1. LAPORAN PRAKTIKUM
BIOLOGI SEL MOLEKULER
KODE MATA KULIAH BIU 1102
Disusun oleh:
MA’RUF
P2BA09006
PROGRAM STUDI S2 BIOLOGI
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2010
1

2. KATA PENGANTAR
Praktikum mata kuliah Biologi Sel molekuler dilaksanakan guna memenuhi
satuan kredit semester (SKS) yang dilaporkan berdasarkan hasil kegiatan sesuai dengan
petunjuk praktikum. Pelaksanaan praktikum ini dilakukan dengan menyesuaikan pencapaian
kompetensi mata kuliah dan ketersediaan fasilitas peralatan yang ada di laboratorium, oleh
karena itu tentu hasil yang kami peroleh belum dapat memenuhi harapan yang ideal.
Adapun tujuan dilaksanakan kegiatan praktikum adalah memperjelas materi
perkuliahan, memberi sedikit bekal kepada kami tentang metode untuk mempelajari biologi
sel molekuler, menumbuhkan semangat bekerja dalam tim serta melatih kami dalam hal
penulisan laporan ilmiah.
Atas dasar petunjuk praktikum mata kuliah Biologi Sel Molekuler, kegiatan praktikum
ini terdiri lima acara yaitu :
I. Isolasi DNA Plasmid
II. Restriksi DNA Plasmid
III. Elektroforesis Gel Agarosa
IV. Ligasi DNA
IV. Transformasi.
Saran dan kritik dari semua pihak sangat kami hargai demi peningkatan kualitas
kegiatan maupun laporan praktikum yang tentunya akan dapat menjadi bekal bagi kami dalam
mencapai kompetensi mata kuliah Biologi Sel Molekuler.
Purwokerto, Pebruari 2010
Praktikan
2

3. DAFTAR ISI
Halaman
Halaman sampul ........................................................................................................... 1
Kata Pengantar ............................................................................................................. 2
Daftar Isi ........................................................................................................................ 3
ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID ..................................................................... 4
ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID ................................................................ 20
ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ............................................... 23
ACARA IV. TRANSFORMASI ................................................................................ 31
3

4. ACARA I.
ISOLASI DNA PLASMID
LANDASAN TEORI
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid
pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri,
tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam
rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu
yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan
mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.
Berikut prosedur isolasi plasmid yang biasa dilakukan dalam praktikum:
1. PEMANENAN SEL
Tahap satu ini ditujukan untuk mendapatkan pelet sel yang terpisah dari media
pertumbuhannya.
2. PELEPASAN PLASMID DARI SEL
Setelah diberi Lar II, maka seharusnya terdapat lendir pada tutup tube (jika dibuka); Lar
I, II, III diusahakan dingin.; setelah diberi Lar III, biasanya akan ada gumpalan putih.STE
(Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel
dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ -->
mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan
menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel
dan membuat lingkungan hiperosmotik.
4

5. STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel
dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ -->
mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan
menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel
dan membuat lingkungan hiperosmotik
Sodium Dodecyl Sulphate ( SDS ) dari Lar II dapat melubangi membran sel karena
SDS adalah salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti)protein membran
sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga
mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga terdenaturasi,
namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. plasmid dan
RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel
karena terlalu besar untuk keluar.
KAc (Kalium Acetic) (asam) akan menetralkan NaOH sehingga plasmid dapat terenaturasi
jika etanol tidak kering, maka dapat mengganggu kerja enzim dan tidak mengendapkan DNA
saat dielektroforesis.
Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA
tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA
plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol
mempresipitasi DNA? : penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula
fosfat DNA. ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang
bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih
lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan
+pada H dan - pada O). atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.
fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb.
atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah
terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat membantu membayangkan.
5

6. 6

7. 7

8. PEMISAHAN DAN PEMEKATAN PLASMID
penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa
larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA plasmid dan juga
untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol mempresipitasi DNA? :
penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti
kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air,
gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA
masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan +pada H dan - pada O). atau dapat
dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti
etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb. atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+
sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat
membantu membayangkan................

