plus) => la solution d’acide nucléique est pure Si le rapport est inférieur à 1,8 => solution d’acide nucléique contaminée par des protéines On peut aussi faire le rapport DO 280 / DO 260 : Si le rapport est denviron = 0,5 => pure Si le rapport est > 0,5 => contaminée - Apprécier le degré de contamination par du phénol : On fait le rapport D.O. 260 D.O. 270© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 8
  9. 9. Chromatographies échangeuses d’ions Petit rappel essentiel : Les CATIONS sont chargés + et se déplacent vers la CATHODE qui est chargée – Les ANIONS sont chargés – et se déplacent vers l’ANODE qui est chargée + A un pH neutre, un aa ACIDE est ANIONIQUE et un aa BASIQUE est CATIONIQUE Les chromatographies échangeuses d’ions se font sur des résines chargées électriquement. Ellesservent à détecter et isoler les ions d’une même charge. Elles se font en général sur des colonnes ourésines sur lesquelles des groupements de charges positives ou négatives sont liées par covalence. On faitpasser sur ces résines les solutions, et y adhèrent les groupements de charge opposée au support. En find’expérience on peut faire passer une solution éluante, plus chargée que la résine et qui entre encompétition avec elle, qui permet le décrochage des éléments accrochés.Résine échangeuse Ions fixés Charges électriques résineD’anions anions (-) positivesDe cations cations (+) négativeConseil : Ce sont en général des acides aminés qu’il vous sera donné de séparer par cette méthode.Il est préférable de toujours poser vos acides aminés sur une feuille à part et faire un petit tableau. Cesacides aminés baignent dans un milieu de pH qui vous sera donné. Marquez le pH du milieu à l’aide d’ungros trait en considérant la ligne horizontale comme l’échelle du pH allant croissant de gauche à droite. pH de l’expérience aa acides aa neutre aa basiques pHiA pHiN pHiB pH Il s’agit ensuite de comparer le pH du milieu et le pHi des acides aminés. Soit le pH du milieu estextrême donc vous saurez pertinemment le situer par rapport à celui des acides aminés (si les valeurs nesont pas données, on peut retenir pHiA=2, pHiN=7, pHiB=12), soit il vous sera fourni dans l’exercice lepHi de chacun des acides aminés mis en question.- Si pH < pHi, c’est le milieu qui est plus acide, les acides aminés seront basiques par rapport au milieu,ils attirent donc les protons et se chargent positivement.- Si pH > pHi, les acides aminés sont acides par rapport au milieu, ils céderont des protons au milieu etseront chargés négativement. Ainsi, après une chromatographie, les aa seront Une résine échangeuse de cation peut être séparés en fonction de leur charge : les élués (non représentée ainsi : fixés à la colonne) seront ceux de même charge que la résine. Tandis que ceux de charge opposée seront fixés. Plus l’acide aminé a un pHi éloigné du pH du milieu plus il sera acide ou basique par rapport à celui-ci, donc d’autant plus chargé ; il sera le premier à être élué ou fixé, si respectivement il est ou n’est pas de même charge que la résine.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 9
  10. 10. Bases, nucléosides et nucléotidesI - LES BASESBases puriques et pyrimidiques : Elles dérivent d’hétérocycles azotés : le noyau purine ( 2 cycles) ou le noyau pyrimidine (1 cycle).Ces 2 cycles sont insaturés, conjugués, les liaisons peuvent donc se déplacer. PURIQUES PYRIMIDIQUES C : Cytosine A : Adénine U : Uracile G : Guanine T : Thymine Bases : - communes au DNA et RNA : A, C et G - spécifique au RNA : U - généralement spécifique au DNA : TIsoméries et tautoméries des bases : Amine NH2  Imine NH Cétones O  Hydroxyle (énol) OHChaque radical des bases peut être présent sous 1 des 2 formes tautomériques, ces 2 formes étant enéquilibre mais il y en a toujours une dominante par rapport à l’autre : la forme amine et la forme cétone.Dérivés de bases : - A partir de la purine (A ou G), et par une succession de désaminations et d’oxydations : Base Purique Hypoxanthine (Hx) Xanthine Acide Urique Présente dans certains ARNt (de Chez l’homme, étape finale du transfert) dans les anticodons catabolisme. Nombre de 1 (en 6) 2 (en 2 et 6) 3 (en 2, 6 et 8) radicaux OH et positions Pathologie Présente anormalement en En cas d’excès, pathologie de grande quantité dans le DNA en la goutte cas d’attaque oxydative - Bromouracile (BrU) :Le BrU est un analogue de la thymine, sa présence augmente la présence des formes tautomériques rares,donc de mésappariements. C’est un agent mutagène, il augmente près de 100 fois le risque de mutations.Le BrU s’apparie normalement avec A, mais présente une forme énol 100 fois plus abondante quis’apparie avec G. - Méthylxanthines : Triméthylxanthine : caféine Diméthylxanthine : théophylline et théobromine© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 10
  11. 11. Ce sont des excitants au niveau cardiaque et du SNC :- effets inotrope ( force de contraction du cœur ) et chronotrope ( fréquence cardiaque) positifs =>augmente le débit cardiaque, mais avec une certaine limite (si excès, le débit chute).- effet broncho-dilatateur sur les muscles lisses bronchiques, utilisés pour calmer la crise d’asthme.II – LES NUCLEOSIDES = Association d’une base avec un sucre qui peut être - soit le ribose : dans le RNA  forme un ribonucléoside - soit le désoxyribose : dans le DNA  forme un désoxyribonucléoside Base Associée au ribose Associée au désoxyribose RIBONUCLEOSIDE DESOXYRIBONUCLEOSIDE A Adénosine A Désoxyadénosine dA G Guanosine G Désoxyguanosine dG U Uridine U C Cytidine C Désoxycytidine dC T Ribothymidine T (dans ARNt) Thymidine dT Hx Inosine I (hypoxanthine + sucre)III – LES NUCLEOTIDES = Association d’un nucléoside (base + sucre) avec 1,2 ou 3 phosphates Le 1er phosphate est lié au sucre en 5’ par une liaison ester, puis entre les groupements phosphatesil y a établissement de liaison anhydride d’acide. RIBONUCLEOTIDES DESOXYRIBONUCLEOTIDES Base mono di tri mono di triincluse phosphaté phosphaté phosphaté phosphaté phosphaté phosphaté C CMP CDP CTP dCMP dCDP dCTP U UMP UDP UTP G GMP GDP GTP dGMP dGDP dGTP A AMP ADP ATP dAMP dADP dATP I IMP IDP ITP T TMP TDP TTP dTMP dTDP dTTPIl existe aussi des nucléotides cycliques : AMPc (3’-5’) et AMPc (2’-3’) (liaison phosphodiester)IV – LES DERIVES S-adénosylméthionine Rôle dans la méthylationPhosphoadénosylphosphosulfate Rôle dans la sulfatation Amino-acyl- AMP Intermédiaire de l’activation des AA dans la synthèse des protéines Acyl- AMP Intermédiaire de l’activation des acides gras dans leur transfert Co-enzymes NAD/ NADPUDP-glucose, CDP-choline, etc… Forme activée de diverses molécules pour leur transfert© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 11
  12. 12. Antimétabolites :6-mercaptopurine Atome de soufre en 6, utilisé pour le traitement des leucémies. Allopurinol Inhibiteur de la xanthine-oxydase, donc de la formation de l’acide urique => traitement de la goutte. Ce n’est pas un noyau purine !!! thioguanine Atome de soufre en 6 et fonction amine en 2. Utilisé dans le traitement des leucémies. 5-fluoro-uracile Analogue de la thymine, anti-cancéreux. 5- Analogue de la thymidine, Anti-herpès.iododésoxyuridine Puromycine Structure : adénine diméthylée + analogue ribose avec NH2 en 3’ + AA non présent chez l’humain (donc liaison amide entre ces 2 derniers !) Analogie avec l’extrémité CCA-terminale des tRNA portant un AA. La puromycine agit donc en compétition avec les tRNA, se pose sur le site A du ribosome et bloque la synthèse des protéines 5-fluorocytosine Anti-fongique AZT Anti HIV(azidothymidine) Acyclovir Structure proche dune guanosine. Anti herpès/varicell/zona Ara-C (cytosine Traitement des leucémies aigües. arabinoside) Gemcitabine 2 fluors au niveau du C2 du ribose accroché à une cytosine. Traitement des cancers.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 12
