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Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthinetritiée dans l’ADN du parasite (Base purine: A-G)+Hypoxanthine-3HADN p...
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Disposition et concentration des molécules ennanomolaire (nM) dans la plaquevert = Témoin négatif (puits sans médicaments)...
Résultats du comptage de radioactivité pourun test de chimiosensibilité in vitro de P. falciparumvert = Témoin négatif (pu...
18Test de chimiosensibilité in vitroMise en culturedes parasitesviablesMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001Colorimé...
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Mise en culture des parasites. Plaque prémédicamentée. Lavage 3x avec RPMI-1640. RPSH 10% sans hypoxanthine tritiée. Paras...
Méthode isotopique Méthode avec Sybr GreenPlaque prémédicamentée Plaque prémédicamentéeSuspension parasitaire + hypox-3HIn...
Fluorimètre
Table 1: Comparison of the isotopic and SYBR Green I measurements for clinical isolates of P. falciparum tested against fo...
Correlation between individual IC50s (in nM) for chloroquinedetermined by the SYBR Green I and the isostopic assays(n=541;...
Avantages et Inconvénients_________________________________________________Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green. Rad...
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Tests in vitro pour évaluer la sensibilité de P. falciparum aux drogues - Conférence de la 7e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - RASON Marie-ange - Madagascar - mieange@pateur.mg

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Tests in vitro pour évaluer la sensibilité de P. falciparum aux drogues