9. kira2 yang terjadi di dalam tube ......
etanol 70% --> membersihkan lagi dan lebih memekatkan plasmid hasil setelah dielektroforesis.
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/isolasi-plasmid-metode-lisis-alkali.html

10. RESTRIKSI DNA PLASMID
Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai
pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu
organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat
diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah
pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan
DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.
Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand
DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi
dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong
dengan enzim restriksi.
Plasmid
Plasmid merupakan DNA sirkuler untai ganda ekstra kromosomal dengan ukuran
bervariasi antara 1 kb sampai lebih dari 200 kb ditemukan pada berbagai spesies bakteri yang
dipakai sebagai unit gen untuk melakukan replikasi (Sambrook et al., 1989).
Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih dan sering kali gena tersebut
menyebabkan adanya ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri tuan rumah (Brown, 2003).
Plasmid membawa tipe gen yang sangat bervariasi fungsinya seperti resisten terhadap antibiotik,
resisten terhadap logam berat, sensitif terhadap mutagen, sensitif atau resisten terhadap
bakteriophage, produksi enzim retriksi, produksi asam amino, produksi toksin, penentu virulensi,
katabolisme molekul organik yang komplek, kemampuan untuk membentuk hubungan simbiosis
dan transfer DNA antar kingdom (Feinbaum, 1998).
Berdasarkan sifat-sifat utama yang dikode oleh plasmid, plasmid dapat diklasifikasikan
menjadi 5 jenis utama:
a. Plasmid fertilitas atau plasmid “F” yang hanya membawa gena tra dan tidak mempunyai sifat
lain kecuali kemampuan untuk melakukan transfer plasmid dengan cara konjugasi.
b. Plasmid resistensi atau plasmid “R” membawa gena yang menyebabkan resistensi bakteri tuan
rumah terhadap satu atau lebih agen antibakteri, seperti kloramfenikol, ampisilin dan merkuri.

11. c. Plasmid col mengkode kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri lain.
d. Plasmid degradatif memungkinkan bakteri untuk mengadakan metabolism molekul yang tidak
biasa, seperti toluen dan asam asetat.
e. Plasmid virulensi menyebabkan patogenitas pada bakteri tuan rumah (Brown, 2003).
Jumlah kopi menunjukkan jumlah molekul plasmid yang biasanya ditemukan dalam satu sel
bakteri. Tiap-tiap plasmid mempunyai jumlah kopi antara 1-50 atau lebih (Brown, 2003).
Berdasarkan jumlah kopi plasmid dapat diklasifikasikan menjadi dua yaitu: High Copy Number
Plasmid dengan jumlah kopi lebih besar dari 20 kopi per sel bakteri dan Low Copy Number
Plasmid dengan jumlah kopi lebih kecil dari 20 kopi per sel bakteri (Feinbaum, 1998).
Kebanyakan plasmid yang berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilit (supercoiled).
Pelilitan (supercoiling) terjadi karena heliks ganda DNA plasmid sebagian terbuka oleh enzim
yang disebut topoisomerase selama replikasi plasmid. Bentuk berlilit hanya dapat dipertahankan
bila kedua untai polinukleotid dalam keadaan utuh sehinggga disebut DNA sirkuler yang tertutup
secara kovalen (covalently-closed-circular (ccc) DNA). Jika salah satu untai polinukleotid
terputus maka heliks ganda akan kembali ke keadaan normalnya, yaitu berelaksasi, dan plasmid
akan mengambil bentuk alternatif yang disebut sirkuler terbuka (open circular (oc)) (Brown,
2003).
Lebih jelasnya model konformasi DNA tersebut seperti tersaji pada Gambar 2.
Gambar 2. Model Konformasi DNA
Keterangan: Bentuk lingkaran kovalen tertutup dan dua tipe lingkaran nick, tanda
panah menunjukkan adanya torehan/nick. (Adaptasi dari Freifelder,
1983).
Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan dalam biologi
molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai
peta retriksi seperti tersaji pada Gambar 3. Plasmid pUC19 mempunyai berbagai sisi