  13. 13. Enzymes de restriction Les enzymes de restriction coupent uniquement le DNA double brin ; ce sont des endonucléases,elles coupent à l’intérieur de la chaîne nucléotidique après reconnaissance d’une séquence spécifique.Ces endonucléases sont parfois synthétisées par des bactéries suite à une agression par des phages. Ellescoupent le matériel génétique du phage, ce qui neutralise son pouvoir infectieux.On classe les endonucléases de restriction en 3 catégories : Classe Reconnaissance de la séquence Lieu de la coupure spécifique I oui 1000 à 5000 pb plus loin II oui La séquence elle même III oui 20 pb plus loin Les endonucléases de classe II coupent des séquences dites « palindromiques », ce qui signifie enterme de DNA double brin que la séquence nucléotidique lue de 5’ en 3’ est la même sur les 2 brinscomplémentaires (parfois à l’exception de la base centrale, si la séquence de reconnaissance est impaire).On distingue 2 types de coupure : - la coupure franche : Après intervention de l’enzyme, la chaîne initiale de DNA est divisée en 2, les 2 bouts de chaîne étant droits. Ex : 5’--- G T T ║ A A C --- 3’ Hpa I 3’ ---C A A ║ T T G --- 5’ - la coupure cohésive ou saillante ou en baïonnette ou protrusive : L’enzyme coupe le palindrome au centre, en laissant 2 bouts saillants, ce qui permet le recollement des 2 extrémités si mises en présence, par complémentarité des bases azotées. Ex : 5’ --- G║AACTT C --- 3’ EcoRI ╚═════╗ 3’ --- C TTGAA║G ---5’Isoschizomères : Sont dites isoschizomères des enzymes de classe II reconnaissant la même séquence nucléotidiqueet la coupant de la même façon. Cependant il arrive que les conditions dans lesquelles les enzymes sontcapables d’exercer leurs fonctions ne soient pas les mêmes. Souvent, une des deux enzymes est sensible à la méthylation, c’est-à-dire que si la séquence estméthylée, l’enzyme sensible ne peut plus la couper. On peut donc utiliser les isoschizomères comme outildiagnostique, les méthylations pouvant être à l’origine de maladies génétiques.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 13
  14. 14. SondesPartie 1 : DENATURATION = FUSIONDénaturation = Fusion = passage de l’ADN double brin à l’ADN simple brin par coupure des liaisonshydrogènes suite à l’augmentation de la température. Evolution de la DO de l’ADN en fonction de la température. Rappel : ADN sb absorbe davantage qu’ADN db (cf. De Graeve)PARAMETRES INFLUENCANT LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm)Tm : température à laquelle les brins d’ADN sont dénaturés.- Composition en bases car fonction du nombre de liaisons : AT qui a 2 liaisons hydrogène, a un Tm plus faible (donc est plus facilement dénaturable) que GC qui a 3 liaisons hydrogène.- Longueur de l’Acide Nucléique car il y a une multiplication du nombre de liaisons hydrogène.- Présence de més/non-appariements car les liaisons hydrogène sont fragilisées : plus il y a de mésappariements, plus le Tm est abaissé).- Concentration en sels dans le milieu : la baisse de la concentration en sels diminue le Tm.NB : Une solution est d’autant plus stringente que sa concentration en sels est faible.- Formamide dans le milieu déstabilise le Tm.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 14
  15. 15. Partie 2 : HYBRIDATION = association de deux brins d’acides nucléiques complémentaires suite à un refroidissement lent.Attention ! Un refroidissement brutal condamne l’ADN à rester à l’état simple brin.FACTEURS INFLUENCANT L’HYBRIDATION - Cot (Concentration d’ADN et temps que l’on donne à ces séquences pour se réassocier)NB : Au Cot ½, 50% des séquences d’ADN sont associés. - Température qui doit être inférieure au Tm - Longueur des fragments - Complexité des séquences - Nature des acides nucléiques - Force ioniqueMETHODES1) Hybridation en phase liquide Applications : Taille du génome : Cot ½ proportionnel à la taille du génome Etude des séquences répétitives 1. Séquences hautement répétitives (satellites) 2. Séquences moyennement répétitives 3. Séquences uniques2) Hybridation sur support solide3) Hybridation in situ Application : Localisation d’un gène sur des chromosomes Criblage de banques FISH© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 15
  16. 16. Partie 3 : TECHNIQUE DE MARQUAGE DES SONDESSonde = séquence polynucléotidique complémentaire d’une séquence d’ADN ou d’ARN avec laquelleelle s’hybride.L’hybridation est spécifique (seule la sonde spécifique pourra s’apparier avec la séquencecorrespondante) et sa sensibilité dépend du marquage des sondes. Ce marquage peut être de deux types : - Radioactifs  sondes chaudes - Non radioactifs  sondes froides1) NICK TRANSLATIONBut : couper des petits bouts d’ADN pour les remplacer par de l’ADN marquéa) Cassures aléatoires par une endonucléase, laDNAseb) Agrandissement des cassures par l’activitéexonucléase 5’  3’ de l’ADNpol Ic) Synthèse d’ADN grâce à l’activité polymérasede l’ADNpol I en utilisant des dXTP marqués.Résultat : obtention d’un ADN bicaténairecontenant des nucléotides marqués sur les deuxbrins.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 16
  17. 17. 2) MULTI-RANDOM PRIMING = Multi-amorçage au hasardBut : Synthétiser de l’ADN marquéa) Chauffage de l’ADN double brin puisrefroidissement brutal entraînant une séparationdéfinitive des deux brinsb) Synthèse de façon aléatoire d’une multituded’amorces hexanucléotidiques.c) Parmi ces amorces, certaines vont forcémentrencontrer leurs séquences complémentaires surl’un des brins d’ADN.d) Synthèse d’ADN par l’ADNpol en utilisantdes dXTP marquésRésultat : obtention de deux molécules d’ADNbicaténaires dont un seul brin est marqué (parmolécule)3) T4 POLYNUCLEOTIDE KINASEMarque l’extrémité 5’ par ajout ou substitution du phosphate γ du 1er nucléotide.4) SONDES CLONNEES DANS LE PHAGE M13 Le phage M13 est un vecteur monobrin dont la séquence est entièrement connue et qui vatransporter la séquence d’ADN d’intérêt, la sonde. On créée une amorce complémentaire de la partie adjacente à la sonde. Cette amorce permet àl’ADNpol de synthétiser un brin d’ADN marqué à partir de dXTP marqués. Cette synthèse va très vites’interrompre et ne couvre ainsi que le gène d’intérêt.NB : la sonde elle-même n’est pas marquée, c’est son complémentaire.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 17
  18. 18. 5) RIBOSONDES : sondes ARN Nick Multi-Random T4 polynucléotideTechnique Phage M13 Translation Priming kinase Sur les deux Sur un des deuxMarquage brins d’ADN brins d’une Extrémité 5’ Vecteur par endroit molécule d’ADNAmorce ? Non Oui Non Oui Oui, car formationFragment Non de nouveaux brins Non Nonde Klenow (~ réplication) DNAse Amorces Phosphate marqué Amorce Outils ADNpol I ADNpol T4 polunucléotide Vecteur : phage dXTP marqués dXTP marqués kinase© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 18
  19. 19. AMPLIFICATION ELECTIVE IN VITRO : PCROBJECTIF : Amplifier la quantité d’ADN (uniquement l’ADN)OUTILS : - 2 amorces (= oligonucléotides) - ADNpol - Substrats : dXTPPRINCIPE : Grâce à un couple d’amorces strictement complémentaires des bornes de la région d’ADNà amplifier, on synthétise une très grande quantité d’ADN à la suite de plusieurs cycles.1) DENATURATION : séparation des brins paraugmentation de la température (95°C environ)2) HYBRIDATION des AMORCES avec lesbornes de la région à amplifier. (50°C environ)NB : la température doit être diminuée pour quel’hybridation est lieue.3) SYNTHESE : l’ADNpol synthétise del’ADN. Ainsi, à la fin d’un cycle, on double laquantité initiale. (70°C environ) Fin du CycleAprès n cycles, on obtient 2n nouveauxexemplaires du fragment d’ADN© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 19
  20. 20. RESULTATS :Qu’obtient-on au bout du 1er cycle ? 2 copies avec les extrémités 3’ variables.Qu’obtient-on au bout du 2ème cycle ? 8 copies dont 2 avec les extrémités 3’ fixesLIMITES : - Taille : on ne peut amplifier que des petits fragments (taille inférieure à 2 kpb) - Connaissance d’une partie de l’ADN à amplifier (pour l’amorce) - ADNpol thermorésitante est dépourvue de la fonction proof-reading d’où un risque d’erreur. - Amplification parasite : mauvaise hybridation et contaminationAPPLICATIONS : - Génération des sondes - Recherche de mutations - RT-PCR : étude des ARN - Clonage - PCR quantitative - PCR en temps réel : quantification précise© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 20
  21. 21. Analyse du génome Le génome comprend l’ADN génomique nucléaire et mitochondrial. Southern Blot 1. Méthode - Fragmentation de l’ADN (bicaténaire) par une enzyme de restriction - Séparation des fragments par électrophorèse - Dénaturation (solution alcaline sur le gel) - Transfert des fragments par capillarité sur une membrane (nylon ou nitrocellulose) - Fixation des fragments (UV ou chauffage) - Pré-hybridation des sites non occupés par un ADN hétérologue - Hybridation avec une sonde froide ou chaude : incubation de l’ADN fixé sur le support avec la sonde, puis lavages avec des solutions salines de force ionique variable : - Solution très concentrée (haute force ionique ou faible stringence) => Hybrides peu déstabilisés => signaux non spécifiques++ - Solution très diluée (faible force ionique, forte stringence) => Séparation de tous les hybrides => aucun signal après le lavage La taille des fragments peut être déterminée grâce à un système d’étalonnage avec des marqueurs de taille. 2. Application - Carte de restriction Identification de fragments d’ADN après digestion par des enzymes de restriction. Ex : SONDE 6kb 8kbEcoRIIndIII 7kb 10kb Southern Blot : - 10 kb 8 kb 7,5kb 7kb 6kb 5,5kb 1kb 0,5kb + EcoRI IndIII EcoRI+IndIII © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 21
