Applications dans l'évaluation de l'impact des interventions dans lutte contre le paludisme - Présentation de la 6e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - IDRISSA Sabit et STEENKESTE Nicolas

1. Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Génotypage de Plasmodium sp :
Applications dans l’évaluation de
l’impact des interventions dans la
lutte contre le paludisme
Sabiti IDRISSA et Nicolas STEENKESTE
EVALUATION
par les FACILITATEURS

2. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/082
Plan
• Les Techniques de Biologie
Moléculaire :
• Le Diagnostic d’Espèce
• La Résistance aux Antipaludiques
• Le Polymorphisme
• Analyse Dynamique

3. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/083
L’ADN
En 1953, J. Watson et F. Crick
découvre la structure de
l’ADN :
Acide DésoxyriboNucléique
Localisation de l’ADN :
Eucaryote :
Chromosome
mitochondrie …

4. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/084
PCR : Polymerase Chain Reaction
Mise au point en 1985 par Karry Mullis.
But :
Amplifier une partie spécifique d'un
acide nucléique donné afin d'en
obtenir une quantité suffisante pour
le détecter.

5. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/085
Polymerase Chain Reaction
D’après Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article Réaction en chaîne par polymérase
Augmentation
exponentielle du
nombre de copie
94°
72°
Extraction de
l’ADN

6. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/086
Post PCR
• Gel d’agarose ( positif / négatif )
• Séquençage
Grâce à la méthode de Sanger, on peut avoir la
séquence d’un produit PCR.
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Utilisation des enzymes de restriction
(ex: AluI = 5'-A G^C T-3' ) pour mettre en évidence
un polymorphisme.
• Puce à ADN
Permet de mettre en évidence notamment des
mutations ponctuelles.

7. Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Le Diagnostic d’espèce Plasmodiale

8. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/088
La microscopie
P. falciparum P. vivax
P. ovale P. malariae
Photographie prise par le laboratoire d’Epidemiologie Moleculaire de l’IPC
sensibilité =
~10-50 parasites/ul
ADVANTAGES :
• Faible coût,
• Adapté au terrain,
• Donne des informations sur la
parasitémie.
INCONVENIENTS :
• Besoin d’une formation
spécifique et d’une grande
expérience,
• Identification entre les espèces
difficiles,
• Pas adapté à une analyse d’un
grand nombre d’échantillon

9. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/089
PCR d’identification d’espèce
PRINCIPE :
EXEMPLE :
m F V M O
#14
205bp
787bp
144bp
#14 = infection avec
P. falciparum (F, 205 bp),
P. vivax (V, 117 bp),
P. ovale (O, 787 bp).
VARIABLE AREA
FALCIPARUM
VIVAX
MALARIAE
OVALE
PCR primaire
4 nested PCR
PLASMODIUM
SSU rRNA gene CONSERVED AREACONSERVED AREA
117bp
Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain
reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med
Hyg 90, 519-21 (1996).
Incardona, S. et al. Large-scale malaria survey in
Cambodia: Novel insights on species distribution and risk
factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March 2007).

10. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0810
La sensibilité de la PCR
Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain reaction amplification of
dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 90, 519-21 (1996).
• 8 échantillons qui étaient négatifs en microscopie sont
détectés positifs par PCR.
• Inversement, 3 échantillons n’ont pas été détectés par la PCR.
• 1 échantillon est passé d’un diagnostic Pf à Pf+Pv.
• 90 échantillons sur les 120 analysés sont négatifs en PCR et
microscopie.

11. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0811
Avantages de la PCR
• Très grande sensibilité; Mise en évidence :
des asymptomatiques ( faible parasitémie )
des infections mixtes
• Impact pour la lutte :
Avoir une idée plus juste de la prévalence
Connaître les espèces (infection mixte comprise)
Par exemple : Alerte pour la mise en place d’un traitement
spécifique à P. vivax
Traiter un grand nombre d’échantillon

12. Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
LA RESISTANCE :
L'analyse des mutations ponctuelles
(SNP) liées à la résistance
chez Plasmodium falciparum

13. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0813
La Résistance
6 gènes d’intérêts ont été associés aux résistances :
– Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil
– Pfdhps aux sulfadoxines
– Pfcrt à la chloroquine
– Pfmdr1 à la chloroquine
(par nombre de copie : méfloquine)
– Pfcytb à l’Atovaquone
– Pfatpase6 candidat associé aux
résistances aux dérivés de l’artémisinine
Au total, 34 SNP liés à la Résistance
Andreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all currently known single
nucleotide polymorphisms associated with parasite resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol.
10.1128/JCM.01178-07

14. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0814
Analyse de la résistance par SNP
• Etude In vitro, In vivo
Les échantillons doivent être traités immédiatement
Nécessité d’un fort investissement :
• en temps
• en personnel
• Etude Moléculaire
Recueil plus souple
(lors d’une enquête de prévalence ou démographique…)
Analyse extemporanément
Analyse possible pour un grand nombre d’échantillon

15. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0815
La Résistance
– Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil
– Pfdhps aux sulfadoxines
– Pfcrt à la chloroquine
– Pfmdr1 à la chloroquine
(par nombre de copie : méfloquine)
– Pfcytb à l’Atovaquone
– Pfatpase6 candidat associé aux
résistances aux dérivés de l’artémisinine
– Et…
Possibilité de
faire du
Monitoring de
l’évolution de
drogue suite à
l’introduction.
On a besoin
d’une
définition
stricte de la
résistance.

16. Ministère de la Santé, du Planning
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Madagascar
Ministère de la Santé, du Planning
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Madagascar
LE POLYMORPHISME :
msp1, msp2, glurp
Microsatellites

17. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0817
Polymorphisme des Antigènes
Exemple de msp2
Gène de la « Merozoïte Surface Protein 2 »
2 familles alléliques :
3D7 = bloc 3 variable en taille (6 à 30 bp), en séquence et en nombre de copie
FC27 = 2 séquences répétées : l’une d’1 à 4 copie d’un motif de 32-mer qui
est suivi d’une région conservée d’un fragment de 7-mer ; l’autre de 0 à 5
copies d’un motif de 12-mer.
Domaines avec variations de séquence et de longueur
Bloc 1
Conservé
Bloc 5
Conservé
Répétition en tandem
Smythe et al., 1990, 1991 ; Snewin et al., 1991 ; Felger et al., 1997 et 1999

18. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0818
Parasitémie Recrudescence ou ré-infection
Après le 15eme jour
temps
Recrudescence ou Ré-infection
A B

19. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0819
Recrudescence :
msp1 msp2 glurp
A B
A B
A B
Ré-infection :
msp1 msp2 glurp
A B
A B
A B
Recrudescence ou Ré-infection

20. Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Ministère de la Santé, du Planning
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Madagascar
Analyse Dynamique :
Exemple de Pfcrt

21. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0821
Pfcrt dans le Monde

22. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0822
Pfcrt dans le Monde
P. falciparum
Pfcrt
Séquençage
pour
identifier les
mutations
ponctuelles
Sauvage
Mutant
Un allèle de Pfcrt est arrivé
en Afrique.
Il faut suivre l’évolution des gènes de résistance
pour éviter leurs propagations.

23. GénotypagedePlasmodiumsp
Le 28/03/0823
Références
Site Internet :
• Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article sur la Réaction en chaîne par
polymérase
Article :
• Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain
reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop
Med Hyg 90, 519-21 (1996).
• Incardona S et al. Large-scale malaria survey in Cambodia: Novel insights on
species distribution and risk factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March
2007).
• Andreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all
currently known single nucleotide polymorphisms associated with parasite
resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol. 10.1128/JCM.01178-07.
• Smythe JA et al. Structural diversity in the Plasmodium falciparum merozoite
surface antigen 2. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 1;88(5):1751-5.
• Snewin VA et al. Polymorphism of the alleles of the merozoite surface antigens
MSA1 and MSA2 in Plasmodium falciparum wild isolates from Colombia. Mol
Biochem Parasitol. 1991 Dec;49(2):265-75.
• Felger I et al, Genotypes of merozoite surface protein 2 of Plasmodium
falciparum in Tanzania.Trans R Soc Trop Med Hyg. 1999 Feb;93 Suppl 1:3-9.
• Frédéric Ariey et al. Invasion of Africa by a single pfcrt allele of South East
Asian type. Malaria Journal 2006, 5:34.

24. Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
Et si vous utilisiez la biologie
moléculaire dans votre PNLP ?
Merci de votre attention