12. pemotongan untuk enzim BamHI. Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi
resisten terhadapampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke
plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin
betalaktam,sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19menjadi resisten
terhadap ampisilin (Sambrook et al., 1989).
Gambar 3. Peta Restriksi Plasmid pUC19 (Sambrook et al., 1989).
Fuji Lestari, (2008), Uji Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil Fraksi Protein Daun Kucing-Kucingan (Acalipha indica L)
Terhadap pUC 19, Skipsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhamadiyah Surakarta, Surakarta.
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip
dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya
gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam

13. metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-
blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat
yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida
dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih
besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut)
yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada
gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-
molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik
sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda
positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk
menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam
nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium
dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul
sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie"
(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam
sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar
ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses
pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang
berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang
bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti
bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang
merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan
ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel

14. yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita
sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap
logaritma ukuran molekul.
Gel poliakrilamid vs gel agarose
1. Gel Poliakrilamid
• Lebih effektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5-500bp
• Power: ekstrim tinggi
• Ukuran perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp
• Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarose, karena biasanya digunakan
poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.
• Medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan.
2. Gel Agarose
• Power lebih rendah
• Mempunyai laju pemisahan lebih cepat
• Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb tergantung dari konsentrasi gel
agarose yang digunakan
• Medan gerak biasanya horizontal
Electroforesis migration rate
Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarose dipengaruhi
oleh beberapa factor utama, sebagai berikut:
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih
cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju
terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.
2. Konsentrasi gel agarose
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan
konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: logµ=logµο-KrT

15. dimana µο adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient,
dan T adalah gel konsentrasi serta µ adalah electrophoretic mobility DNA.
Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA
No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi range Pemisahan pada DNA linier (kb)
1 0.3 60-5
2 0.6 20-1
3 0.7 10-0.8
4 0.9 7-0.5
5 1.2 6-0.4
6 1.5 4-0.2
7 2.0 3-0.1
3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada
3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III).
Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel
elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:
• terutama konsentrasi gel agarose
• kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
• densitas kembaran superheliks pada bentuk I
• pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III
• tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA
meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I
• konsentrasi EtBr kritis antara 0.1µg/ml-0.5µl/mg
4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA ±
2kb pada gel agarose bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA
50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan
pergerakan DNA akan berubah juga.
5. Komposisi basa DNA atau temperature
Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil
pada temp. 4-30°C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar

16. 6. Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam
nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi
mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara
langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan
untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun,
affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran
fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu
memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung
pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.
7. Konposisi buffer elektroforesis
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk
pembuatan gel agarose. Missal:
• Tris-acetate; umu dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif
untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.
• Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose
kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose.
A C
B
Gambar 1. Peralatan elektroforesis dari iMupid (Japan). A. Gel tray, B. Cara mencetak gel agarose. C. Peralatan
lengkap untuk running elektroforesis (dengan/tanpa ditambah power supply).

17. Gambar 2. Laju migrasi gel elektroforesis. Disampingnya adalah hasil elektroforesis DNA pada gel agarose dengan
DNA ladder sebagai markernya.
Gambar 3. Konsentrasi gel agarose dan hasil separasi dari marker DNA.
Acuan: Maniatis T et al, 1982-Molecular cloning : A Laboratory Manual. CSH.
TRANSFORMASI
Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri
misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah karena
mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA
ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.
Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat
kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan
metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman
adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang
tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi

18. yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru
pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.
Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat,
sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik
karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah
koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.
http://joelnaga.blogspot.com/2009/12/pembuatan-sel-kompeten-dan-transformasi.html
HASIL PRAKTIKUM
Hasil dari elektroforesis selama 45 menit dengan tegangan 90 volt dilihat dengan sinar UV:
TUJUAN
Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid
BAHAN DAN ALAT
1.E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19
2.Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair
3.Ampisilin
4.QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)
5.Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
6.Tabung mikrosentrifuga
7.Sarung tangan
8.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
9.Lemari pendingin
10.Kamera Digital
CARA KERJA
DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).
1.Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan
diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama
16 jam (semalam).

