Les carboxypeptidases Bd’Anopheles gambiae impliquéesdans le développement dePlasmodium falciparumCatherine LavazecInstitu...
www.msf.fr
Cycle biologique de Plasmodium
14 heures : Formation des ookinètes24 heures :Pénétration des ookinètes48 heures : Initiation dudéveloppement des oocystes...
Stratégies de blocage de la transmissionMoustiques transgéniques Vaccin bloquant la transmissionHommeMoustiquegamétocytesg...
Intérêt d’un vaccin bloquant la transmissionbasé sur un antigène de moustique- Protéine recombinante plus facile à produir...
Sélection d’un gèned’Anopheles gambiaeimpliqué dans l’interactionavec Plasmodium falciparum- 1 -
Differential display1 : sang non parasité2 : sang + formes asexuées3 : sang + gamétocytes1 2 3Gene AGene BGene CGene DActi...
+ argCPBS arg SCarboxypeptidase B (CPB)
48,2 kDaCPBAg1(CarboxyPeptidase B Anopheles gambiae 1)423 aa35,9 kDaLavazec et al, Insect Mol. Biol., 2005
Protéine recombinante CPBAg110080604020Activité(%)00 0,1 100 1000 M10080604020Activité(%)00 0,1 10 1000 M1,10-Phenantrolin...
Les carboxypeptidases Bd’Anopheles gambiae- 2 -
5 CPB5 CPA13séquencesFonction?5 CPB putatives chez An. gambiaeFamille de carboxypeptidasescpbAg1 VFMDGGIHAREWAGV--WRKNRSPG...
Expression des CPB chez An. gambiaecpbAg1 et cpbAg2 sont les seuls gènes de CPBexprimés dans le tube digestif des Anophele...
Expression en présence de P. falciparumSang non parasitéGamétocytesStades asexués14hRatiod’expression(%)300100500700900cpb...
Activité CPB in vivoActivité CPB induitepar le repas de sangActivitéCPB(mU/TD)Activité CPB modifiéeen présence de gamétocy...
Le rôle de l’activité CPB dans ledéveloppement de Plasmodium- 3 -
+ aaCPBAnticorpsanti-CPBAg11S aa S2S + aa+ SubstratssynthétiquesCPB3 + Arg / LysActivité CPB :- limite le developpement du...
Infections de moustiques sur le terrainTechnique de gorgement sur membrane
+ aaCPBAnticorpsanti-CPBAg11SS aa% Inhibition activité CPB14h PBM 54% +/- 924h PBM 36% +/- 848h PBM 33% +/- 11MLavazec et ...
+ aaCPBAnticorpsanti-CPBAg11SS aaSérumpréimmunSérumanti-CPBAg1Moustiquesinfectés(%)10080604020095 % réduction de la préval...
Anticorpsanti-CPBAg1activité CPB facilitele développementdu parasite?1Substrat clivé? Acides aminés libérés?Le rôle est jo...
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Le rôle de l’Argininechez Plasmodium et AnophelesL-ArginineuréeOrnithine PolyaminesNOcitrullineArginine-phosphateDéfenses ...
ArgArg PROTEINECPBLe rôle des CPBdans l’interaction Plasmodium - Anopheles-ArgArgArg+++Arg
CPBAg1:une nouvelle cible pour un vaccinbloquant la transmission ?- 4 -
Immunogénicité de CPBAg1modèle : souris immunisées infectéespar Plasmodium berghei(Ig)21,510,5Concentration(mg/ml)G1 G2a G...
Effet de l’immunisation anti-CPBAg1sur le développement de P. bergheiSouris nonimmuniséesSourisimmunisées63 % de réduction...
Effet des anticorps anti-CPBAg1sur la fécondité des moustiquesAnticorps anti-CPBAg1 réduisent la fécondite des moustiquesL...
Conclusions1) CPBAg1 : 1ère CPB caractérisée chez An. gambiaeCPB: nouvelles cibles pour un vaccinanti-transmission de Plas...
Unité de Biologie etGénétique du PaludismeBertrand BoissonIsabelle ThieryRachida TaharSabine ThibergeCatherine BourgouinRo...
