Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

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Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques - Présentation de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Claude GIRY - Biologiste - Centre Hospitalier - Mamoudzou, Mayotte - c.giry@chmayotte.fr

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Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

  1. 1. EVALUATIONpar les FACILITATEURS Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiquesClaude GIRYCentre Hospitalier de Mayotte Atelier Paludisme 2007
  2. 2. Problématique La résistance aux antimalariques repose sur 3 mécanismes : Mutations ponctuelles Amplification génique Activité transcriptionnelle A chaque mécanisme correspond un ou plusieurs gènes dont l’altération est associée à une résistance médicamenteuse Chaque mécanisme fait l’objet d’études réalisées au moyen d’outils moléculaires Applications Surveiller le développement des souches résistantes Discriminer un échec thérapeutique d’une réinfection Atelier Paludisme 2007
  3. 3. Mutations ponctuellesAntipaludique Gène Remplacement acide aminé induit par ciblé une mutation ponctuelleSulfadoxine, Dapsone dhps S436A/F, A437G, K540E, A581G, A613S/TPyriméthamine, Trimethoprim dhfr N51I, C59R, S108N, I164L ou C50R, N51I, S108N, I164LProguanil, Chlorproguanil dhfr A16V, S108T ou N51I, C59R, S108N, I164LChloroquine crt C72S, M74I, N75D/E, K76T, A220S, Q271E mdr 1 N86Y, Y184F, S1034C, N1042D, D1246YMefloquine, Quinine, mdr 1 Codon sauvage N86Halofanthrine, Lumefantrine Nb copies gène mdr1 > 1Atovaquone cyt b Y268S/N Atelier Paludisme 2007
  4. 4. Mutations ponctuelles PCR en temps final Principe d’une réaction de PCR SSOPDIG PCR ELISA AS PCR RFLP PCRNZILA-MOUNDA, A. et al. DURAISINGH, M.T. et al.(Jan. 1998). Antimicrobial (1998).Agents and Chemotherapy. Exp Parasitol. 89;1-8 Alifrangis et al. (2005). Am. J. Trop.p. 164-169 Med. Hyg. 72(2); pp. 155–162
  5. 5. Mutations ponctuelles PCR en temps réel Principe SYBR Green I Sondes d’hydrolyse Taqman Sondes d’hybridation
  6. 6. Mutations ponctuelles Séquençage Séquençage direct Pyroséquençage Coût /échantillon/SNP RFLP 6.58 USD Séquençage 3.66 USD direct Pyroséquençage 2.28 USD Zhou et al. (2006). J Clin Microbiol. 44(11); p 3900–3910. Pyrosequencing, a High-Throughput Method for Detecting Single Nucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase and Dihydropteroate Synthetase Genes of Plasmodium falciparum
  7. 7. Mutations ponctuelles DNA Chips BRYANT et al. (2004). Lancet Infect Dis 2004; 4: 100–111
  8. 8. Mutations ponctuelles PCR-RFLP Pf. DHPS K540E M d nd D’après Mbugi et al. (2006). Malaria Journal, 5:94. p 1-11
  9. 9. Mutations ponctuelles PCR temps réel Pf. DHFR S108N Extracteur d’acides nucléiques (MagNA Pure Compact Roche)Thermocycleur temps réel (TaqMan 48 Roche) Laboratoire de biologie – Centre Hospitalier de Mayotte D’après une adaptation du protocole de Alker et al. (2004). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 2924–2929
  10. 10. Amplification génique PCR temps réel - Pfmdr-1 SYBR Green I / Taqman Gènes de référence présents à 1 ou plusieurs copie(s) Souche Pf. à tester vs. souche Pf. contrôle Méthode du ∆∆CT Nb de copies relatif = 2−∆∆CT=2 −( (CTER-CTEC)-(CTBR-CTBC) ) R : gène de référence C: gène cible E: souche à tester B: souche de référence Illustration: C. GIRY – Centre Hospitalier de Mayotte Exemple: Price et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased pfmdr1 gene copy number ». Lancet. 364; p 438-47
  11. 11. Activité transcriptionnelle PCR temps réel - Pfmdr-1 Stratégie Quantification relative Echantillon SYBR Green IExtraction d’ARN Gènes de référence (housekeeping genes) dont DNase I l’expression n’est pas affectée par Purification ARNm l’antipaludique. cDNA synthesis Méthode du ∆∆CT Random priming Optimisation OligodT priming Volume d’échantillon Sp. primer priming dNTPs, Mg2+ / Mn2+ Real time PCR Concentration en primers Real time PCR 2-step qRT-PCR t° et temps d’annealing/extension Efficacité de l’amplification 1-step qRT-PCR Atelier Paludisme 2007
  12. 12. Applications (I)Surveillance de la propagation des résistancesChloroquine Pyriméthamine Sulfadoxine D’après Jelinek et al.(2002). Malaria Journal. I:II; p 1-7 Atelier Paludisme 2007
  13. 13. Applications (II)Discriminer réinfection vs. recrudescence Recrudescence témoigne d’un échec thérapeutique précoce ou tardif Utilisation de marqueurs polymorphiques Msp1, Msp2, Glurp Microsatellites Atelier Paludisme 2007
  14. 14. Conclusions Perspectives Détection / Quantification absolue de pathogènes RFLP Séquençage Génotypage PCR TEMPS REEL Quantification Amplification d’ARNm génique Délétion Variants Translocation d’épissage Réarrangement Atelier Paludisme 2007
  15. 15. Références Merci de votre attention ALIFRANGIS, M. et al. (2005). « A Simple, High-Throughput Method to Detect Plasmodium falciparum Single Nnucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase, Dihydropteroate Synthase, and P. Falciparum Chloroquine Resistance Transporter Genes Using Polymerase Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Technology ». Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); p. 155–162 BERRY, A. et al. (2006). « Prevalence of Plasmodium falciparum cytochromeb gene mutations in isolates imported from Africa, and implications for atovaquone resistance ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 986-988 DURAISINGH, M.T. et al. (2005). « Contribution of the pfmdr1 gene to antimalarial drug- resistance ». Acta Tropica. 94; p 181–190 HYDE, J.E. (2002). « Mechanisms of resistance of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs ». Microbes and Infection. 4; p165-174 HYDE, J.E. (2005). « Drug-resistant malaria ». TRENDS in Parasitology. 21(11); p 494-498 JONES, P.M. et al. (2005). « Multidrug resistance in parasites: ABC transporters, P-glycoproteins and molecular modelling ». International Journal for Parasitology. 35 ; p 555–566 LE BRAS, J. et al. (2006). « Les résistances aux médicaments antipaludiques ». Médecine et maladies infectieuses. 36 ; 401–405 MBUGI, E.V. et al. (2006). « Drug resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in Plasmodium falciparum malaria in Mlimba, Tanzania”. Malaria Journal. 5(94) ; p 1-11 PLOWE, C.V. (2003). « Monitoring antimalarial drug resistance: making the most of the tools at hand ». The Journal of Experimental Biology. 206; p 3745-3752 PRICE, R.N. et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased pfmdr1 gene copy number ».Lancet. 364; p 438–47 RANDRIANARIVELOJOSIA M. et al. (2006). « First evidence of pfcrt mutant Plasmodium falciparum in Madagascar ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 826-830 WILSON, P.E. et al. (2005). « Real-time PCR methods for monitoring antimalarial drug resistance ». TRENDS in Parasitology. 21(6); p 278-283 WOODROW, C.J. et al.(2006). « Antimalarial drugs: recent advances in molecular determinants of resistance and their clinical significance ». Cell. Mol. Life Sci. 63 ; p 1586–1596

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