19. 2.Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung
mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
3.Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g
selama 5 menit.
4.Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.
5.Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik
sebanyak 4-6 kali.
6.Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.
7.Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga
warna suspensi kembali seperti warna awal.
8.Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900
x g) selama 10 menit.
9.Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang
dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000
rpm (17,900 x g) selama satu menit.
10.Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke
dalam tabung mikrosentrifuga.
11.QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000
rpm selama satu menit.
12.Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column
ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm
selama satu menit.
13.Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk
menghilangkan sisa buffer pencuci.
14.QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah
dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama
satu menit (elusi pertama).
15.QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah
dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi
pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).
HASIL

20. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada
umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi
sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk
komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.
Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini
preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar
(100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar
dari 200 µg.
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua
organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal
(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel,
organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling
lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang
paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA
memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.
DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama
waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis,
neutralization, dan clearing of lysate. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge
diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. Adanya EDTA ini berfungsi
sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma.
Selain itu EDTA juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Tris
Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap stabil. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil
sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri
dari: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk
mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel
bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu
membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara
yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah

21. mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan
segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan
menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5.
Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa
renaturasi.
Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single
stranded DNA karena molekulnyayang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar
garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang.
Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat
daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini
sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut
menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant.
Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi
DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena
perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid
yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan
etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang
didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat dilakukan analisis
lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis.

22. ACARA II.
RESTRIKSI DNA PLASMID
LANDASAN TEORI
Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai
pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu
organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat
diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah
pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan
DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.
Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand
DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi
dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong
dengan enzim restriksi.
TUJUAN
Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid
BAHAN DAN ALAT
1.Plasmid pUC19
2.Enzim restriski (PstI)
3.Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
4.Tabung mikrosentrifuga
5.Sarung tangan
6.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
7.pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)
8.termometer
9.Lemari pendingin (Frezer)
10.Kamera Digital

23. CARA KERJA
1.Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom,
yaitu enzim PstI.
2.Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat
terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam
tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI
3.Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil
optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi
Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan PstI sebayak 2 µl
untuk vinal volume 50 µl.
4.Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik.
Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.
5.Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C
selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).
0
6.Tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 C selama 10 menit
menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.
7.Larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer.
HASIL
Amatilah hasil pemotongan DNA palsmid dengan melihat visualisasi sampel larutan DNA
plasmid yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa (Acara III.)
DAFTAR REFERENSI
http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/disertasi/article/view/1045

24. ACARA III.
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
LANDASAN TEORI
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan
atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain
agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan
ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA
standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di
bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan
larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam
larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.
Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun
kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang
terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup
memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi
elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan
untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran
DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
TUJUAN
Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa
BAHAN DAN ALAT
1.DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII
2.Sampel DNA, misalnya :
a. DNA kromosom bakteri,

25. b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)
c. DNA plasmid hasil restriksi (cut)
2.Agarosa
3.Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH
8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)
4.Akuades
5.Gelas Ukur 1000 ml
6.Labu Erlenmeyer 50 ml
7.Tabung mikrosentrifuga
8.Sarung tangan
9.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
10.Kertas parafilm
11.seperangkat alat elektroforesis
12.Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA
120 mM)
13.larutan Etidium Bromid (EtBr)
14.UV transluminator
15.Kaca mata UV
16.kamera digital
CARA KERJA
No. Keterangan Gambar
1 Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%,
. timbang 0,2 g agarosa (sudah disiapkan
asisten)
2 Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20
. mL

26. 3 Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat
. jernih.
4 Biarkan larutan agarosa mendingin (55ºC)
. dan tambahkan 1 uL etidium bromida (10
mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke
dalam pencetak gel
5 Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke
. dua ujung pencetak gel dan menempatkan
sisir pada salah ujung pencetak gel
6 Tuangkan larutan agarosa ke dalam
. pencetak gel.
7 Setelah gel memadat, pindahkankan gel
. agarosa beserta pencetak gel ke dalam
tangki elektroforesis.
 Sebelum dipindahkan ke tangki
elekstroforesis, selotip pada kedua
ujung pencetak gel dilepas terlebih
dahulu
8 Masukkan 10 µL sampel DNA yang telah
. dicampur dengan 2 uL loading dye (6X) ke
dalam sumur (well) gel agarosa
9 Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda
. warna (biru) bermigrasi di atas gel agarose
bagian bawah.