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Les carboxypeptidases B d’Anopheles gambiae impliquées dans le développement de Plasmodium falciparum - Conférence de la 6e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - LAVAZEC Catherine - France - clavazec@pasteur.fr

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Les carboxypeptidases B d’Anopheles gambiae impliquées dans le développement de Plasmodium falciparum

  1. 1. Les carboxypeptidases Bd’Anopheles gambiae impliquéesdans le développement dePlasmodium falciparumCatherine LavazecInstitut Pasteur ParisAtelier Paludisme 2008
  2. 2. www.msf.fr
  3. 3. Cycle biologique de Plasmodium
  4. 4. 14 heures : Formation des ookinètes24 heures :Pénétration des ookinètes48 heures : Initiation dudéveloppement des oocystesDéveloppement sporogonique de PlasmodiumD’après Riehle et al, 2003
  5. 5. Stratégies de blocage de la transmissionMoustiques transgéniques Vaccin bloquant la transmissionHommeMoustiquegamétocytesgamèteszygoteookinèteoocysteEpitheliumdigestifAnti-parasiteAnti-moustiqueShin et al, J. Exp. Biol., 2003
  6. 6. Intérêt d’un vaccin bloquant la transmissionbasé sur un antigène de moustique- Protéine recombinante plus facile à produire- Efficace sur différentes souches de parasites, résistantes ou non- Peut affecter la survie et la fécondité des moustiques
  7. 7. Sélection d’un gèned’Anopheles gambiaeimpliqué dans l’interactionavec Plasmodium falciparum- 1 -
  8. 8. Differential display1 : sang non parasité2 : sang + formes asexuées3 : sang + gamétocytes1 2 3Gene AGene BGene CGene DActineIdentification de gènes d’An. gambiaeRT-PCR semi-quantitativeBonnet et al, 2001
  9. 9. + argCPBS arg SCarboxypeptidase B (CPB)
  10. 10. 48,2 kDaCPBAg1(CarboxyPeptidase B Anopheles gambiae 1)423 aa35,9 kDaLavazec et al, Insect Mol. Biol., 2005
  11. 11. Protéine recombinante CPBAg110080604020Activité(%)00 0,1 100 1000 M10080604020Activité(%)00 0,1 10 1000 M1,10-Phenantroline GEMSA10,80,60,40,2HipArg HipLys HipPheActivité(unités/mg)0HipArg :Km = 2,6 mMkcat = 79,2 sec-1ACTIVITE CPBLavazec et al, Insect Mol. Biol., 2005
  12. 12. Les carboxypeptidases Bd’Anopheles gambiae- 2 -
  13. 13. 5 CPB5 CPA13séquencesFonction?5 CPB putatives chez An. gambiaeFamille de carboxypeptidasescpbAg1 VFMDGGIHAREWAGV--WRKNRSPGNVLCYGVDLNRNFP--YLAVHTYGEMIL--NSADILYTASGATDDYAYS-LGVPYSYTLELTGGGSQG--FDL--QTFELLKVFGQHAGTLSVTScpbAg2 VFVDAGIHAREWAAP--WRKTRRPAGRNCVGVDGNRNYD--YLSLHTYGQYLL--SSTNVLYAAAGGSDDYAYAVADVPISMTMELPGGGSQG--FNP--ETFVGVRAMALEVARNYS--cpbAg3 VFIDGGIHAREWAGV--WRKNRFPATILCTGIDLNRNWD--YLAVHTYGDMIL--NSAEILYTANGCSDDYVAGVIGARYAYTLELTGGGRNG--FDL--QTFQIYRTMANNA-------cpbAg4 IWMDGGIHAREWISP--WRKNRGGLQYGCAGVDLNRNYG--FLTFHSYGQYIL--PSGSTLYPAAGGSDDWARGALNIKYAYTVELRDTGRYG--FVL--EAVAFVDIIAQEV-------cpbAg5 VFIDGGIHAREWAGV--WRKNRSPGNVLCYGVDLNRNFP--YLAVHTYGEMIL--NSADILYTASGATDDYAYS-LGVPYSYTLELTGGGSQG--FDL--QT------------------cpaAg1 VFLEGGIHAREWISP--WRKTRKAYGPFCYGADPNRNWD--YIAFHSYSQLLL--NVYDAIYPASGSSVDWSYGAQDVKIAYTYELRPDGDAWNGFVL--ETLDSLITLLEESSARGYYDEKHcpaAg2 IFIEANIHAREWISS--WRKTRQPVNALCVGADPNRNFD--QFSFHSYGQYLL--NSASVLYTTSGSTVDYFVGVHGTKLGFTFEFRDTGAT--GFVL--ETLNGIIAFVAEAKTLGYV----cpaAg3 