2. INTRODUCTION
• Previous studies suggested that stimulation of α1-
adrenoceptors enhances proliferation not only in somatic
cells such as vascular muscle cells or adventitial but
also in undifferentiated stem cells such as mouse
induced pluripotent stem cells. α1-Adrenoceptors are Gq
coupled receptors. Other Gq-coupled receptors such as
angiotensin type 1 receptor are known to enhance cell
growth in undifferentiated stem cells

3. INTRODUCTION
• Theres a lot of studies that have shown the mechanism
proliferation of iPS, However, it remains unclear whether
a signaling pathway downstream of Gq-coupled receptors
is involved in proliferation of human iPS cells. In addition,
no studies have shown whether human iPS cells express
α1-adrenoceptors or AT1 receptor.

4. ANGIOTENSINE T1 RECEPTOR
AT
1

5. ANGIOTENSINE T1 RECEPTOR
AT
1
• Vasoconstriction
• Aldosterone and
vasopressin secretion
• Vascular smooth
muscle cells
proliferation
• Cardiac contractility
• Human cultured
breast epithelial
cells

7. ALPHA 1- ADRENOCEPTOR

8. ALPHA 1- ADRENOCEPTOR

9. STEM CELL
• Stem cells are a class of undifferentiated cells that
are able to differentiate into specialized cell types.
Commonly, stem cells come from two main sources:
Embryos formed during
the blastocyst phase of
embryological
development (embryonic
stem cells)
Adult tissue (adult stem
cells).

10. OBJECTIVE
• To reveal the expression of alpha 1- adrenoceptor
and AT1 receptor in human IPS cells and their
involvement in DNA synthesis. To future
regenerative therapy.

11. MATERIALES Y METODOS
L-fenilefrina
agonista selectivo de los alfa 1
adrenoceptor
5methylurapidil antagonista selectivo de los receptores
adrenérgicos α1a
cloroetilclonidina antagonista selectivo de los receptores
adrenérgicos α1b
pyridine-6α-
carboxylic acid
antagonista selectivo del receptor
angiotensina 2
inhibidor de la
PKC
factor de crecimiento epidérmico
recombinante humano (EGF)

12. MATERIALES Y METODOS
La prazosina
antagonista de los receptores adrenérgicos
α1
El candesartán un antagonista selectivo del receptor AT1
Telmi-sartan antagonista selectivo del receptor AT1
Bisin-
dolylmaleimide I
un inhibidor de la PKC
LY294002 (2 - (4-
morpholi-nilo)-8-fenil-1
(4H) - benzopiran-4-
ona)
inhibidor PI3K

13. CULTIVOS DE CÉLULAS IPS HUMANAS
Las Células iPS humanas se expandieron en MEFs tratadas
en placas de cultivo recubiertas con gelatina al 0,1% a 37 C
en un entorno de 5% de CO2.
El medio de cultivo contiene 20% de suero “knock out” , 0,1
mM de aminoácidos no esenciales (Invitrogen) penicilina y
estreptomicina (Invitrogen), 500ng/ml de factor de
crecimiento de fibroblastos recombinante humano BFGF.

14. • Para eliminar MEFs contaminadas, las colonias de
células iPS se pasaron hasta 4 veces sin células
alimentadoras en placas de cultivo de 60 mm recubiertas
con Matrigel.
• las colonias de células se despegaron utilizando tripsina
0,25% de EDTA y luego se re-sembraron en placas a una
densidad de 1,5 x 10(5) células/cm2. Después de la
incubación durante 24 h, el medio de cultivo fue
reemplazado por un medio de cultivo sin bFGF.

15. INMUNOFLUORESCENCIA
luego de 24 h, las células fueron re-sembradas en
portaobjetos revestidos con Matrigel y se fijaron con 4% de
paraformaldehído a 41C durante 30 min. Luego se les añadio
10% de suero bovino fetal en PBS, los portaobjetos se
incubaron con anticuerpo monoclonal anti-α1-
adrenoceptores en PBS a 4C durante la noche. Los
portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-IgG
conjugado con Alexa Fluor 594 (1:200; Invitrogen) en PBS
durante 1 h a temperatura ambiente. (5 PBS)

16. • BrdU fue el enfoque utilizado para controlar la síntesis de
ADNc. el ensayo inmunoenzimático ELISA se realizó
usando marcaje BrdU y kit de detección III para detectar la
incorporación de BrdU en el ADN celular. luego de 24 h de
re-recubrir en Matrigel , las células se cultivaron en el
medio de cultivo sin bFGF por 24 h y se trataron con o sin
L-fenilefrina o Ang II. luego de 24 h de realizado el
tratamiento, se añadió BrdU al medio de cultivo y se
incorpora en el ADN recién sintetizado durante 2 h
INCORPORACIÓN DE BrdU

17. • Después de la fijación de células, se añadió un ac
marcado con peroxidasa para BrdU. En el paso final, se
añadió el sustrato de peroxidasa y la enzima catalizo la
escisión de este, produciendo un producto coloreado.