  22. 22. - Détection : - de pseudo-gènes (gènes non fonctionnels car non transcrits) et de gènes apparentés (appartenant à la même famille, Hb par exemple), à la même superfamille (Ig par exemple) ou à différentes espèces (séquences homologues) : les séquences n’étant pas parfaitement complémentaire il ne faut pas que la stringence soit trop forte. - de polymorphismes (RFLP) - de délétions - de mutations ponctuelles - de recombinaisons 1. ExemplesQCM : À partir d’ADN génomique de deux individus A et B on analyse par Southern un fragment de600pb d’un gène porté par le chromosome X. Ce fragment ne contient qu’un seul site de restriction Apa I(insensible à la méthylation) et Hae III (sensible à la méthylation, cest-à-dire qu’elle n’agit pas quand lesite est méthylé).La sonde utilisée couvre tout le fragment du gène.Digestion par les enzymes. Résultats : Individu A Individu B Apa I - + - Apa I - + - HaeIII - - + HaeIII - - + 600 pb 400pb 200pbRappel : chez un homme (XY) les gènes du chromosome X sont actifs, tandis que chez une femme (XX)l’un des 2 X est inactivé « au hasard » par méthylation.Ce que l’on peut conclure à partir de ces résultats :L’individu A a un allèle coupé par Hae III mais pas l’autre, ce qui signifie qu’un des 2 allèles estméthylé. Cela correspond à un profil XX.Chez l’individu B tous les chromosomes X sont coupés par Hae III, donc aucun n’est méthylé, ce qui estcompatible avec le profil d’un homme.Rq : Une absence de signal peut correspondre à une grande délétion ou à une erreur technique !© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 22
  23. 23. Séquençage nucléotidiqueAussi appelé méthode de SANGER, le séquençage utilise des 2’-3’didésoxynucléotides. Méthode Pour séquencer une séquence d’ADN on place une amorce puis on synthétise son complémentaireavec des désoxynucléotides (dNTP), et une petite quantité de didésoxynucléotides (ddNTP) (rapport1/100 environ). Les ddNTP seront utilisés aléatoirement par la polymérase qui va les fixer au dNTPprécédent par le 3’OH. Ce 3’OH étant absent sur les ddNTP, leur fixation va interrompre la chaîne.On obtient ainsi toute une population de fragments interrompus à divers stades. Pour visualiser les fragments on peut marquer l’amorce (d’abord radiomarquées puis remplacéespar des amorces portant des fluorophores), les dNTP ou les ddNTP. Actuellement on utilisel’électrophorèse capillaire (migration dans de petits tubes capillaires). Le risque d’erreur lors duséquençage est de 1/100 000 bases. Exemple Marquage radioactif => Expérience divisée en 4 : ddATP + dNTP dans le tube 1, ddTTP + dNTPdans le tube 2, ddCTP + dNTP dans le tube 3, ddGTP + dNTP dans le tube 4Puis on fait migrer sur un gel d’électrophorèse : A T C G - 3’ Sens de migratio n du brin néosynthétisé + 5’On a donc : Brin complémentaire : 5’ ATACGTACTGTA 3’ Séquence initiale : 3’ TATGCATGACAT 5’ La synthèse du brin néosynthétisé se fait de 5’ en 3’.Sur le gel, les brins d’ADN les plus proches de l’anode (-) sont ceux qui ont migré le moins, ce sont doncles plus grands, ce sont ceux qui ont incorporé le plus tardivement un ddNTP, ils correspondent àl’extrémité 3’. Les brins les plus petits migrent beacoup et sont proches de la cathode. Ainsi la lecture dela séquence se fait dans le sens inverse du sens de migration électrophorétique. Pour connaître la séquenceinitiale on prend le complémentaire du brin néosynthétisé. Si on utilise la fluorescence on marque lesdifférentes bases avec un fluorophore différent dans 4 tubes différents puis on mélange et on fait migrersur un gel d’électrophorèse : on obtient alors une succession de pics fluorescents (sens 5’-3’ généralementde gauche à droite).© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 23
  24. 24. Analyse de lexpression des gènesExpression des gènes => mRNA : fragiles (détruits par les ribonucléases), peu abondants et tissuspécifiques (par exemple le gène de l’Hb est très exprimé dans les cellules hématopoïétiques). I. Analyse qualitative des ARN 1. Northern Blot a. MéthodeElectrophorèse des ARN en gel dénaturant, transfert sur une membrane et hybridation avec une sonde =>PAS DE FRAGMENTATION (≠ Southern blot)Le gel dénaturant sert à éviter les structures secondaires qui peuvent modifier la migration des ARN, ilsmigrent ainsi seulement suivant leur taille, ce qui permet par exemple d’identifier des RNA ayant subi desépissages alternatifs. b. ExemplesL’étude en Northern Blot d’un ARN donné chez 3 individus donne les résultats suivants : 1 2 3 2,8kb Individu 1 : peut être hétérozygote pour un défaut d’épissage, une délétion… 2kb Individu 2 : peut être homozygote pour une délétion de tout le gène. Ce résultat peut aussi être dû à une erreur technique. 1,2kb Individu 3 : peut être homozygote pour un défaut d’épissage ou une délétion© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 24
  25. 25. 2. Cartographie à la nucléase S1 ou à la RNase A Rappel : La nucléase S1 clive seulement l’ADN ou l’ARN simple brin. La RNase A n’agit que sur l’ARN simple brin. Cette méthode sert à repérer les mésappariements entre un mRNA et une sonde d’ADN génomique (on utilisera alors la nucléase S1) ou une ribosonde (RNase A). Gel d’électrophorèse - Sonde marquée Nucléase S1 ouNucléase S1 RNase Aou RNase A + La nucléase S1 permet de cliver des mésappariements de plus de 3 bases. La RNase A permet de cliver les mésappariements de 1 base ou plus. 3. RT-PCR a. Méthode C’est une PCR précédée d’une rétrotranscription. C’est une technique sensible qui permet d’amplifier suivants les amorces choisies tel ou tel ARN sous forme de cDNA. Elle a notamment démontré le phénomène de transcription illégitime, cest-à-dire que dans chaque cellule tous les gènes sont transcrits mais en plus ou moins grande quantité selon la différenciation de la cellule. b. Remarques Penser que les cDNA sont exempts d’introns. Les modifications de taille des cDNA peuvent être dus à des épissages alternatifs ou à des mutations entraînant des défauts d’épissage (conservation d’introns ou excision d’exons),… L’absence de résultat peut être dû à une mutation dans la région d’appariement des amorces ou à une erreur technique. © Tous droits réservés au Tutorat Associatif Toulousain Sauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 25
  26. 26. II. Analyse quantitative des ARN Dot Blot On dépose des ARN issu de cellules sur une membrane et on hybride avec une sonde permettant de voir ce que l’on cherche. On compare ensuite l’intensité du signal obtenu avec l’intensité du signal obtenu par la gamme étalon, ce qui permet d’avoir une analyse quantitative. III. Analyse de la transcription = analyse de l’activité transcriptionnelle d’un gène donné Pour cela on poursuit dans le tube à essai la transcription qui se produit dans une cellule vivante= RUN ON. L’activité transcriptionnelle d’un gène donné est proportionnelle à la quantité de RNApolymérases fixées sur ce gène et au nombre de mRNA produits IV. Analyse des mécanismes de régulation des gènes Cette régulation passe par la présence de protéines qui se fixent sur l’ADN : facteurs derégulation, facteurs de transcription… 1. Foot printing On part du principe que ces différentes protéines régulatrices fixées sur l’ADN vont protéger cedernier de l’action des nucléases. Pour visualiser cette interaction il faut marquer l’ADN en 5’ grâce à la polynucléotide kinase. La DNase I clive ces molécules n’importe où (ADN non protégé) et va donc cliver en dehors desrégions occupées par les protéines. C’est une technique précise qui fait en quelque sorte l’empreinte de la protéine et définit ainsi lesiège de l’interaction ADN/protéine. 2. Retardement sur gel ou gel shift a. Méthode Permet de déterminer la spécificité de liaison d’un facteur de transcription (FT) à une séquencedonnée d’ADN. Pour cela on synthétise cette séquence (oligonucléotide=ON), on la marque et on l’incube avecdes extraits nucléaires. On fait migrer ce complexe et on étudie sa spécificité grâce à des compétiteursspécifiques ou non (séquence hétérologue dIdC par exemple). On peut aussi faire un supersshift, cest-à-dire que l’on met l’oligonucléotide en présence du FTavec des anticorps anti-FT : ce complexe va alors être encore plus retardé.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 26