IFIESNIHAREWITS--WRKNRYPHNVLCYGVDMNRNFP--YLSFHSYGQYIL--TTADVLYIASGSSPDWAHGTHGTPVAATFEFRDNGYH--GFIL--EVLDGLVAFCRKGKELGHLTV--cpaAg4 IVVEGGIHAREWISP--WRKNRKPYG-LCRGVDLNRNFD--YIALHSYSQLLM--SKYETIYPSSGGSIDWAYRPGGVPVSLTFELRGPPDSTDMFIL--ETLAAFVAIVQEAARLGYYDS--cpaAg5 VFVVANMHAREWAAM--WRKNRAPQQDNALGVDLNRNFG--FVDLHTYGEYIL--TPPQLLYAVSGSSLDYCYSV-GVKACIAIEL---TGD--GFEI--EALAAVQAM--------------cp-like1 VLVDAGVHAREWASH--WRKNRFAGNVMCVGTDVNRNFP--YLSLHSCGEYIL--ASGLL-YLATGSD-DFIYGAYGVQYAYTLELSCGNR-GYGFII--ETFEMMKVFGVHAGSLKISKRPcp-like2 VFMEGTIHAREWISA--WRKTRSRQNVLCYGADPNRNWD--YLDFHASGQLLM--IAEII-YVASGSSLDWVKGTLQTPLTFAYELRDTG--EYGFLL--ETLDSVIVILEEGKAMGYHcp-like3 VFVECGIHAREWISP--WRKNMQPYGVCRGVDL-NRNFA--YFSVHSFSQLVM--MIETI-YPSSGDSVDWVYSALGVPVAYTFELRGPPDSTNMFVL--ELLAAFIAMLGEATRLSYYDGERQELcp-like4 IIVVANLHAREWAAT--WRKNR----NSPLGIDLNRNFG--YVDLHTFGETIL--PAERS-FKESGSSIDYCFSLNIKACIAV-EL-TAGSYELQNNT--AVLTMAVYANAGNSPLcp-like5 ILIDAGIHAREWITV--WRKTRRPLGPRHRRS--NRNFN--YLSLHSYAKAIL--ASTVLNRPVGGSSIDYAHDIEKVPVALVMEVASK-----GFHP--ESWIGIGAMVNCLASSFRSVLKGSGTLHLRZcp-like6 VFVVANMHAREWAAM--WRKNRAPQQDNATGVDLNRNFA--YVDLQTFGEYIL--GTLSD-LAHPVSGSSMDYCYFVG--cp-like7 VFVEAGAHGHEWIGP--WSKNRSNHTQAHPAG--NRNWA--YLSLQAYGQLLA--YALEPVTGPATYGTATGYARYGAGIRYSYTLRLPDRGTHGFLL--DTLELLcp-like8 IFVVANLNAREWAAM--WRKNRYPQTETEFGTDLNRNFD--YVDLQAYGEYLM--YLVGSAAELTKPAPGSSIDYCLSVGVKACIAMKL-TNRSYEIR--ALAAVQAMADKADEGcp-like9 IFVVANLNAREWAAM--WRKNRAPQTVIDFGTDLNRNFD--YVDLQAFGEYLM--YLVGSAAE-IMKEASGSSIDYCLSVGVKACIAMKL-TSQGYE--QQALAAVQAMAVKADGGcp-like10 VLVEAGLRAREWISP--WLKSRSVNGNGCFGVDLNRNFG--YPFSHSATTNPA--SIDFVAGTVQPDLVFTL------------ETGAGGN--YGYD--SETTYGFLTMAEYVANNKcp-like11 VILVANLHAREWAAM--WSKNRSPQPNSRTFGVDNGNFG--YADMHTFGNHIF--GTSAHLFERTYGSSLDYCHSVGINVCLWFEL-----TNVGFQI--EAWAAITAMAVRANQIVDVFYPEcp-like12 IFIESNIHAREWITS------cp-like13 IIVIGNLQAREWVGM--WNKNRSPQSNANFGV--NFNNQ--VDLQGFGQLILM--DVGIASDYFPFAYGVCHDYCNAIGVKTCLTLRQ-TMQEYEIS--AFVAIHAMAEKSNLSNIH RE R R H Y Y D E F
  14. 14. Expression des CPB chez An. gambiaecpbAg1 et cpbAg2 sont les seuls gènes de CPBexprimés dans le tube digestif des Anopheles femellescpbAg1cpbAg2cpbAg3cpbAg4cpbAg5ExpriméExpriméNon ExpriméNon ExpriméNon ExpriméADNgNG NI Pf H20
  15. 15. Expression en présence de P. falciparumSang non parasitéGamétocytesStades asexués14hRatiod’expression(%)300100500700900cpbAg130010050070090024h50030010070090048hcpbAg1 et cpbAg2 sont surexprimésspécifiquement en présence de gamétocytescpbAg214hRatiod’expression(%)24h 48h300100200300100200300100200Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
  16. 16. Activité CPB in vivoActivité CPB induitepar le repas de sangActivitéCPB(mU/TD)Activité CPB modifiéeen présence de gamétocytesde P. falciparum0 14h 24h 48h543210- Corrélation entre l’expression des gènes et l’activité CPB- Rôle dans le développement de Plasmodium falciparum?Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
  17. 17. Le rôle de l’activité CPB dans ledéveloppement de Plasmodium- 3 -
  18. 18. + aaCPBAnticorpsanti-CPBAg11S aa S2S + aa+ SubstratssynthétiquesCPB3 + Arg / LysActivité CPB :- limite le developpement du parasite?- facilite le developpement du parasite?