27. 1 Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel
0 agarosa di atas UV transillumitor dan tutup
. kaca pelindung dan amati pita DNA
1 Dokumentasikan pita DNA yang tampak
1 menggunakan kamera .
.
HASIL
Gambarlah pita-pita dna hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya.
Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan memsumuraningkannya dengan posisi
migrasi pada DNA marker.

28. Keterangan: 9 = A4 (pUC)
1 = Marka (λ/hind III) 10 = K1 (pUC hasil isolasi)
2 = K1 (pUC + HindIII) 11 = K2 (pUC hasil isolasi)
3 = K2 (pUC + E. Cory I)
4 = K3 (pUC + Pst I)
5 = K4 (pUC + E. Cory I)
6 = A1 (pUC + E Cory I)
7 = A2 (pUC + Pst I)
8 = A3 (pUC + HindIII)

29. base
distance(mm distance unknow bp
pairs log 10 bp m*distance y value
) unknow value
(bp)
23130 13 4.364176 36 -0.972 3.711 5140.436516
9416 25 3.973866 35 -0.945 3.738 5470.159629
6557 30 3.816705 33 -0.891 3.792 6194.410751
4361 40 3.639586 35 -0.945 3.738 5470.159629
43 -1.161 3.522 3326.595533
32 -0.864 3.819 6591.738952
35 -0.945 3.738 5470.159629
44 -1.188 3.495 3126.079367
45 -1.215 3.468 2937.649652
43 -1.161 3.522 3326.595533
Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan
menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini
berfungsi sebagai pemsumuraning sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA
sampel. Beberapa hal yang dapat mempengaruhi hasil elektroforesis adalah jumlah
DNA di dalam sampel dan kecepatan migrasi DNA yang dipengaruhi oleh ukuran
DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik,
temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer
elektroforesis
Berdasarkan hasil praktikum tersebut persamaan regresi logaritmik yang digunakan
untuk DNA marker data yang diperoleh: y = -0,027x+4,683; R2 = 0,977 Persamaan

30. logaritmik menghasilkan nilai R2 yang paling mendekati 1. Dengan menggunakan
persamaan ini dapat ditentukan ukuran DNA sampel berdasarkan jarak migrasinya:
NO SUMURAN distance unknow unknow bp value
1. Marka (DNA λ/Hind III)
2. K1 (pUC + HindIII) 36 5140.436516
3. K2 (pUC + E. Cory I) 35 5470.159629
4. K3 (pUC + Pst I) 33 6194.410751
5. K4 (pUC + E. Cory I) 35 5470.159629
6. A1 (pUC + E Cory I) 43 3326.595533
7. A2 (pUC + Pst I) 32 6591.738952
8. A3 (pUC + HindIII) 35 5470.159629
9. A4 (pUC) 44 3126.079367
10. K1 (pUC hasil isolasi) 45 2937.649652
11. K2 (pUC hasil isolasi) 43 3326.595533
Hasil praktikum menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak
migrasi DNA marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada
sumuran ke 10 pita DNA tidak jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan
perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat. Hal ini dimungkinkan saat
meletakkan DNA pUc hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran sehingga hasil
elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas. Selain itu yang menyebabkan
kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat
karena adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui
jarak migrasi pastinya.). Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan
bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak
migrasinya. Untuk plasmid yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya
DNA lain, seperti DNA kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut
dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran
DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan
penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak
dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi
karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Hampir semua sumuran
menunjukkan adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear
dan kurang jelas yang merupakan ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita
no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya smear. Bentuk DNA (plasmid)
yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk

31. supercoiled. Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi, relaxed
circular, linear, dan nicked open circular. Hal yang dapat menyebabkan
tertumpuknya sumuran ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses
elektroforesis yang dilakukan. DNA plasmid yang digunakan untuk proses
elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid
dalam bakeri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada
proses penetralan jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu
kuat maka DNA kromosomal dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid
yang digunakan untuk tahap selanjutnya. Dalam proses elektroforesis itu sendiri
banyak hal yang mempengaruhi migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi
agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur,
keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis.
DAFTAR REFERENSI
http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/
http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid

32. ACARA IV.
TRANSFORMASI
LANDASAN TEORI
Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang
bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah
karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut.
Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.
BAHAN ADAN ALAT
1.strain E. coli JM 109
2.media LB cair
3.media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin
4.media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG
5.es batu
6.shaker-incubator
7.termometer
8.Tabung mikrosentrifuga
9.Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
10.Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
11.pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)
12.jarum ose
13.batang drugalsky
14.cawan Petri
15.Erlenmeyer
16.shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)
17.kamera digital.
CARA KERJA
1.Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan
cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di
dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16
jam (semalam).

33. 2.Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml
dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml,
atau dengan kata lain persumuraningan antara volume media dan volume kultur 10:1,
kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125
rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC.
3.Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam
tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama
5 menit.
4.Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl
CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g
selama 5 menit.
5.Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl
CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat
lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya
untuk inkubasi 16 jam.
6.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel
kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19
sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.
7.Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi
kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan
ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.
8.Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10
menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan
kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.
9.Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan
LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung
nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan
selama 16 jam pada suhu 37oC.
10.Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang
masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler
untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19
rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5).

34. 11.Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit
dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera
dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.
12.Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,
dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC.
13.Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl
X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37oC
selama lebih kurang 30 menit.
14.Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan
LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl.
15.Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara
plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.
16.Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan
LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan
dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC.
17.Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan
koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.
18.Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut
Dimana,
Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)
[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)
HASIL
Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah molekul DNA
rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan
tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel inang. Sel inang yang paling umum
digunakan adalah Escherichia coli.. Karena sel dalam E.coli tergolong tidak efisien
dalam menyerap DNA. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing
yang rendah. Kemampuan sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan
perlakuan khusus, sehingga sel tersebut menjadi kompeten.
Sel kompeten adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat
perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan

35. garam kalsium klorida (CaCl2). Fungsi penambahan CaCl2 pada pembuatan sel
kompeten mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA
pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA
secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas. Sel E.coli yang
kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri.
Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel.
Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi
kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.
Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut
transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut
transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid
masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka
yang dibawa oleh plasmid tersebut.
Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan
dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar
500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada gambar .
Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten
terhadap ampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase
ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin
betalaktam, sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19
menjadi resisten terhadap ampisilin. Sel inang yang telah mengandung DNA
rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni

36. yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan
sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang
berasal dari bakteri transforman saja.
Hasil praktikum transformasi yang telah dilakukan tersaji dalam plate seperti
berikut:
Hasil tersebut menunjukkan pada pUC yang ditambah LB amphisilin (LB-
Amp), setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 274 koloni, sedangkan pada
pUC LB Non-Amp koloni terlalu banyak (TBUD). Pada Non-pUC LB non-Amp
hasilnya juga terdapat banyak koloni (TBUD). Hasil transformasi yang tidak benar
terjadi pada hasil Non-pUC LB-Amp yang seharusnya kosong, namun hasil yang

37. didapat dari praktikum kita terdapat kontaminan. Hal ini dimungkinkan amphisilin
telah rusak, karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja
kurang aseptis atau kurang steril. Pada cawan sampel terjadi pertumbuhan bakteri
E.coli transforman yang telah membentuk koloni tunggal. Transformasi antara sel
yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat
menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki
dengan penambahan EDTA pada media seleksi.
Peningkatan efisiensi transformasi dapat dilakukan dengan modifikasi metode
standar CaCl2. Konsentrasi optimum CaCl2 adalah 75 mM. Sel kompeten yang
disimpan dalan -20oC dapat bertahan hingga 7 hari, sementara penyimpanan pada
-70oC dapat bertahan hingga 15 hari. Media LB diganti dengan media SOC yang
berisi tripton, ekstrak ragi, NaCl, MgCl2, MgSO4, dan glukosa. Media ini mendukung
pertumbuhan transforman yang lebih cepat. Sementara itu, pada saat transformasi
dengan plasmid ditambahkan DMSO dan PEG8000. Penambahan ini mampu
meningkatkan efisiensi transformasi antara 100-300 kali lipat.
DAFTAR REFERENSI
http://journal.ui.ac.id/upload/artikel/Transformasi%20fragmen_Mangunwardoyo.pdf
http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-metode-
cacl2/
http://etd.eprints.ums.ac.id/2340/1/K100040214.pdf