  27. 27. b. Exemples 1ère étape : synthèse et marquage de l’oligonucléotide au 32P (radioactif) puis électrophorèse.L’ON marqué va migrer en fonction de sa taille et de sa charge vers l’anode (apparition d’une bande).Puis on met cet ON en présence d’une solution de protéines : - si fixation protéique : 1 bande + 1 bande retardée qui a migré moins loin car plus lourde (formation de complexes ON-protéines) - si pas de fixation protéique : 1 seule bande comme le témoin La 2ème étape consiste à savoir si cette liaison est spécifique. Pour cela on ajoute un compétiteur(de séquence très différente de l’ON) : - si la liaison est non spécifique, une partie de la banderetardée disparaîtra. - si la liaison est spécifique, la bande restera inchangée en présence d’un compétiteur de séquence très différente alors qu’elle aura tendance à disparaître en présence d’une grande quantité de l’ON non marqué.2 : ON marqué + solution protéique => Retard donc fixation3 : ON marqué + solution protéique + compétiteur de séquence différente => pas de changement =>liaison spécifique4 : ON marqué + solution protéique + compétiteur de séquence différente => diminution du signal de labande retardée => liaison non spécifique5 : ON marqué + solution protéique + ON non marqué en grande quantité => diminution du signal de labande retardée => liaison spécifique© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 27
  28. 28. Analyse génotypique I- Pathologies de l’ADN : héréditaires (maladies génétiques) ou acquises (cancers, maladies infectieuses ou parasitaires). II- Pour toute analyse génotypique il faut : une séquence connue ou une sonde adéquate III- 2 types de diagnostics génotypiques : DIRECT (on connaît le gène ou le locus affecté par la pathologie) ou INDIRECT (plus complexe, il utilise des méthodes dites indirectes pour préciser le risque chez un individu d’être atteint ou non, sans connaître la séquence impliquée). IV- Rappel : règles de généalogie : - Stratégies diagnostiques 1. Le diagnostic génotypique direct (DGD)Il passe par la recherche de sites polymorphes associés à la maladie.Plusieurs techniques peuvent être utilisées suivant la nature des lésions : I- Lésions grossières (inversion, fusion, translocation, délétion,…) : Southern ou PCR Par exemple pour les délétions on va avoir une diminution de taille du fragment ou une absence designal. Mais attention, une absence de signal complète est difficile à interpréter car elle peut signifier unedélétion totale ou erreur technique. Donc on étudie aussi l’expression d’un gène domestique (si absencede signal => erreur technique). Aujourd’hui on remplace le Southern par la PCR : on amplifie ainsi la région que l’on veut. Sil’amorce est dans la région délétée, on n’aura pas d’amplification de l’ADN et donc pas de signal. V- Mutations ponctuelles :1. Carte de restriction Mutation entraînant la création ou l’abolition d’un site de restriction pour une enzyme donnée. - Hybridation spécifique d’allèle (ASO= oligosonde spécifique d’allèle) Elle met en évidence une mutation particulière. On synthétise et on marque une sonde « normale » et une sonde « mutée » que l’on pose sur unemembrane puis on met chaque sonde avec l’ADN du patient.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 28
  29. 29. ASO normal = N = normal, M = mutéASO muté = N/N N/M M/MExemple : Le patient 1 est hétérozygote pour la mutation étudiée. Le patient 2 peut être homozygote (muté) ou bien hétérozygote muté/délété. Le patient 3 est soit homozygote pour la délétion de la région étudiée ou il y a eu une erreur technique. Le patient 4 est soit homozygote normal ou hétérozygote normal/délété (pour Levade, on parle dhomozygote pour un individu malade seulement)La présence d’une mutation n’implique pas que l’individu soit porteur d’une maladie.A l’inverse l’individu avec un ASO normal n’est pas forcément sain ! - PCRElle peut être suivie d’une digestion enzymatique de restriction ou d’un ASO.Exemple : EXON 4 (250 pb) Amorces de PCRUne mutation ponctuelle dans cet exon introduit un site pour l’enzyme de restriction Hind III.Une électrophorèse est réalisée après PCR de cette région génique sur l’ADN de plusieurs sujets puisincubation avec Hind III (digestion complète). Puis coloration au bromure d’éthidium.Résultats : 1 2 3 On peut dire que :250pb - le sujet 1 est hétérozygote N/M - le sujet 2 est homozygote N/N ou hétérozygote N/D - le sujet 3 est homozygote M/M ou hétérozygote M/D150pb N = non muté (pour la mutation étudiée)100pb M = muté D = délété pour toute la région étudiée© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 29
  30. 30. Rq : L’apparition de bandes de faible intensité correspond à des amplifications parasites : les amorcesse sont hybridées sur des zones du génomes dont elles ne sont pas tout à fait complémentaires. Pour évitercela on peut modifier les conditions de stringence (augmentation température par exemple). Attention aussi à d’éventuelles contaminations par un fragment d’ADN étranger qui peut fausserles résultats. (peut être mis en évidence par la réalisation d’un « tube blanc ») VI- Détection d’une mutation inconnue 1. Séquençage : le plus souvent on séquence le cDNA car il est plus court. 2. Méthode à la RNase A (détecte des mutations ponctuelles ≠ nucléase S1) 3. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Dans cette méthode on part du principe que la présence d’une mutation ponctuelle dans uneséquence donnée peut modifier la température de fusion (Tm) du domaine muté. On met donc l’ADN double brin sur un gel électrophorétique avec une concentration croissante degel dénaturant : la séparation des brins va ralentir leur progression, on considère qu’elle est stoppée.ATTENTION : une mutation n’entraîne pas forcément de différence de migration ! SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) Pour cette méthode on considère qu’une mutation du DNA génomique peut entraîner unemodification de la conformation des brins séparés. Pour le mettre en évidence on marque les extrémités grâce à la polynucléotide kinase, on dénatureles doubles brins puis on les refroidit brutalement pour qu’ils restent physiquement séparés. Sur l’électrophorèse des conformations différentes vont entraîner des migrations différentes.ATTENTION : - Il n’y a pas d’agent dénaturant sur le gel électrophorétique. - Cette différence de migration est possible mais pas systématique - S’il y a une différence, c’est qu’il existe une mutation : pour savoir de quelle nature estcette mutation il faut faire un séquençage. - Une mutation n’entraîne pas forcément de différence de conformation.Rq : ces deux méthodes DGGE et SSCP peuvent permettre de mettre en évidence la présence d’unemutation mais ne renseignent pas sur la nature de cette mutation. 2. Diagnostic génotypique indirect 1. MéthodeRFLP = Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction = variations interindividuelles deséquences, révélées par des modifications de la carte de restriction. Ces variations sont souvent dans des régions non codantes (intergéniques, régulatrices, introns,…)et n’ont pas de rôle pathologique en elles-mêmes. On étudie alors l’abolition ou la création de sites de restriction et la probabilité de leur associationavec une pathologie donnée.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 30
