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PlanIntroductionTest in vitro : DELI testComparaison de microtest isotopique avecDELI testEtude faite au Sénégal et Burkin...
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Test in vitro : DELI testMéthode colorimétrique : Double-Site Enzyme Linked LDHImmunodetection (DELI test)Principe : métho...
Test DELI, principe de l’ELISA « double sandwich » pLDHMicroplaqueELISACoating Mab 1740°CDépôt des parasitesaprès congélat...
Etude comparative de DELI test etmicrotest isotopiqueMoreno et al. Evaluation under field conditions of the colourimetric ...
AvantagesDELI testGrande sensibilité, faibles parasitémiesDifférenciation des isolats sensibles etrésistants/intensité col...
LimitesDELI testDisponibilité des anticorps monoclonauxTemps : pour la recherche de la bonne dilution
ConclusionEnzyme pLDH et antigène HRPII (Double enzyme-linked immunoassay)Coût/disponibilité de Mab ou microplaquesCorréla...
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RéférencesBrasseur P et al. Évaluation de la sensibilité in vitro de Plasmodium falciparum auxantimalariques par un test c...
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DELI-test pour l'évaluation de la chimiosensibilité in vitro de Plasmodium falciparum

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DELI-test pour l'évaluation de la chimiosensibilité in vitro de Plasmodium falciparum - Présentation de la 4e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Valérie ANDRIANTSOANIRINA - Etudiant/Chercheur - Institut Pasteur de Madagascar - landyvalerie@yahoo.fr

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DELI-test pour l'évaluation de la chimiosensibilité in vitro de Plasmodium falciparum