  1. 1. Tests in vitro pour évaluer la sensibilitéde P. falciparum aux droguesparMarie-Ange Rason, MD7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”08 Avril 2009 – Institut Pasteur de Madagascar
  2. 2. …, il est impératif de surveiller lasensibilité/résistance de Plasmodium sp auxantipaludiques, notamment dans les paysd’endémie.
  3. 3. Test in vivo(traitement et suivi)Echantillonde sangTests in vitroEvaluation de la sensibilité deP. falciparum aux antipaludiquesTest dechimiosensibilitéGénotypage(marqueurs derésistance)
  4. 4. 4Test de chimiosensibilité in vitroMise en culturedes parasitesviablesMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001Colorimétrique (pLDH, HRPII)Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3575-3577Isotopique (hypoxanthine tritiée)Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51Cytométrie en fluxPattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810M.A. Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351
  5. 5. 5Tests de chimiosensibilité in vitroMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001Colorimétrique (pLDH, HRPII)Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64Isotopique (hypoxanthinetritiée)Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51Cytométrie en fluxPattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91Microfluorimetrique (PicoGreen,Sybergreen)Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
  6. 6. Cycle biologique des plasmodies infectantl’homme
  7. 7. Cycle biologique des plasmodies infectantl’homme
  8. 8. Contraintes logistique et technique (communes)• isolats (souches de parasites provenant des malades)• Équipements de laboratoire• Personnel compétent• Bonnes pratiques de laboratoire• Clones de référence de P. falciparum (3D7, FCM29, D6…)
  9. 9. Procédure:Randrianarivelojosia et al, 2002Le Bras & Deloron, 1983Plasmodium falciparum (synchronisé) Préparation de la suspension parasitaire dans du RPSH10%(200µl par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% deparasitémie; 1,5% d’hématocrite; hypoxanthine tritiée 0,4µCi/puits) Incubation 42h à 37°C (atmosphère microaérophile ethumide) Evaluation de la radioactivité incorporée et calcul desCI50Conduite du test isotopique in vitro
  10. 10. Plaques de cultureà 96 puits, à fond plat,pré médicamentéesExemple de drogues :ChloroquineMonodesethyl-AQQuinineDihydro-artémisinineMéfloquineConduite du test isotopique in vitro
  11. 11. Modular Incubator ChamberBillups-rothenberg
  12. 12. Mise en cultureIncubation pendant 42h à37°C; atmosphère humide;en microaérophilieCongélationDécongélation des plaquesde cultureConduite du test isotopique in vitro
  13. 13. Salle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verre
  14. 14. Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthinetritiée dans l’ADN du parasite (Base purine: A-G)+Hypoxanthine-3HADN plasmodial(début du test)ADN marquéau tritium
  15. 15. Compteur à scintillation liquide piloté par ordinateur. Comptage de la radioactivité encoups/mn(cpm) à l ’aide du Microbeta. Calcul des CI50 (concentrationinhibitrice 50%) en nanomolaire (nM). Seuil resistance: chloroquine (100 nM),monodesethylamodiaquine (60 nM) ,quinine (800 nM).
  16. 16. Disposition et concentration des molécules ennanomolaire (nM) dans la plaquevert = Témoin négatif (puits sans médicaments)FaibleconcentrationForteconcentration1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 12,5 12,5 2,5 2,5 25 25 0,25 0,25B 25 25 25 5 5 5 50 50 50 0,5 0,5 0,5C 50 50 50 10 10 10 100 100 100 1,25 1,25 1,25D 100 100 100 20 20 20 200 200 200 2,5 2,5 2,5E 200 200 200 40 40 40 400 400 400 5 5 5F 400 400 400 80 80 80 800 800 800 10 10 10G 800 800 160 160 1600 1600 20 20H 1600 1600 320 320 3200 3200 40 40CQ MAQ Q DHATDD01
  17. 17. Résultats du comptage de radioactivité pourun test de chimiosensibilité in vitro de P. falciparumvert = Témoin négatif (puits sans médicaments)FaibleconcentrationForteconcentration1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 13819 13626 14042 13988 14141 14103 12061 12252 14425 11577 11489 14374B 13276 12774 14926 15296 15550 14952 8243 7737 7353 8487 6670 8765C 6373 5763 5547 12805 13048 12214 4816 5046 4912 1125 845 1106D 859 1015 1112 880 914 1062 2916 2381 2746 700 479 672E 549 593 549 417 392 444 1104 1250 1333 529 555 520F 553 478 477 496 390 402 496 592 643 583 457 1015G 567 485 13177 820 638 13372 746 766 12513 12014 466 1077H 521 587 11900 783 635 11898 782 1210 11944 11444 700 495CQ MAQ Q DHATDD01 TDD01 TDD01 TDD01
  18. 18. 18Test de chimiosensibilité in vitroMise en culturedes parasitesviablesMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001Colorimétrique (pLDH, HRPII)Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3575-3577Isotopique (hypoxanthine tritiée)Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51Cytométrie en fluxPattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351
  19. 19. SYBR Green I is a DNA- intercaling dye that prefers G and C base pairs.formule chimique: C32H37N4S - cyanines asymétriques (fluorophores)Excitation is at 488nm and emission at 510 to 550
  20. 20. Mise en culture des parasites. Plaque prémédicamentée. Lavage 3x avec RPMI-1640. RPSH 10% sans hypoxanthine tritiée. Parasitémie à 0.5%, hématocrite à 1,5%. Incubation 72 h à 37°C, atmosphère microaérophile et humide. Congélation plaquelecture:. Décongeler les plaques pendant 2 H au moins à température ambiante(RT). Transférer 100 µL de la suspension parasitaire dans une plaque vierge. Préparer mix: 0,2µL/ml de Sybr Green avec tampon lyse MSF (MalariaSybr Green fluorescence). Ajouter 100µL/puits de ce mix dans la suspension parasitaire. Incuber 30 mn à RT, à l’abri de la lumière. Lecture 485/535 nanomètre au fluorimètreMéthode avec Sybr Green (fluorophore)______________________________________________
  21. 21. Méthode isotopique Méthode avec Sybr GreenPlaque prémédicamentée Plaque prémédicamentéeSuspension parasitaire + hypox-3HIncubation culture (72H)Incubation culture (42H)Suspension parasitaireTransfert sur filtreSéchage filtreRajout liquide scintillantscelléCompteur à scintillation liquideTransfert 100µL+ rajout Tp Lyse MSFavec Sybr GreenIncubation 30mnLecture / Fluorimètre
  22. 22. Fluorimètre
  23. 23. Table 1: Comparison of the isotopic and SYBR Green I measurements for clinical isolates of P. falciparum tested against four drugs______________________________________________________________________________________________________________Drug tested No. isolates Geometric mean (nM) [95%CI] P-valuea αcbtested ___________________________________Isotopic assay [3H]- SYBR Green Ihypoxanthine_________________________________________________________________________________________________50% inhibitory concentrationChloroquine 138 20.2 [16.5-27.7] 22.3 [18.7-26.7] 0.46 0.93Monodesethylamodiaquine 138 7.6 [6.6-8.8] 7.2 [6.3-8.3] 0.61 0.92Quinine 135 48.7 [40.6-58.4] 52.3 [44.7-61.3] 0.56 0.90Dihydroartemisinine 130 0.80[0.65-0.97] 0.80[0.65-0.96] 0.99 0.8190% inhibitory concentrationChloroquine 138 116.6[98.0-138.8] 119.4[102.3-139.5] 0.84 0.68Monodesethylamodiaquine 138 32.9[28.8-37.7] 35.5[30.8-40.8] 0.45 0.73Quinine 135 342.1[296.7-394.4] 335.8[287.7-391.9] 0.86 0.72Dihydroartemisinine 130 4.4[3.8-5.1] 4.6[3.95-5.46] 0.66 0.58____________________________________________________________________________________________________________a Significances by Mann-Whitney U tests are given for the difference in inhibitory concentrations measured with the two assays.b Concordance coefficient correlation.
  24. 24. Correlation between individual IC50s (in nM) for chloroquinedetermined by the SYBR Green I and the isostopic assays(n=541; r = 0.93, CI95% 0.92-0.94) P< 0.00010,01 0,1 1 10 100 100010001001010,10,01Log IC50 SYBR Green ILogIC50isotopic
  25. 25. Avantages et Inconvénients_________________________________________________Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green. Radioélément . Fluorophore. Référence . Simple. Radioprotection . Rapide. Personne compétente . très sensible. Compteur à scintillation . Fluorimètre. Incubation 42H . Incubation 72H. Résultats en cpm . RFU(Relative Fluorescence Units). 50$ par plaque 96 puits . 0,88$ par plaque 96puits
  26. 26. Conclusion avec méthode Sybr GreenPréférable d’utiliser cette méthode avec: signal coûtSon utilité dans le test de chimiosensibilité: idéal pour un screening avec un grand nombred’échantillons approprié pour comparer avec un autre méthode faisable sur le terrain
  27. 27. Tests in vitro pour évaluer la sensibilitéde P. falciparum aux droguesparMarie-Ange Rason, MD7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”08 Avril 2009 – Institut Pasteur de Madagascar

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