  31. 31. Cette méthode nécessite des sites de restriction polymorphes et l’étude d’un grand nombremembres d’une famille où les personnes atteintes ont le même polymorphisme. Le diagnostic sera d’autant plus fiable que le site de restriction est proche du locus impliqué dansla maladie (car cela diminue le risque de recombinaison). Lorsque l’on analyse des polymorphismes intra ou juxta-géniques, on parle de diagnostic semi-direct, et lorsque les marqueurs sont extra-géniques, on parle de diagnostic indirect.ATTENTION : Ce sont des diagnostics probabilistes, il n’y a pas de certitudes absolues ! 2. Exemples Exemple 1 : Diagnostic prénatal par RFLP pour une maladie autosomale récessive (avec utilisation d’une sonde et d’une enzyme de restriction donnée) : pour chaque individu on donne la taille des fragments sur chaque allèle.Le fœtus aura un allèle de chacun de ses parents soit : 600/500 ou 800/500 ou 800/700 ou 600/700.Les parents sont hétérozygotes pour la maladie.Au vu des résultats, la maladie semble provoquée par l’association des fragments 700 et 800. Exemple 2 : Un test de diagnostic prénatal est basé sur l’analyse d’un RFLP pour une maladie autosomale récessive.Les résultats de la famille A ne peuvent pas être interprétés car on ne connaît pas le profil de l’enfantdécédé.Pour la famille B, le fœtus pourra être 3-3 et sera probablement porteur de la maladie, 3-1 donc hétérozygote et indemne 1-1 donc homozygote indemnePour la famille C, pas de prédiction possible car les régions étudiées ne semblent pas être en rapportavec l’état malade ou non.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 31
  32. 32. III QCM d’entraînement - GENERALITES SUR LES PROTEINES - NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES - ADN - REPLICATION - ELEMENTS GENETIQUES MOBILES - STRUCTURES DES GENES - ARN ET TRANSCRIPTION - TRADUCTION - MUTATIONS ET MUTATIONS HEMOGLOBINE - ANTIBIOTIQUES ET ANTIMETABOLITES - TECHNIQUES GENERALES – OUTILS ENZYMATIQUES - HYBRIDATION MOLECULAIRES ET SONDES - PCR - SOUTHERN ET CARTOGRAPHIE RNASE - SEQUENCAGE (SANGER) - ANALYSE DE L’EXPRESSION DES GENES - ANALYSE GENOTYPIQUE - VECTEURS ET CLONAGE - ANIMAUX TRANSGENIQUES - TECHNIQUES EN VRAC Avec la participation de léquipe de Biologie Moléculaire 2006-2007 et relecture des tuteurs 2009-2010 et 2010-2011© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 32
  33. 33. GENERALITES SUR LES PROTEINES 44 QCMQCM 1 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A/ Le génome représente l’ensemble de l’ADN nucléaireB/ Les « séquences poubelles » entre les différents gènes n’ont aucun rôleC/ Un gène codant pour une protéine, il y a autant de protéines que de gènesD/ Le génome nucléaire humain comprend entre 30 000 et 50 000 gènesE/ Le génome des cellules de notre foie est différent avant et après le réveillonQCM 2 : Parmi les acides aminés suivants :A/ Glu B/ Asp C/ Leu D/ Gly E/ ProLe(s)quel(s) vous attendez-vous à trouver à l’intérieur d’une protéine ?QCM 3 : Parmi les acides aminés suivants :A/ Gln B/ His C/ Lys D/ Asp E/ ProLe(s)quel(s) est (sont) acide(s) ?QCM 4 : Parmi les acides aminés suivants :A/ Asp B/ Arg C/ Val D/ Leu E/ MetLe(s)quel(s) est (sont) retenu(s) par un tampon à pH 2 lors d’une chromatographie échangeuse decations ?QCM 5 : Les acides aminés :A/ Sont au nombre de 20 dont un est en fait un acide iminé (le tryptophane)B/ Certains sont hydrophobes (apolaires) et d’autres hydrophiles (polaires)C/ Les acides aminés apolaires peuvent être acides, neutres ou basiques au pH physiologiqueD/ Portent leur radical sur le carbone α (alpha)E/ Ont tous une seule fonction amine (NH2) et une seule fonction acide (COOH)QCM 6 : Parmi les acides aminés suivants :A/ Glu B/ Arg C/ Val D/ Ser E/ AsnLe(s)quel(s) est (sont) chargé(s) au pH physiologique ?QCM 7 : Parmi les acides aminés suivants :A/ His B/ Tyr C/ Asp D/ Met E/ LeuLe(s)quel(s) est (sont) polaire(s) ?QCM 8 : Parmi les acide aminés suivants :A/ Thr B/ Gln C/ Ala D/ Trp E/ GluLe(s)quel(s) est (sont) apolaire(s) ?QCM 9 : Parmi les acides aminés suivants :A/ His B/ Gly C/ Ser D/ Cys E/ AspLe(s)quel(s) est (sont) élué(s) par un tampon à pH 10 lors d’une chromatographie échangeuse de cations ?QCM 10 : A propos des acides aminés :A/ Ils sont classés en différentes catégories selon leur capacité à interagir avec l’eauB/ La proline induit un coude dans les protéines qui la contiennentC/ Le radical de la glycine correspond à un atome d’hydrogèneD/ Il y a plus d’acides aminés apolaires différents que d’acides aminés polaires neutres différentsE/ La cystéine possède un atome de soufre© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 33
  34. 34. QCM 11 : Les protéines :A/ Sont formées par combinaison linéaire d’acides aminésB/ Une molécule d’eau est éliminée lors de la formation de la liaison peptidiqueC/ Sont des enchaînements de plus de 100 acides aminés et de poids moléculaire (PM) supérieur à 10 000sinon on aurait appelé ces enchaînements des polypeptidesD/ Ont toutes une structure quaternaireE/ Possèdent un potentiel informationnel considérableQCM 12 : Structure des polypeptides/protéines :A/ Un polypeptide de 10 acides aminés peut prendre 100 structures primaires différentes (10²) selon lesacides aminés qui le composentB/ La structure secondo-tertiaire correspond à la structure spatiale de la protéineC/ La structure secondaire correspond à la géométrie dans l’espace des liaisons peptidiquesD/ La structure tertiaire correspond au positionnement dans l’espace des radicaux de chaque acide aminéE/ Ces repliements sont nécessaires au fonctionnement normal de la protéineQCM 13 : Electrophorèse :On réalise une électrophorèse à pH 7,5 d’un mélange d’acide aspartique, de lysine et de proline. Quellesera la migration obtenue ?A/ (pole -) Asp, Pro, Lys (pole +) B/ (pole -) Pro, Lys, Asp (pole +)C/ (pole -) Lys, Pro, Asp (pole +) D/ (pole -) Asp, Lys, Pro (pole +)E/ (pole -) Lys, Asp, Pro (pole +)QCM 14 : Classification des protéines :A/ Les holoprotéines comprennent l’apoprotéine et un groupement prosthétiqueB/ On classe les protéines selon leur forme en albumines et globulinesC/ Leurs fonctions sont extrêmement variées : structure, récepteur, catalytique, transport, régulation…D/ Les protéines globulaires ont un rôle de soutien, de protectionE/ Ces différences de propriétés entre les protéines sont exploitées en biologie moléculaire afin de lesséparer par diverses techniques (chromatographie, centrifugation, électrophorèse…)QCM 15 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A/ Les acides nucléiques sont solubles dans le phénolB/ Chloroforme et éther à volume équivalent (1/1, v/v) servent à extraire le phénolC/ L’isopropanol permet l’extraction du bromure d’éthidiumD/ Les acides nucléiques sont précipités dans les solutions aqueuses salées à faible concentrationE/ Les protéines sont solubles dans les solvants organiquesQCM 16 : Chromatographie d’exclusion-diffusion (gel filtration) :A/ La séparation repose sur la taille et le poids moléculaire (PM) des moléculesB/ Si on verse un mélange de protéines et de polypeptides ce sont les protéines qui sont le plus retenuescar ce sont des molécules plus grosses donc leur passage à travers le gel est plus difficileC/ Pour que les premières molécules commencent à sortir il faut verser un volume supérieur au volume dela colonne (dit « volume mort »)D/ Si on doit se placer dans des conditions expérimentales qui empêchent l’agrégation des molécules encomplexe c’est justement car cette technique se base sur la taille des molécules et que celle-ci s’entrouverait modifiéeE/ Cette méthode permet de calculer la taille et le poids moléculaire des protéines si le dispositif estcorrectement étalonné© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 34
  35. 35. QCM 17 : Les protéines :A/ Ont un sens conventionnel d’orientation : l’extrémité N-terminale à gauche et l’extrémité C-terminaleà droiteB/ Présentent un pic d’absorption maximal à 280 nmC/ Sont issues de l’expression des gènes après transcription et réplicationD/ Ont plus de chance de perdre leur fonction si la mutation qui se produit est la substitution d’un acideaminé polaire par un acide aminé apolaire que s’il s’agit d’une substitution par un autre acide aminépolaireE/ Les albumines sont modérément solubles dans l’eau mais solubles dans les solutions salinesQCM 18 : Parmi les acides aminés suivants :A/ Glu B/ Asn C/ Lys D/ Pro E/ PheLesquels sont élués les premiers par un tampon à pH 5 lors d’une chromatographie échangeuse d’anions ?QCM 19 : Electrophorèse :On réalise une électrophorèse à pH 4 d’un mélange d’acide glutamique, d’histidine et de serine. Quellesera la migration obtenue ?A/ (pole -) Glu, Ser, His (pole +) B/ (pole -) Ser, Glu, His (pole +)C/ (pole -) His, Glu, Ser (pole +) D/ (pole -) Glu, His, Ser (pole +)E/ (pole -) His, Ser, Glu (pole +)QCM 20 : Densité optique (DO) :A/ Les protéines présentent un pic d’absorption maximal à 280 nmB/ Pour une quantité donnée d’ADN en solution, la DO à 280 nm du double brin est inférieure à celle dusimple brinC/ La recherche de contamination des acides nucléiques par des protéines s’effectue en mesurant lerapport DO à 280 nm sur DO à 260 