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GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/082Plan• Les Techniques de BiologieMoléculaire :• Le Diagnostic d’Espèce• La Résistance a...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/083L’ADNEn 1953, J. Watson et F. Crickdécouvre la structure del’ADN :Acide DésoxyriboNucl...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/084PCR : Polymerase Chain ReactionMise au point en 1985 par Karry Mullis.But :Amplifier u...
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GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/088La microscopieP. falciparum P. vivaxP. ovale P. malariaePhotographie prise par le labo...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/089PCR d’identification d’espècePRINCIPE :EXEMPLE :m F V M O#14205bp787bp144bp#14 = infec...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0810La sensibilité de la PCRSingh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested p...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0811Avantages de la PCR• Très grande sensibilité; Mise en évidence :des asymptomatiques (...
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GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0813La Résistance6 gènes d’intérêts ont été associés aux résistances :– Pfdhfr à la Pyrim...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0814Analyse de la résistance par SNP• Etude In vitro, In vivoLes échantillons doivent êtr...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0815La Résistance– Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil– Pfdhps aux sulfadoxines– Pfcrt...
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GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0817Polymorphisme des AntigènesExemple de msp2Gène de la « Merozoïte Surface Protein 2 »2...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0818Parasitémie Recrudescence ou ré-infectionAprès le 15eme jourtempsRecrudescence ou Ré-...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0819Recrudescence :msp1 msp2 glurpA BA BA BRé-infection :msp1 msp2 glurpA BA BA BRecrudes...
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GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0821Pfcrt dans le Monde
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0822Pfcrt dans le MondeP. falciparumPfcrtSéquençagepouridentifier lesmutationsponctuelles...
GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0823RéférencesSite Internet :• Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article sur la Réaction e...
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Applications dans l'évaluation de l'impact des interventions dans lutte contre le paludisme

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Applications dans l'évaluation de l'impact des interventions dans lutte contre le paludisme - Présentation de la 6e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - IDRISSA Sabit et STEENKESTE Nicolas

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Applications dans l'évaluation de l'impact des interventions dans lutte contre le paludisme