18. WESTERN BLOT
• luego del tratamiento, las células fueron lisadas y luego
centrifugadas, Los extractos de proteínas se sometieron
a electroforesis en un gel de poliacrilamida y se
transfirieron a una membrana de difluoruro de
polivinilideno con un equipo de transferencia semiseca.
se aplicaron anticuerpos en diluciones en PBS que
contenía suero de albúmina bovina: a1a, b, d -
adrenoceptor anti-humano,tecnologia de
señalizacioncelular, Gq de conejo anti-humano.

19. • Se añadió el respectivo anticuerpo secundario conjugado
con peroxidasa, y las proteínas inmunorreactivas se
visualizaron utilizando ECL Western Blotting Detection
Kit. La densidad de las bandas se normalizó utilizando β-
actina como estándar interno.

20. ARN CORTO DE INTERFERENCIA
Células iPS fueron transfectadas con los ARN interferentes
cortos (siRNAs) mediante el uso de un agente de
transfección. Un controlador siRNA, fue desarrollado para
minimizar los efectos de off- target.
Luego de la transfeccion las células crecieron por 24 hr y
luego estimuladas con o sin l-phenylephrina, Ang 2.

21. RESULTADOS: FIG.1

22. RESULTADOS: FIG.1

23. RESULTADOS
Efectos de los agonistas y antagonistas
de los receptores α1-adrenergicos en
la síntesis de DNA en células humanas
iPS

24. RESULTADOS
Efectos de los antagonistas de los
receptores de angiotensina (AngII) en
la síntesis de DNA en células humanas
iPS

25. RESULTADOS

26. RESULTADOS

27. RESULTADOS: FIG.4
Relacion de la PKC, PI3K/Akt, y
MEK/ERK en la sintesis de DNA de
celulas humanas iPS inducidas por I-
fenilefrina o AngII

28. RESULTADOS: FIG.5
Efectos de la Gq siRNA en la
síntesis de DNA y la fosforilacion de
Akt o p44/42 MAPK en células
humanas iPS tratadas con I-
fenilefrina o AngII

29. RESULTADOS: FIG.5
Efectos de la Gq siRNA en la
síntesis de DNA y la fosforilacion de
Akt o p44/42 MAPK en células
humanas iPS tratadas con I-
fenilefrina o AngII

30. RESULTADOS: FIG.5
Efectos de la Gq siRNA en la
síntesis de DNA y la fosforilacion de
Akt o p44/42 MAPK en células
humanas iPS tratadas con I-
fenilefrina o AngII

31. DISCUSSION: RESULTS 1
Han et al., 2007 Showed that AngII-stimulated
DNA synthesis may be
mediated by AT1 receptor
dependent ERK and PI3K/Akt
pathways in mouse ES cells
Landgraf et al., 2010 Reported that mouse and
human ES cell express
muscarinic acetylcholine
receptors (mAchRs)
Wessler et al., 2012 Showed that acetylcholine was
released from mouse ES cells

32. DISCUSSION: RESULTS 2
Han et al., 2006 Reported that PKC
activation may be
involved in mouse
ES cell proliferation

33. DISCUSSION: RESULTS 3
Kim et al.,2009;
Jirmanova et al.,
2002; Lee et al., 2009;
Paling et al.,2004.
It is suggested that
the MEK/ERK and
the PI3K/Akt
pathways are
involved in the
proliferation of
mouse ES cells and
iPS cells.

34. DISCUSSION: RESULTS 4
Heo and Han, 2006 The activation of
Gq-couple
receptors
promotes PKC
activation
Zhao et al., 2005;
Leon et al., 2011;
Tang et al., 2012
Reported that
PKC may be a
key regulator of
ERK activation
induced by
various stimuli

35. CONCLUSION
1. The results of this study validate that stimulation of α1-adrenoceptors
or AT1 receptor may lead to a significant increase in human iPS cell
proliferation via Gq-coupled receptor signaling pathways.
2. It is important to establish the methodology by which iPS cells can be
produced in large quantities, because iPS cells may be used as a future
source for regenerative therapy.
3. Understanding the physiological role of Gq-coupled receptors, such as
α1-adrenoceptor or AT1 receptor in human iPS cells may be useful in
the development of better culture conditions.
4. This improvment can be a step forward the new technics of treatment
with regenerative therapy

36. MAPA CONCEPTUAL: ANGELICA MARIA SERNA

37. MAPA CONCEPTUAL: ANA ISABEL VALLEJO

38. GRACIAS