nm ; pour être optimal il doit être de l’ordre de 1,8 – 2D/ Le phénol présente un pic d’absorption maximal à 260 et 280 nmE/ La mesure de la densité optique à 260 nm d’une solution d’ADN permet d’évaluer sa concentrationQCM 21 : Parmi les acides aminés suivants :A/ Ala B/ Tyr C/ His D/ Arg E/ AspLesquels sont élués par un tampon à pH 1 lors d’une chromatographie échangeuse d’anions ?QCM 22 : Chromatographie de partage sur papier :A/ La migration (représentée par le Rf) plus ou moins rapide des substances est fonction de l’affinité deces substances pour les solvantsB/ Nous avons dans cette technique 2 phases non miscibles : une solide (fixée) et une liquide (mobile)C/ La migration peut se faire par capillarité (chromatographie ascendante) ou par gravité(chromatographie descendante)D/ On peut identifier les éléments séparés en effectuant une pulvérisation de colorants adapté ou uneauto-radiographie par exempleE/ Le Rf est caractéristique de certaines substancesQCM 23 : Electrophorèse :On réalise une électrophorèse à pH 10 d’un mélange de tyrosine, d’acide aspartique et d’arginine. Quellesera la migration obtenue ?A/ (pole +) Asp, Arg, Tyr (pole -) B/ (pole +) Asp, Tyr, Arg (pole -)C/ (pole +) Arg, Tyr, Asp (pole -) D/ (pole +) Arg, Asp, Tyr (pole -)E/ (pole +) Tyr, Asp, Arg (pole -)© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 35
  36. 36. QCM 24 : Calcul de rendement :Après une étape de broyage d’un extrait brut de cerveau de bœuf (à l’aide d’un appareil de Potter) lerendement est de 80%, on effectue une ultracentrifugation à l’issue de laquelle le rendement est de 60%,puis une séparation chromatographique difficile (rendement de 50%). Si dans l’extrait brut on avait audépart 200 mg de protéines nous obtiendrons au final :A/ 96 mg de protéines B/ 160 mg de protéines C/ 48 mg de protéinesD/ 25 mg de protéines E/ 0,048 g de protéinesQCM 25 : Calcul de rendement :Après le broyage d’un extrait brut de foie de rat à l’aide d’un appareil de Potter dont le rendement est de90%, on effectue une première centrifugation à l’issue de laquelle la perte est de 10% puis uneultracentrifugation au rendement de 50%, une séparation chromatographique dont le rendement est de80% est effectuée, puis enfin une dernière technique où la perte de rendement est de 20%. En coursd’expérimentation la température a entraîné, à la suite d’une légère modification de la configuration, uneperte de l’activité biologique d’environ 65%. Si dans l’extrait brut il y avait au départ 600 mg deprotéines, nous obtiendrons à l’issue de l’ultracentrifugation :A/ 155,52 mg de protéines B/ 486 mg de protéines C/ 150 mg de protéinesD/ 390 mg de protéines E/ 243 mg de protéinesQCM 26 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. La glycine est le plus petit acide aminé.B. Il n’existe pas d’acide aminé apolaire cyclique.C. Une protéine est un enchaînement d’acides aminés (plus de 100) liés par des liaisons peptidiques.D. Si on a une séquence de 10 acides aminés, il existe 2010 possibilités de protéines, d’où la notiond’immense potentiel informationnel des protéines.E. Les acides aminés polaires comme la Leucine (Leu) sont généralement retrouvés à l’extérieur de laprotéine.QCM 27 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Toutes les protéines n’ont pas une structure quaternaire.B. L’hémoglobine humaine est une structure volumineuse comprenant 4 chaînes associées dont chacuneest liée à un hème qui comprend 1 atome de Mg.C. La structure secondaire résulte de la géométrie dans l’espace des liaisons peptidiques et des radicaux.D. Les ponts disulfures entre deux Lysines (Lys) stabilisent la molécule.E. La myoglobine comme l’hémoglobine sont des protéines héminiques.QCM 28 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Les protéines ont généralement plus de 100 acides aminés dans leur composition donc un poidsmoléculaire supérieur à 100.B. L’Asparagine (Asn) est un acide aminé polaire acide.C. Un acide aminé a une fonction amine (NH2 ) et acide (COOH) sur le carbone β.D. Les acides aminés apolaires interagissent peu avec l’eau au pH physiologique et sont doncgénéralement retrouvés à l’extérieur des protéines.E. La Lysine (Lys) est un acide aminé polaire basique.QCM 29 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Les gènes, dont le nombre est estimé entre 30 000 et 50 000, codent pour autant d’ARNm.B. Le plus petit des acides aminés appartient à la familles des acides aminés apolaires qui ont peutendance à interagir avec l’eau au pH physiologique.C. Depuis 2001, le programme génome humain a permis d’identifier tous les gènes ainsi que leurfonction.D. Le Fer et le Zinc entrent dans la structure respectivement de l’insuline et de l’hémoglobine.E. La molécule d’ADN est constituée d’une continuité de séquences codantes.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 36
  37. 37. QCM 30 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. 7,42 est la valeur de référence du pH physiologique de l’estomac.B. La Proline est un imino-acide qui peut entraîner une coudure des séquences d’acides aminés.C. C’est l’atome de soufre de la Méthionine qui forme des pont disulfures.D. La Sérine, la Glycine et la Thréonine sont des acides aminés polaires neutres.E. La structure quaternaire de la myoglobine correspond à la juxtaposition de plusieurs sous-unitésprotéiques.QCM 31 : Parmi les acides aminés suivants, le(s)quel(s) est (sont) hydrophobe(s) ?A. Ser B. Trp C. Thr D. Ile E. LysQCM 32 : A propos de la chromatographie sur résine échangeuse d’ions :A. Elle sépare les produits en fonction du poids moléculaire.B. Les échangeuses de cations retiennent les molécules chargées négativement.C. Sur les échangeuses d’anions, les molécules éluées sont celles qui sont chargées +.D. Elle permet de séparer les molécules en fonction de leur pHi.E. Le support d’une échangeuse d’anion est faite de carboxyméthyl cellulose.QCM 33 : A propos des techniques en général :A. La chromatographie d’affinité joue sur les interactions spécifiques entre 2 molécules commeantigène/anticorps par exemple.B. Les méthodes de chromatographie peuvent avoir un but analytique ou préparatif.C. Le résultat d’une chromatographie d’adsorption peut être visualisé grâce à des produits radioactifs.D. Quelle que soit la technique utilisée les notions de rendement et de dénaturation sont intimement liées.E. La chromatographie hydrophobe joue sur le caractère polaire ou apolaire des produits.QCM 34 : Concernant la chromatographie par élution ou de partage sur papier :A. Les 2 phases en présence sont liquides et miscibles.B. Elle peut être ascendante ou descendante.C. Le rapport frontal (Rf) est caractéristique du produit analysé.D. Elle se fait par transfert d’une substance d’une phase liquide (mobile) vers une phase liquide (fixe).E. Elle sépare les produits en fonction de leur charge.QCM 35 : Concernant la chromatographie d’exclusion-diffusion :A. Elle sépare les produits en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire.B. Les premières molécules sont récupérées dans le volume mort.C. Le volume d’élution est inversement proportionnel à la taille de la molécule.D. Avec un mélange de protéines et de peptides, les protéines sortent en premier.E. Avec un mélange de protéines et de peptides, les peptides sortent en premier.QCM 36 : On réalise une gel-filtration d’un mélange de protéines et de peptides :P1(PM=5 000), P2 (PM=390 000), P3 (PM=24 000), P4 (PM=100 000), P5 (PM=86 000).Quel sera l’ordre d’élution (en commençant par le premier sorti de la colonne) ?A. 1,3,5,4,2B. 2,4,3,5,1C. 1,5,3,4,2D. 2,4,5,3,1E. 1,2,3,4,5© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 37