38. Lampiran 1. Peta Restriksi DNA pUC19

39. Lampiran 2. Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin
Miniprep Kit (Qiagen, USA)
@3
ml
Inkubas
E.coli 25 i 370C,
transfor m shaker
man 1 Sentrifugasi
Sp 5.700xg
Cai
Kol ran dib
om + 1 ml
resuspen
Sentri
+ 500 µl Sp fugasi
dib 5000
Sentrifug
+ 50 µl asi
13.000 Cai
Sentrifug + 250 µl
asi ran Resuspensi (vortex,
13.000 + 250 µl
Bolak-balik
+ 750 µl
War
Sentrifug na
asi
Cai 13.000 + 350 µl
DN Bolak-balik
ran
A
War
na
BIR
Sentrifug Sentrifug
asi asi
13.000 13.000
Sp
dipi
Sentrifug
asi
13.000

40. Lampiran 3. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid
Optimasi reaksi pemotongan DNA (Modifikasi Promega, 2005)
No. Komponen P1 P2 P3
1. ddH2O 22,5 µl 22,5 µl 22,5 µl
2. Buffer E 5 µl 5 µl 5 µl
3. BSA 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl
4. DNA
pUC19 20 µl 20 µl 20 µl
5. PstI 2 µl - -
6. HinfI - 2 µl -
7. HindIII - - 2 µl
Jumlah 50 µl 50 µl 50 µl
1 2 3 4 5 6 7
P1 P2 P3
Spin sebentar,
2”
Ketuk-ketuk
Inkubasi 37 0C, dg Water bath selama 4 jam
Simpan di
frezer
Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menit

41. Lampiran 4.Skema Keja Pembuatan Gel Agorosa Elektroforesis
Dibuat TAE 1 X 250 ml
(5 ml TAE 50Xke dalam 245 ml akuades)
Agarosa dilarutkan dalam buffer TAE 1X hingga 20 ml
dengan konsentrasi gel agarosa sebesar 1%
Gel agarosa
Dibuat larutan gel agarosa
Dihomogenkan dengan
pemanasan hingga mendidih
Dibuat cetakan gel
Diamkan hingga suhu ±50oC
Ditambah 2 ml etidium Kedua ujung ditutup
bromida selotip
Larutan gel agarosa Sisir elektroforesis dipasang
untuk dibuat sumur
Dituang ke dalam cetakan gel
Gel memadat didalam cetakan
Sisir dan selotip
dilepas
220 ml TAE 1X di dalam
bejana buffer Elektroforesis Gel memadat beserta cetakan
Dimasukkan hingga tenggelam

42. Lampiran 5. Skema Kerja Elektroforesis Gel Agarosa
Sampel DNA
Dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis
Arus DC dialirkan dari power supply
Migrasi DNA menuju electrode positif
Dilihat pita DNA pada transiluminator UV
Gambar 1. Gel Agarosa Elektroforesis

43. Lampiran 6. Skema Kerja Pembuatan Sel Kompeten E. coli JM 109
Sp
E. coli JM 09 Sel kompeten, gliserol
Medium LB
Inkubasi ± 16 jam
Overnight
37 0C
Inkubasi ± 16 jam
Overnight
Shaker incubator
Medium LB 150 rpm
LB 25 ml 37 0C
Overnight
E.coli JM 09 Diambil 250 µl
Inkubasi ± 2 jam
Shaker incubator 150 rpm
37 0C
LB cair 25
Masing-masing ml
1,5 ml
Sentrifugasi
5.000 rpm Tabung
5 menit sentrifuga
1 2 3 4 5 6
Dibuang supernatannya
+ 500 CaCl2 (Vortex)
Sentrifugasi 5.000 rpm, 5 Kerja
menit Aseptis
Dibuang supernatannya
+ 200 CaCl2 (Vortex)
Inkubasi :es
Tabung 1 dan 2 selama 2 jam Transformasi
Tabung 3, 4 dan5 selama 16 jam