  19. 19. Infections de moustiques sur le terrainTechnique de gorgement sur membrane
  20. 20. + aaCPBAnticorpsanti-CPBAg11SS aa% Inhibition activité CPB14h PBM 54% +/- 924h PBM 36% +/- 848h PBM 33% +/- 11MLavazec et al, Infection and Immunity, 2007
  21. 21. + aaCPBAnticorpsanti-CPBAg11SS aaSérumpréimmunSérumanti-CPBAg1Moustiquesinfectés(%)10080604020095 % réduction de la prévalence d’infectionLavazec et al, Infection and Immunity, 2007
  22. 22. Anticorpsanti-CPBAg1activité CPB facilitele développementdu parasite?1Substrat clivé? Acides aminés libérés?Le rôle est joué par :+ aaCPBSS aa
  23. 23. Hip + aa+ Hip-Arg+ Hip-Lys2 Substratssynthétiques+ aaCPBSS aa5040302010T - 0,01 mM 0,1 mM 1 mMPrévalenced’infection(%)Hippuryl - ArgininePrévalenced’infection(%)5040302010T - 0,1 mM 1 mM 10 mMHippuryl - LysineL’activité CPB facilite le développement du parasite
  24. 24. aa+ aaCPBSS aa3 Acides aminés+ Arginine5040302010T - 0,1 mM 1 mM 10 mMPrévalenced’infection(%)L - Arginine60L’Arginine seraitimpliquée dans ledéveloppementparasitaire
  25. 25. Voies de synthèse de l’ArginineOrnithineGlutamateCitrullineArgininosuccinateArginineAnopheles gambiaePlasmodium falciparumProlinePyrroline-5-carboxylateApport exogène d’arginine indispensable pour Plasmodium
  26. 26. Le rôle de l’Argininechez Plasmodium et AnophelesL-ArginineuréeOrnithine PolyaminesNOcitrullineArginine-phosphateDéfenses immunitairesRéserves énergétiquesVitellogénèseMoustiqueADN polyméraseplasmodialeParasiteRégulationcycle cellulaireCompétition entre le moustique et le parasite?
  27. 27. ArgArg PROTEINECPBLe rôle des CPBdans l’interaction Plasmodium - Anopheles-ArgArgArg+++Arg
  28. 28. CPBAg1:une nouvelle cible pour un vaccinbloquant la transmission ?- 4 -
  29. 29. Immunogénicité de CPBAg1modèle : souris immunisées infectéespar Plasmodium berghei(Ig)21,510,5Concentration(mg/ml)G1 G2a G2b G3 M0Total Ig1/5001/10001/20001/40001/80001/160001/320001,510,50O.D.Anti-CPBAg1 IgGControl miceCPBAg1immunized mice- CPBAg1 induit une réponse spécifique-Isotypes G1 / G2b majoritaires- Anticorps reconnaissent specifiquementCPBAg1 dans des extraits de tube digestifsLavazec et al, Infection and Immunity, 2007
  30. 30. Effet de l’immunisation anti-CPBAg1sur le développement de P. bergheiSouris nonimmuniséesSourisimmunisées63 % de réduction dela prévalenced’infectionPrévalenced’infection(%)100806040200CPBAg1 peut induiredes anticorps bloquantla transmission chez lasourisLavazec et al, Infection and Immunity, 2007
  31. 31. Effet des anticorps anti-CPBAg1sur la fécondité des moustiquesAnticorps anti-CPBAg1 réduisent la fécondite des moustiquesLavazec et al, Infection and Immunity, 2007
  32. 32. Conclusions1) CPBAg1 : 1ère CPB caractérisée chez An. gambiaeCPB: nouvelles cibles pour un vaccinanti-transmission de Plasmodium2) Activité CPB dans le tube digestif : CPBAg1 et CPBAg23) En libérant de l’arginine, l’activité CPB facilite le développementde P.falciparum4) Anticorps anti-CPBAg1 inhibent le développement de Plasmodiumet réduisent la fécondité des anophèles
  33. 33. Unité de Biologie etGénétique du PaludismeBertrand BoissonIsabelle ThieryRachida TaharSabine ThibergeCatherine BourgouinRobert MénardPaludologie AfrotropicaleUnité 77, IRD, DakarChristian BoudinUnité d’immunologiemoléculaire des parasitesSarah BonnetPT5 - Production de protéinesrecombinantes et d’anticorpsStéphane PetresUnité d’immuno-physiopathologie infectieuseAlain CossonCEPIAFrancois LacosteFondations des TreillesCANAM, VIH/PAL

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