  38. 38. QCM 37 : On réalise une électrophorèse à pH 3 d’un mélange d’arginine, d’acide aspartique etd’asparagine. Quelle sera la migration obtenue en partant de l’anode vers la cathode ?A. Arg, Asn, AspB. Asp, Arg, AsnC. Asp, Asn, ArgD. Asn, Asp, ArgE. Arg, Asp, AsnQCM 38 : Au sujet de la densité optique:A. Les protéines absorbent à une DO de 270 nm.B. Les bases puriques absorbent à 260 nm.C. Les bases pyrimidiques absorbent à 280 nm.D. Une unité de DO à 260 nm d’ARN correspond à 40 μg/mL.E. La recherche de contamination des acides nucléiques par des protéines peut s’effectuer en mesurant lerapport DO à 260 nm sur DO à 280 nm.QCM 39 : Au sujet des techniques d’extraction :A. Le phénol permet l’extraction des acides nucléiques en précipitant les protéines.B. Suite à l’extraction au phénol, les acides nucléiques se retrouvent dans la phase aqueuse c’est-à-dire laphase inférieure.C. Le chloroforme permet l’extraction du bromure d’éthidium.D. L’isopropanol permet la précipitation des acides nucléiques.E. Le phénol est extrait par un mélange de chloroforme-éther à volume équivalent.QCM 40 : Après une étape de broyage de foie de souris à l’aide d’un appareil de Potter dont lerendement est de 80%, on effectue une centrifugation dont la moitié de la préparation est éliminée.Ensuite, on effectue une ultracentrifugation pour laquelle le rendement est de 70%. Enfin, onréalise une électrophorèse dont le rendement est de 50%. Si dans l’extrait final, on obtient 70 mg deprotéines, combien avions-nous de protéines en mg dans l’extrait initial ?A. 350 mg de protéinesB. 980 mg de protéinesC. Environ 10 mg de protéinesD. 500 mg de protéinesE. 380 mg de protéinesQCM 41 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Les protéines ont des propriétés variées : physiques, chimiques, antigéniques…B. Des anticorps peuvent être dirigés contre certains motifs antigéniques de la protéine que l’on appelleparatopes.C. Deux protéines différentes ne peuvent pas posséder un même motif antigénique.D. Les holoprotéines sont composées de 96% à 100% d’acides amines.E. Les hétéroprotéines sont composées d’une partie protéique appelée apoprotéine qui ne contient que desacides aminés, et d’une partie non protéique appelée groupement prosthétique qui n’est composée que detraces de métaux.QCM 42 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Les albumines et les globulines sont solubles dans les solutions salines.B. Les protéines globulaires, telles les immunoglobulines, ont leur rapport D/d supérieur à 10.C. La fraction sub-cellulaire contenant les protéines à étudier peut être isolée par des produits comme leTriton X100 ou le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate).D. La dialyse/filtration utilise des membranes semi-perméables.E. La lyophilisation, aussi appelée « déshydratation à froid », permet de concentrer et de conserver lesprotéines.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 38
  39. 39. QCM 43 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Le phénol entraîne la précipitation des protéines tandis que les acides nucléiques se retrouvent dans lapartie supérieure non-soluble.B. Le phénol est ensuite extrait par du chloroforme ou par un mélange chloroforme/éther.C. Le bromure d’éthidium est extrait par l’isopropanol.D. Les acides nucléiques précipitent en présence d’alcool éthylique (à force ionique élevée) oud’isobutanol.E. Le sel pouvant être néfaste à la suite de l’expérimentation, on utilise plutôt l’isobutanol pour précipiterles acides nucléiques.QCM 44 : Parmi les propositions suivantes, lesquelles sont exactes ?A. Le collagène est un exemple de protéine fibrillaire.B. Les lipoprotéines peuvent être séparées par ultracentrifugation ou par séparation électrique.C. La purification des protéines ne nécessite pas l’observance de conduites opératoires strictes.D. L’utilisation de solutions salines à différentes concentrations n’ayant aucune utilité pour séparer ouisoler des protéines ou des acides nucléiques, on utilise préférentiellement des solvants sans sel.E. Une unité de densité optique à 260 nm peut correspondre à du DNA double brin ayant uneconcentration de 50 μg/ml.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 39
  40. 40. CorrectionQCM 1 : DA/ ADN nucléaire + ADN mitochondrialB/ Au moins un rôle dans la régulationC/ Beaucoup plus de protéines que de gènes. En effet un même gène peut donner des ARNm différents etdes protéines différentes selon le type cellulaire et le temps [modifications post-transcriptionnelles (ex :épissage alternatif ou phénomène d’édition) et post-traductionnelles].E/ Le génome est le même dans toutes les cellules nucléées de l’organisme ! Par contre ces gènes ne sontpas exprimés de la même façon selon le type cellulaire ou le temps donc c’est le protéome des cellules quidiffère selon le type cellulaire et le temps.QCM 2 : CDEQCM 3 : DQCM 4 : BCDEA pH 2 Asp est neutre, Val, Leu et Met sont chargés positivement et Arg est chargé très positivement.Val, Leu, Met et Arg sont ici des cations donc seront retenus dans ce type de colonne.Attention parfois le pHi (pH auquel la charge électrique globale est nulle) de chaque acide-aminé estprécisé ! Dans ce cas là il faudra être précis : tous les acides aminés dont le pHi sera supérieur au pH de lasolution seront chargés positivement et tous les acides aminés dont le pHi sera inférieur seront chargésnégativement, pour être neutre l’acide aminé devra avoir son pHi égal au pH de la solution, tout celapourrait changer certaines réponses…QCM 5 : BDA/ L’acide iminé ou imino-acide est la prolineC/ Ce sont les acides aminés polaires qui sont acides, neutres ou basiques. Les apolaires sont tous neutresau pH physiologique.E/ Non car ils peuvent avoir d’autres fonctions amines ou acides dans leur radical. Toutefois ils ont tousau moins une fonction amine et une fonction acide sauf la proline qui est un imino-acide [une fonctionimine (NH) et une fonction acide].QCM 6 : ABGlu est acide, Arg est basique, les autres sont neutres.QCM 7 : ABCQCM 8 : CDQCM 9 : BCDEA pH 10 His est neutre, les autres (Gly, Ser, Cys, Asp) sont chargés négativement. Ces derniers sont doncdes anions et ne seront pas retenus dans une chromatographie échangeuse de cations, ils seront élués.Notez que si on nous avait demandé lesquels étaient élués en premiers il aurait fallu répondre Aspseulement car en tant qu’acide aminé normalement acide Asp est ici chargé très négativement comparé àGly, Ser et Cys.QCM 10 : ABCDED/ Vrai : 9 apolaires et 6 polaires neutres© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 40
  41. 41. QCM 11 : ABCEA/ Oui, il n’y a jamais de ramifications d’acides aminés !D/ Non, les protéines qui ont une structure quaternaire sont celles composées de plusieurs sous-unités(plusieurs enchaînements polypeptidiques).QCM 12 : BCDEA/ 20 puissance 10 soit 10 240 000 000 000 possibilités différents !!!!! Imaginez alors pour des protéinesde plusieurs milliers d’acides aminés…⇒ potentiel informationnel énoooorme !QCM 13 : CAucune difficulté dans ce genre d’exercice, les professeurs proposant normalement toujours 1 acideaminé acide, 1 basique et 1 neutre. Du coup la mention du pH dans l’énoncé n’a aucune importance.L’acide aminé acide (anion) va toujours vers le pôle + (anode), l’acide aminé basique (cation) va toujoursvers le pôle – (cathode) et l’acide aminé neutre se trouve entre les deux autres.QCM 14 : CEA/ Ce sont les hétéroprotéinesB/ « Albumines » et « globulines » sont des termes qui correspondraient à une classification selon lasolubilité des protéines ! Selon la forme ⇒ « globulaires » ou « fibrillaires ». Attention à ne pasconfondre globulines et globulaires !!D/ Non les protéines globulaires ont plutôt un rôle biologique. Ce sont les protéines fibrillaires (ex : lecollagène) qui ont un rôle de protection, de soutien.QCM 15 : BEPour répondre à ce genre de questions sans problème il serait bienvenue de retenir parfaitementl’expérience de « l’extraction phénolique des acides nucléiques » !A/ Les acides nucléiques sont solubles dans l’eau pure ou dans les solutions aqueuses salées à faibleconcentrationB/ Le phénol peut aussi être extrait par le chloroforme seulC/ L’isoPRopanol permet la PRécipitation des acides nucléiques (pas besoin de sels contrairement àl’éthanol). C’est l’isoButanol qui permet d’extraire le Bromure d’éthidium.D/ Les acides nucléiques sont précipités par l’isopropanol ou par le mélange éthanol + selsE/ Les protéines sont solubles dans les solvants organiques comme le phénol (+++), le chloroforme oul’éther et plus ou moins solubles dans l’eau (cf. albumines et globulines). Notez que des protéines sontprécipitées par les solutions aqueuses salées à forte concentration (cf. item 8-E du concours blanc denovembre 2005).QCM 16 : ACDEB/ La taille supérieure des protéines fait au contraire migrer celles-ci plus vite car elles sont trop grossespour être accrochées par les mailles du gelE/ Vrai car la vitesse de descente des protéines dans la colonne est directement liée à leur taille ou poidsmoléculaire (PM)QCM 17 : ABDC/ Gène ---transcription---> ARNm ---traduction---> protéineE/ Cette définition correspond aux globulines. Les albumines sont solubles dans l’eau et dans lessolutions salines.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 41