44. Lampiran 7. Skema Kerja Transformasi E. coli JM 109
Inkubasi 2 jam
Tabung sentrifuga berisi
E.coli JM 09 kompeten
inkubasi 2 jam
1 2
Simpan di ES
2
Tabung sentrifuga
treatment 1 2
dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl
+ ketuk-ketuk
pUC 19 10 µl -
1 2 Simpan di ES selama 20 menit
Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik
Simpan segera di ES selama 10 menit
Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl)
Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm
100 µl 50 µl
1A 1B
1 2
PLATING 1
Medium LB Amp Medium LB
inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit
2A 100 µl 50 µl 2B
Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada 2
medium LB Amp cawan 2A
Medium LB Amp Medium LB

45. Inkubasi 16 jam
Tabung sentrifuga berisi
E.coli JM 09 kompeten
inkubasi 16 jam
3 4 5
3 5 Simpan di ES
4
Tabung sentrifuga
treatment 3 4 5
dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl 200 µl
+ ketuk-ketuk pUC 19 10µl - -
pUC 19 rekombinan - 2 µl -
3 4 5 Simpan di ES selama 20 menit
Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik
Simpan segera di ES selama 10 menit
Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl)
Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm
PLATING Disentrifugasi 5.000 rpm, ± 5 menit
3 4 5 4
Supernatan dibuang, sisakan 100 µl
100 µl
3A 4A
3 100 µl
4
medium medium
LB/Amp/X-Gal/IPTG LB/Amp/X-Gal/IPTG
5A
100 µl 50 µl
5B
∑ koloni × pengenceran = CFU
[ pUC19] µg
5
Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)
medium Medium LB
LB Amp [pUC 19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)
Inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit
Dihitung jumlah koloni putih pada cawan 4A untuk diketahui effisiensi
transformasinya

46. Lampiran 8. Media Pertumbuhan Bakteri
1. Media Cawan Agar Luria-Bertani (LB) 100 ml
- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
- Agar 2 gram
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.
2. Media Cair Luria-Bertani (LB) 100 ml
- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.
3. Media Cawan Agar Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml
- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
- Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl
- Agar 2 gram
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.
4. Media Cair Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml
- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
- Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.
5. Media Cawan Agar LB/Amp/X-Gal/IPTG
Buat media agar LB/Amp seperti diatas, kemudian ditambahkan 100 μl IPTG 100
mM dan 50 μl X-Gal 50 mg/ml. Ratakan dengan cara dispread hingga kering,
inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit sebelum digunakan.

47. Komposisi Bufer dan Larutan
1. TAE bufer 50X (Annymous, http://www.6mgel.com/50x_tae_buffer_1_liter.htm)
- Tris-base 242 g
- Glacial acetic acid 57,1 g
- EDTA 0,5 M pH 8,0 100 ml
Semua komponen dilarutkan ke dalam akuades secukupnya, kemudian tambahkan
HCl untuk menentukan pH 7,6-7,8. Tera dengan akuades hingga volume akhir
1000 ml. Dapat disimpan pada suhu ruang.
2. Loading buffer 6X (Anonymous, http://www.bioron.net/products/dna-and-dna-
markers/loading-buffer/)
- Bromophenol blue 0,25%
- Xylene cyanol 0,25%
- Ficoll tipe 400 15%
- EDTA 120 mM
Semua komponen dilarutkan hingga homogen. Dapat disimpan pada suhu ruang.
3. Larutan stok IPTG (0,1 M) (Promega, 2003)
- IPTG 1,2 g
Tambahkan air sampai volume akhir 50 ml. Sterilisasi secara filtrasi kemudian
simpan pada 4o C.
4. Larutan X-Gal (2 ml) (Promega, 2003)
- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 100 mg
Larutkan dalam 2 ml N,N'-dimethyl-formamide. Tutup dengan aluminium foil
kemudian simpan dalam -20o C.