  1. 1. DELIDELI--test pourtest pourll’é’évaluation de lavaluation de lachimiosensibilitchimiosensibilitéé in vitroin vitrodede Plasmodium falciparumPlasmodium falciparumValérie ANDRIANTSOANIRINA – Atelier paludisme 2006 - IPMEVALUATIONpar les FACILITATEURSEVALUATIONpar les FACILITATEURSEVALUATIONpar les FACILITATEURS
  2. 2. PlanIntroductionTest in vitro : DELI testComparaison de microtest isotopique avecDELI testEtude faite au Sénégal et Burkina Faso en 1997-1998Avantages et limitesConclusion
  3. 3. Introduction3 méthodes d’évaluation de la chimiosensibilité :-Tests In vivo : technique de base pour déceler la résistance, test simplifié de 14j,recherche de la pharmacorésistance-Test In vitro : incubation des parasites dans un milieu réparti dans des puitscontenant une gamme de concentrations de médicaments.-Marqueurs moléculaires (SNPs) : nouvelles technologiesDéfinition chimiorésistance des parasites : « laptitude dune souche deparasites du paludisme à survivre ou à se reproduire malgré ladministration etlabsorption dun médicament employé à des doses égales ou supérieures auxdoses ordinairement recommandées mais comprises dans les limites detolérance du sujet » (OMS)
  4. 4. Test in vitroTest de chimiosensibilité :phénotypageDétection des marqueurs génétiquesde résistance : génotypageMicroscopieIsotopique (Hypoxanthine tritiée)Colorimétrique : pLDH, HRP IICytométrie en fluxMicrofluorimétrique (Sybrgreen)PCR/séquençagePCR/sonde (Dot blot)RT-PCRPuces à ADN (Microarrays)PCR/RFLP
  5. 5. Test in vitro : DELI testMéthode colorimétrique : Double-Site Enzyme Linked LDHImmunodetection (DELI test)Principe : méthode basée sur la détection de la lactatedéshydrogénase spécifique de Plasmodium falciparumReconnaissance de 2 sites différents de l’enzyme par 2 Acmonoclonaux spécifiques : Mab17E4 et Mab19G7Coorélation entre densités optiques obtenues et les densitésparasitaires
  6. 6. Test DELI, principe de l’ELISA « double sandwich » pLDHMicroplaqueELISACoating Mab 1740°CDépôt des parasitesaprès congélation1h/37°C2ème Ac Mabbiotinylé 1h 37°CStreptavidinePod 30min TASubstrat 5-10 minTA obscuritéArrêt AcphosphoriqueLes résultats sont exprimés en CI50 : concentration d’antimalarique inhibant 50% de la quantité depLDH libérée par rapport au témoin sans antimalarique.Ac spécifiquepLDH de P. falc
  7. 7. Etude comparative de DELI test etmicrotest isotopiqueMoreno et al. Evaluation under field conditions of the colourimetric DELI-microtest for the assessment ofPlasmodium fakiparum drug resistance. Trans R Soc Trop Med H. 2001; 95, 100- 10367/85 (79%) : asymptomatiquesLame positiveParasitémie : 0.005 – 1% (0.1%)51/124 (41%) : fièvre, autres signesLame positiveParasitémie : 0.01 - 5% (1%)Burkina Faso (1998)Sénégal (1997)Sensibilité des isolats : chloroquine sulfate, quinine hydrochloride, mefloquinehydrochloride, amodiaquinePour les isolats, les microtests : faits sur des plaques dupliquées• Pour mesurer la croissance des parasites par méthodeisotopique• Pour la méthode DELI
  8. 8. AvantagesDELI testGrande sensibilité, faibles parasitémiesDifférenciation des isolats sensibles etrésistants/intensité coloration, diminution pLDH libéréCalcul valeur CI50Lecture sans compteur à scintillation maisspectrophotomètrePas de composé radioactifUtilisation pour enquêtes sur terrain/techniciens desantéFacile et rapideBrasseur P et al. Évaluation de la sensibilité in vitro de Plasmodium falciparum aux antimalariques par un test colorimétrique(DELI-microtest). Med. Trop. 2001; 61 : 545-547.
  9. 9. LimitesDELI testDisponibilité des anticorps monoclonauxTemps : pour la recherche de la bonne dilution
  10. 10. ConclusionEnzyme pLDH et antigène HRPII (Double enzyme-linked immunoassay)Coût/disponibilité de Mab ou microplaquesCorrélation (pas de concordance) avec test isotopiqueHautement précis/très sensible (0.01% parasitémie)Kits pour standardisation simple et reproductibilité des essaisMicrotest isotopique: problème de budget, difficile sur terrainTechnique syberGreen (immunofluorescence) peut permettre de combler ladéfaillance de ces techniques
  11. 11. Conclusion (2)Le test in vitro est-il suffisant pour évaluer lachimiosensibilité?Test in vitro résultat quantitatifen dehors contextes pathologiques et immunologiquesle phénotype déterminé par le test in vitro : objectif, plus fiable, plusreproductible, plus utiliséTest in vivo mise en œuvre facilesuivi des malades, intervention rapiderecueil des données cliniques et épidémiologiquesTous ces données sont importants pour guider la politique nationale de la luttecontre le paludisme de chaque pays
  12. 12. RéférencesBrasseur P et al. Évaluation de la sensibilité in vitro de Plasmodium falciparum auxantimalariques par un test colorimétrique (DELI-microtest). Med. Trop. 2001; 61 : 545-547Basco L. et al. Chimiorésistance du paludisme : problèmes de la définition et delapproche technique. Cahiers détudes et de recherches francophones / Santé. Vol. 10,Numéro 1, Janvier - Février 2000 : 47-50Parola et al. Chimiosensibilité de Plasmodium falciparum importé des Comores àMarseille en 2002–2003. Médecine et Maladies InfectieusesVolume 35, Issue 10 , October 2005, 489-491Moreno et al. Evaluation under field conditions of the colourimetric DELI-microtest forthe assessment of Plasmodium fakiparum drug resistance. Trans R Soc Trop Med H.2001; 95, 100- 103Druilhe et al. A colorimetric in vitro drug sensitivity assay for Plasmodium falciparumbased on a highly sensitive double-site lactate deshydrogenase antigen-captureenzyme-linked immunosorbent assay. Am.J.Trop. Med.Hyg. 2001;64:233-241Makler et al. Maesurement of the lactate deshydrogenase activity of Plasmodiumfalciparum as an assessment of parasitemia. Am. J. Trop. .Med Hyg. 1993; 48: 205-210Makler et al. Parasite lactate deshydrogenase as an assay for Plasmodium falciparumdrug sensitivity . Am. J. Trop. Med. Hyg. 1993.; 48: 739-741
  13. 13. Previous drug intakeAnticoagulantDelay of cultureFreeze and cultureVolume per wellParasitemiaHaematocritpH (modifies activity ofantimalarials)CO2/O2 concentration(modifies pH )Serum or substitutesMedium (no paba no folicacid for antifolates; no ironfor iron chelators)HypoxanthineDuration of the testSolvent to prepare the stocksolutionsDrugs (salt)Self-life of the plates andconservationCalculation method (linearor non-linear regression;background cpm)Dr Ringwald. Workshop, Lyon, Déc 2005

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