Pourquoi un diagnosticdu paludisme ? Bénéfice pour le malade Bénéfice pour la communauté Adaptation du traitement Maîtrise...
Comment ?Diagnostic de présomptionDiagnostic direct  Microscopie  QBC  Test rapide ou «dipstick»  PCRDiagnostic indirect o...
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2. Diagnostic direct Se fait à partir du sang  Quand effectuer le prélèvement ?  Combien de prélèvements ?  Procédure et p...
2. Diagnostic direct1 Mise en évidence du parasite :      Microscopie      Quantitative Buffy Coat (QBC)      Cytométrie d...
2.1.a Microscopie  La goutte épaisse et le frottis    Réalisation pratique  La coloration    Giemsa    Autres colorations ...
2.1.a Microscopie       La lecture au microscope              Sensibilité de la méthode et              expression de la d...
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2.1.a   Microscopie   La lecture au microscope    Les espèces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm    Distribution hétérogène    Di...
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2.1.a Microscopie   Inconvénients    Délai    Personnel expérimenté    Equipement    Problème des infections mixtes
2.1.b QBCPrincipeSang au bout du doigtTube capillaire+Acridine OCentrifugationLecture microscope UV FLUORESCENCESensibilit...
2.1.b QBC                      P vivax      P falciparumP falciparum   P vivax+ granulocytes   Pf gametocyte
2.1.b QBC Avantages Rapidité Bonne sensibilité Inconvénients Toxicité de l’acridine, coût élevé Equipements Personnel expé...
2.1.c CytométrieMarquage des cellules avec un colorantfluorescent : Hoechst ou thiazole orangeTri des cellules en fonction...
2.2.a Test Rapid «Dipstick» Principe : Détection d’antigènes parasitaires par immunochromatographie   Récolte du sang au b...
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
2.2.a Test Rapid «Dipstick»Quels antigènes ?  HRPII      P.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck)      Trophozoites et jeu...
2.2.a Test Rapid «Dipstick»  Sensibilité     >95% (comparé à la microscopie    100%)     100 % pour Pf pour des densités >...
2.2.a Test Rapid «Dipstick»  Spécificité    Autour de 90%    Faux positifs (HRPII essentiellement)
2.2.a Test Rapid «Dipstick»  Avantages    Rapide : 5 min.    Peut être réalisé sans expérience    Bonne sensibilité et bon...
2.2.a Test Rapid «Dipstick»  Inconvénients   Coût : 1-2 USD.   Pas quantitatif   Ne distingue pas Pv des autres espèces   ...
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2.2.b RIA et ELISA Principe : Détection d’antigènes para- sitaires      Utilisation d’anticorps monoclonaux      Technique...
2.3 Diagnostic Moléculaire   Principe     ADN du parasite     PCR et /ou hybridation     Choix de séquences cibles avec   ...
2.3.a Diagnostic Moléculaire         DIAGNOSTIC PAR PCR               SSUrRNA genes                  PRIMAIRE             ...
2.3.a Diagnostic Moléculaire  1. Amplification spécifique de genre      1    2     3   4     5    6                Pf   Pv...
2.3.a Diagnostic Moléculaire  2. Amplifications spécifiques d’espèce                 V M F O
2.3.a Diagnostic Moléculaire  Avantages   Petit prélèvement : «blood spot»   ADN utilisable pour génotypage, clonage …   C...
2.3.a Diagnostic Moléculaire  Inconvénients    Temps nécessaire pour l’analyse    Coût    Equipement    Bonne technicité (...
2.3.b Sondes Moléculaires   Principe     Extraction ADN     «Spotting »     Dénaturation / neutralisation     Hybridation ...
Comparaison des méthodes                         Parasites                  Ag parasitaires        ADNMéthodes            ...
3. Diagnostic sérologique  Principe :  Recherche d’anticorps spécifiques  Détection du complexe ag/ac par    1 . Immunoflu...
3.1 IF indirecte  Parasites fixés à l’airou à l’acétone  Dilutions du sérum   Anti-anticorpsfluorescent   Mesure de l’exti...
3.2    ELISA  Ag parasitaire brut, ou fraction purifiée,ou peptide synthétique  Dilutions du sérum  Anti-anticorps marqué ...
3. 3 ELISA             Exemple d’inhibition             de la réactivité             d’anticorps             spécifiques  ...
3. 3 RIA  Comparable aux autres tests dans laconception :   Gamme de dilutions des sérums   Anti-anticorps marqué avec iso...
3.3 Dipsticks pour sérologie   Format « dipstick »    Détection qualitative des Ac spécifiques  dans le sang, plasma ou sé...
3.4 Utilité de la sérologie ?   Pas d’intérêt pour le diagnostic  sauf :   Criblage des donneurs de sang   Complément d’in...
PISTES DE RECHERCHEAméliorations possibles  Tests rapides   Lecture quantitative   Caractérisation des espèces   Améliorer...
PISTES DE RECHERCHEAméliorations possibles  PCR   Standardiser la méthode   Développer un kit PCR de diagnostic   Automati...
PISTES DE RECHERCHERecherche  Tests rapides   Etudier la persistances des antigènes  HRPII et pLDH après le traitement.   ...
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Pourquoi un diagnostic du paludisme ?