  1. 1. Ministère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarMinistère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarGénotypage de Plasmodium sp :Applications dans l’évaluation del’impact des interventions dans lalutte contre le paludismeSabiti IDRISSA et Nicolas STEENKESTEEVALUATIONpar les FACILITATEURS
  2. 2. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/082Plan• Les Techniques de BiologieMoléculaire :• Le Diagnostic d’Espèce• La Résistance aux Antipaludiques• Le Polymorphisme• Analyse Dynamique
  3. 3. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/083L’ADNEn 1953, J. Watson et F. Crickdécouvre la structure del’ADN :Acide DésoxyriboNucléiqueLocalisation de l’ADN :Eucaryote :Chromosomemitochondrie …
  4. 4. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/084PCR : Polymerase Chain ReactionMise au point en 1985 par Karry Mullis.But :Amplifier une partie spécifique dunacide nucléique donné afin denobtenir une quantité suffisante pourle détecter.
  5. 5. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/085Polymerase Chain ReactionD’après Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article Réaction en chaîne par polyméraseAugmentationexponentielle dunombre de copie94°72°Extraction del’ADN
  6. 6. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/086Post PCR• Gel d’agarose ( positif / négatif )• SéquençageGrâce à la méthode de Sanger, on peut avoir laséquence d’un produit PCR.• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)Utilisation des enzymes de restriction(ex: AluI = 5-A G^C T-3 ) pour mettre en évidenceun polymorphisme.• Puce à ADNPermet de mettre en évidence notamment desmutations ponctuelles.
  7. 7. Ministère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarMinistère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarLe Diagnostic d’espèce Plasmodiale
  8. 8. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/088La microscopieP. falciparum P. vivaxP. ovale P. malariaePhotographie prise par le laboratoire d’Epidemiologie Moleculaire de l’IPCsensibilité =~10-50 parasites/ulADVANTAGES :• Faible coût,• Adapté au terrain,• Donne des informations sur laparasitémie.INCONVENIENTS :• Besoin d’une formationspécifique et d’une grandeexpérience,• Identification entre les espècesdifficiles,• Pas adapté à une analyse d’ungrand nombre d’échantillon
  9. 9. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/089PCR d’identification d’espècePRINCIPE :EXEMPLE :m F V M O#14205bp787bp144bp#14 = infection avecP. falciparum (F, 205 bp),P. vivax (V, 117 bp),P. ovale (O, 787 bp).VARIABLE AREAFALCIPARUMVIVAXMALARIAEOVALEPCR primaire4 nested PCRPLASMODIUMSSU rRNA gene CONSERVED AREACONSERVED AREA117bpSingh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chainreaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop MedHyg 90, 519-21 (1996).Incardona, S. et al. Large-scale malaria survey inCambodia: Novel insights on species distribution and riskfactors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March 2007).
  10. 10. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0810La sensibilité de la PCRSingh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain reaction amplification ofdried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 90, 519-21 (1996).• 8 échantillons qui étaient négatifs en microscopie sontdétectés positifs par PCR.• Inversement, 3 échantillons n’ont pas été détectés par la PCR.• 1 échantillon est passé d’un diagnostic Pf à Pf+Pv.• 90 échantillons sur les 120 analysés sont négatifs en PCR etmicroscopie.
  11. 11. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0811Avantages de la PCR• Très grande sensibilité; Mise en évidence :des asymptomatiques ( faible parasitémie )des infections mixtes• Impact pour la lutte :Avoir une idée plus juste de la prévalenceConnaître les espèces (infection mixte comprise)Par exemple : Alerte pour la mise en place d’un traitementspécifique à P. vivaxTraiter un grand nombre d’échantillon
  12. 12. Ministère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarMinistère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarLA RESISTANCE :Lanalyse des mutations ponctuelles(SNP) liées à la résistancechez Plasmodium falciparum
  13. 13. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0813La Résistance6 gènes d’intérêts ont été associés aux résistances :– Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil– Pfdhps aux sulfadoxines– Pfcrt à la chloroquine– Pfmdr1 à la chloroquine(par nombre de copie : méfloquine)– Pfcytb à l’Atovaquone– Pfatpase6 candidat associé auxrésistances aux dérivés de l’artémisinineAu total, 34 SNP liés à la RésistanceAndreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all currently known singlenucleotide polymorphisms associated with parasite resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol.10.1128/JCM.01178-07
  14. 14. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0814Analyse de la résistance par SNP• Etude In vitro, In vivoLes échantillons doivent être traités immédiatementNécessité d’un fort investissement :• en temps• en personnel• Etude MoléculaireRecueil plus souple(lors d’une enquête de prévalence ou démographique…)Analyse extemporanémentAnalyse possible pour un grand nombre d’échantillon
  15. 15. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0815La Résistance– Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil– Pfdhps aux sulfadoxines– Pfcrt à la chloroquine– Pfmdr1 à la chloroquine(par nombre de copie : méfloquine)– Pfcytb à l’Atovaquone– Pfatpase6 candidat associé auxrésistances aux dérivés de l’artémisinine– Et…Possibilité defaire duMonitoring del’évolution dedrogue suite àl’introduction.On a besoind’unedéfinitionstricte de larésistance.
  16. 16. Ministère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarMinistère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarLE POLYMORPHISME :msp1, msp2, glurpMicrosatellites
  17. 17. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0817Polymorphisme des AntigènesExemple de msp2Gène de la « Merozoïte Surface Protein 2 »2 familles alléliques :3D7 = bloc 3 variable en taille (6 à 30 bp), en séquence et en nombre de copieFC27 = 2 séquences répétées : l’une d’1 à 4 copie d’un motif de 32-mer quiest suivi d’une région conservée d’un fragment de 7-mer ; l’autre de 0 à 5copies d’un motif de 12-mer.Domaines avec variations de séquence et de longueurBloc 1ConservéBloc 5ConservéRépétition en tandemSmythe et al., 1990, 1991 ; Snewin et al., 1991 ; Felger et al., 1997 et 1999
  18. 18. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0818Parasitémie Recrudescence ou ré-infectionAprès le 15eme jourtempsRecrudescence ou Ré-infectionA B
  19. 19. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0819Recrudescence :msp1 msp2 glurpA BA BA BRé-infection :msp1 msp2 glurpA BA BA BRecrudescence ou Ré-infection
  20. 20. Ministère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarMinistère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarAnalyse Dynamique :Exemple de Pfcrt
  21. 21. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0821Pfcrt dans le Monde
  22. 22. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0822Pfcrt dans le MondeP. falciparumPfcrtSéquençagepouridentifier lesmutationsponctuellesSauvageMutantUn allèle de Pfcrt est arrivéen Afrique.Il faut suivre l’évolution des gènes de résistancepour éviter leurs propagations.
  23. 23. GénotypagedePlasmodiumspLe 28/03/0823RéférencesSite Internet :• Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article sur la Réaction en chaîne parpolyméraseArticle :• Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chainreaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc TropMed Hyg 90, 519-21 (1996).• Incardona S et al. Large-scale malaria survey in Cambodia: Novel insights onspecies distribution and risk factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March2007).• Andreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of allcurrently known single nucleotide polymorphisms associated with parasiteresistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol. 10.1128/JCM.01178-07.• Smythe JA et al. Structural diversity in the Plasmodium falciparum merozoitesurface antigen 2. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 1;88(5):1751-5.• Snewin VA et al. Polymorphism of the alleles of the merozoite surface antigensMSA1 and MSA2 in Plasmodium falciparum wild isolates from Colombia. MolBiochem Parasitol. 1991 Dec;49(2):265-75.• Felger I et al, Genotypes of merozoite surface protein 2 of Plasmodiumfalciparum in Tanzania.Trans R Soc Trop Med Hyg. 1999 Feb;93 Suppl 1:3-9.• Frédéric Ariey et al. Invasion of Africa by a single pfcrt allele of South EastAsian type. Malaria Journal 2006, 5:34.
  24. 24. Ministère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarMinistère de la Santé, du PlanningFamilial et de la Protection SocialeMadagascarEt si vous utilisiez la biologiemoléculaire dans votre PNLP ?Merci de votre attention

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