  42. 42. QCM 18 : CA pH 5 seul Glu est chargé négativement (anion), les autres (Asn, Lys, Pro, Phe) sont tous chargéspositivement. S’agissant d’une chromatographie échangeuse d’anions, ce sont les anions qui serontretenus par le gel c’est-à-dire Glu. Tous les autres seront élués ! Mais ici on demande le(s) premier(s) àêtre élué et ce sera l’acide aminé chargé très positivement c’est-à-dire la Lysine qui est un acide aminébasique alors que les autres (Asn, Pro, Phe) sont seulement neutres au pH physiologique.QCM 19 : EQCM 20 : AEB/ Les acides nucléiques absorbent à 260 nmC/ Le rapport DO à 280 nm sur DO à 260 nm correspond au rapport protéines sur acides nucléiques (AN).S’il était de 1,8 - 2 cela signifierait qu’il y a 2 fois plus de protéines que d’AN et donc qu’il y acontamination. Pour être optimal le rapport doit être d’environ 0,5 soit 2 fois plus d’AN que de protéines.S’il est supérieur à 0,5 cela signifie qu’il y a contamination (trop de protéines).Par contre si le rapport est DO à 260 nm sur DO à 280 nm, le résultat optimal est effectivement de 1,8 –2. Si le rapport est inférieur à 1,8 cela montrerai une contamination de la solution d’AN par les protéines.D/ 270 nmQCM 21 : ABCDEIci la solution est tellement acide (pH 1) que tous les acides aminés seront chargés positivement. Ce sontdes cations et ils seront donc élués dans une chromatographie échangeuse d’anions. Notez que si on nousavait demandé lesquels étaient élués en premiers il aurait fallu répondre His et Arg car ils sont déjàbasiques à l’origine donc encore plus chargés positivement (viennent ensuite Ala et Tyr, le dernier à êtreélué serait Asp car c’est le plus faiblement chargé positivement).QCM 22 : ACDEB/ Les deux phases sont liquides ! Effectivement l’une est fixée et l’autre mobile et elles sont nonmiscibles.QCM 23 : BQCM 24 : CEJe ne vais pas vous faire l’offense de vous réapprendre les calculs de pourcentages… Sachez seulementque pour vos calculs vous pouvez utilisez les différents pourcentages dans l’ordre que vous voulez, lerésultat final restera identique.Toutefois il existe de nombreux pièges : calculer l’extrait final ou l’extrait de départ ? calculer l’extraitfinal ou l’extrait après la 2ème ou la 3ème étape seulement ? Calculer le poids de protéines ou l’activitébiologique ? Faîtes donc bien attention à la dernière phrase notamment ! Attention aussi à l’énoncé : « àl’issue de laquelle le rendement est de 60% » est différent de « à l’issue de laquelle la perte est de60% » car dans le dernier cas le rendement n’est alors que de 40% !! Pour finir soyez bien vigilants surles unités des différentes réponses !QCM 25 : E600*90% = 540540-10% = 540-54 = 486486*50% = 243QCM 26 : ACDB. La ProlineE. La Leucine est apolaire© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 42
  43. 43. QCM 27 : AEB. 1 atome de FerC. Structure tertiaireD. Entre 2 CystéinesQCM 28 : EA. PM supérieur à 10 000B. Polaire neutreC. Carbone αD. A l’intérieurQCM 29 : BA. Plus d’ARNmC. On ne connaît pas tous les gènes et encore moins la fonction de tousD. L’inverseE. Il y a des séquences poubelles non codantesQCM 30 : BA. pH très acide dans l’estomacB. Vrai car structure cycliqueC. Entre 2 CystéinesD. Pas la Glycine (apolaire)E. Pas de structure quaternaire pour la myoglobineQCM 31 : BDQCM 32 : CDA. Sépare les produits en fonction de leur chargeB. Echangeuses de cations => résine chargée – donc retient les molécules chargées +E. Support d’une échangeuse d’anions est du DEAE celluloseQCM 33 : ABCDEQCM 34 : BCDA. Les 2 phases sont liquides et non miscibles.E. Sépare les produits en fonction de leur solubilité.QCM 35 : ACDB. On ne récupère rien dans le volume mort.E. Les peptides sortent en dernier.QCM 36 : DLes protéines de plus gros PM sortent en premier et les plus petits peptides sortent en dernier donc :l’ordre d’élution sera P2,P4,P5,P3,P1.QCM 37 : C(pôle +) Asp Asn Arg (pôle -)pHi(Arg) >> pH donc il est le plus positif des 3 donc migrera le plus vers le pôle - c’est-à-dire la cathode.QCM 38 : BDEA. Les protéines absorbent à 280 nm, le phénol absorbe à 270 nm.C. Les acides nucléiques absorbent à 260 nm que ce soient des bases puriques ou pyrimidiques.D. L’ARN est simple brin donc 1 DO à 260 nm correspond à 40 μg/mL.E. Contamination des Acides nucléiques / Protéines  DO [Acides nucléiques] / DO [Protéines]© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 43
  44. 44. QCM 39 : ADEB. La phase aqueuse correspond à la phase supérieure. La phase inférieure comprendra le phénol avec lesprotéines.C. Le bromure d’éthidium est extrait par l’isobutanol. Le chloroforme sert à extraire le phénol.QCM 40 : DAttention à ne pas lire trop vite l’énoncé. Faire attention si la quantité donnée est celle du départ, del’arrivée ou après une étape. Etre attentif au résultat demandé : quantité de départ, quantité d’arrivée ouquantité après un certain nombre d’étapes. De plus, ne pas confondre 70% de rendement et le fait que70% de la préparation est éliminé, par exemple.Soit x, la quantité de protéines au départ.Calcul : x = 500 mg de protéinesQCM 41 : ADB. Ces motifs antigéniques sont appelés « épitopes ». Les « paratopes » sont les sites des anticorps quireconnaissent un épitope.C. Deux protéines différentes peuvent avoir le même motif antigénique (épitope), ce qui aboutit à desréactions croisées ; l’anticorps dirigé contre cet épitope reconnaîtra les deux protéines.E. Le groupement prosthétique ne contient pas que des traces de métaux, il peut contenir d’autresmolécules comme des lipides ou des glucides par exemple. De plus, on peut trouver des traces de métauxdans les holoprotéines (de l’ordre de 0 à 4%).QCM 42 : ADEB. Leur rapport D/d est inférieur à 10, ce qui explique qu’elles aient une forme plutôt globulaire.C. Le Triton X100 et le SDS sont des détergents que l’on utilise pour solubiliser l’extrait tissulaire quicontient les protéines que l’on désire étudier. La fraction sub-cellulaire est, elle, isolée grâce à descentrifugations différentielles.QCM 43 : BA. Les acides nucléiques se retrouvent dans la phase supérieure soluble tandis que les protéinesprécipitent dans la phase inférieure contenant du phénol.C. Il est extrait par l’isobutanol.D. En présence d’alcool éthylique (+ sels) ou d’isopropanol.E. On utilise l’isopropanol qui précipite les acides nucléiques sans avoir besoin de sel.QCM 44 : ABEC. Au contraire, c’est indispensable pour une bonne purification.D. L’utilisation de solutions salines à différentes concentrations permet une précipitation/solubilisationdifférentielle des acides nucléiques par exemple. Elle peut donc être utile.© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 44
  45. 45. NUCLEOSIDES / NUCLEOTIDES 43 QCMParmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants :A/ thymidine B/ adénosine tri-phosphate (ATP) C/ cytosineD/ uridine E/ désoxyguanosineQCM 1 : Le(s)quel(s) est (sont) un (des) nucléoside(s) ?QCM 2 : Le(s)quel(s) contien(nen)t une liaison N-osidique entre le désoxyribose et la basepyrimidique ?QCM 3 : Le(s)quel(s) constitu(en)t une forme chimique de réserve d’énergie ?Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants :A/ désoxyadénosine B/ cytidine C/ uracileD/ hypoxanthine E/ guanosineQCM 4 : Le(s)quel(s) a (ont) un noyau purine ?QCM 5 : Le(s)quel(s) peu(ven)t être métabolisé(s) en acide urique ?QCM 6 : Le(s)quel(s) est (sont) présent(s) dans les tRNA ?Parmi les composés (naturels ou synthétiques) suivants :A/ inosine B/ uridine C/ théophyllineD/ hypoxanthine E/ méthylcytosineQCM 7 : Le(s)quel(s) est (sont) un (des) nucléoside(s) présent(s) dans les tRNA ?QCM 8 : Le(s)quel(s) inhibe(nt) la cAMP-phosphodiestérase ?QCM 9 : Le(s)quel(s) provien(nen)t de la désamination oxydative d’une adénosine ?QCM 10 : Les antimétabolites :A/ L’allopurinol est un analogue de l’hypoxanthineB/ Le 5-fluoro-uracile est en compétition avec la thymine lors des biosynthèses d’ARNC/ La 6-thiopurine (= 6-mercaptopurine) est un noyau pyrimidique qui a la particularité d’avoir un atomede soufreD/ Les antimétabolites sont tous utilisés pour soigner l’homme car ils dérèglent le fonctionnement descellules bactériennes (procaryotes)E/ La puromycine mime la structure terminale des tRNA chargés de leur acide-aminé© Tous droits réservés au Tutorat Associatif ToulousainSauf autorisation, la vente, la diffusion totale ou partielle de ce polycopié sont interdites 45

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