  1. 1. Pourquoi un diagnosticdu paludisme ? Bénéfice pour le malade Bénéfice pour la communauté Adaptation du traitement Maîtrise des résistances
  2. 2. Comment ?Diagnostic de présomptionDiagnostic direct Microscopie QBC Test rapide ou «dipstick» PCRDiagnostic indirect ou sérologique
  3. 3. 1 . Diagnostic présomptif Circonstances Eléments d’orientation Epidémiologiques Cliniques Biologiques Avantages Inconvénients
  4. 4. 2. Diagnostic direct Se fait à partir du sang Quand effectuer le prélèvement ? Combien de prélèvements ? Procédure et précautions Au moment du prélèvement : gants, matériel jetable, etc. Transport des prélèvements Traitement au laboratoire
  5. 5. 2. Diagnostic direct1 Mise en évidence du parasite : Microscopie Quantitative Buffy Coat (QBC) Cytométrie de flux2 Mise en évidence d’ag parasitaire Test rapide sur bandelette (dipstick) ELISA, RIA3 Mise en évidence d’ADN parasitaire PCR Sondes nucléiques
  6. 6. 2.1.a Microscopie La goutte épaisse et le frottis Réalisation pratique La coloration Giemsa Autres colorations Points techniques importants
  7. 7. 2.1.a Microscopie La lecture au microscope Sensibilité de la méthode et expression de la densité parasitaire Pour 100 champs de microscope soit 10 min. de lecture nb de GR nb de GB volume examiné sensibilité Frottis 5x 10 4 60 0,01 µl 100-200 para /µlGoutte épaisse 1x 10 6 1200 0,2 µl 10-20 para /µl1 µl de sang il y a environ 5 000 000 de GR et 6000 GB
  8. 8. 2.1.a MicroscopieLa lecture au microscope Les formes parasitaires
  9. 9. 2.1.a Microscopie La lecture au microscope Les espèces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm Distribution hétérogène Diagnostic d’espèce sur la base de critères morphologiques
  10. 10. 2.1.a Microscopie Avantages Faible coût Morphologie (stades, espèces) Bonne sensibilité Quantitatif Lecture rétrospective
  11. 11. 2.1.a Microscopie Inconvénients Délai Personnel expérimenté Equipement Problème des infections mixtes
  12. 12. 2.1.b QBCPrincipeSang au bout du doigtTube capillaire+Acridine OCentrifugationLecture microscope UV FLUORESCENCESensibilitéVolume examiné : 60 µl vs 0.2 µl GESensibilité 1 para/µl
  13. 13. 2.1.b QBC P vivax P falciparumP falciparum P vivax+ granulocytes Pf gametocyte
  14. 14. 2.1.b QBC Avantages Rapidité Bonne sensibilité Inconvénients Toxicité de l’acridine, coût élevé Equipements Personnel expérimenté Pas approprié au terrain Pas quantitatif, espèces ?
  15. 15. 2.1.c CytométrieMarquage des cellules avec un colorantfluorescent : Hoechst ou thiazole orangeTri des cellules en fonction de lafluorescence et de la tailleEvaluation de la parasitémie. Très bonnesensibilité mais bruit de fond important dûaux réticulocytesUtilisée couplée avec immunofluorescencede surface pour analyse phénotypique GRP
  16. 16. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Principe : Détection d’antigènes parasitaires par immunochromatographie Récolte du sang au bout du doigt Lyse du sang Migration des antigènes libérés Détection avec un ou plusieurs Acmx marqués
  17. 17. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»
  18. 18. 2.2.a Test Rapid «Dipstick»Quels antigènes ? HRPII P.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck) Trophozoites et jeunes gamétocytes Fonction de détoxification de l’hème ? pLDH Antigène non spécifique (OptiMal) Tous les stades Autres utilisations Alternative aux méthodes isotopiques
  19. 19. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Sensibilité >95% (comparé à la microscopie 100%) 100 % pour Pf pour des densités >300 p/µl Sensibilité moindre pour Pv (autres espèces ?)
  20. 20. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Spécificité Autour de 90% Faux positifs (HRPII essentiellement)
  21. 21. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Avantages Rapide : 5 min. Peut être réalisé sans expérience Bonne sensibilité et bonne spécificité Ne nécessite pas d’équipements spécifiques Adapté au terrain
  22. 22. 2.2.a Test Rapid «Dipstick» Inconvénients Coût : 1-2 USD. Pas quantitatif Ne distingue pas Pv des autres espèces Stabilité des réactifs sur le terrain ? Nombre important de faux positifs Ne donne pas d’indication sur la viabilité des parasites
  23. 23. 2.2.a Test Rapid«Dipstick»
  24. 24. 2.2.b RIA et ELISA Principe : Détection d’antigènes para- sitaires Utilisation d’anticorps monoclonaux Technique en « sandwich » Pas d’intérêt réel pour le diagnostic Utilisables pour la détection de sporozoites chez les vecteurs
  25. 25. 2.3 Diagnostic Moléculaire Principe ADN du parasite PCR et /ou hybridation Choix de séquences cibles avec régions polymorphes et conservées Analyse
  26. 26. 2.3.a Diagnostic Moléculaire DIAGNOSTIC PAR PCR SSUrRNA genes PRIMAIRE SECONDAIRES Spécifiques 1 de genre P. sp P . falciparum 2 P. vivax Spécifiques P. malariae d’espèces P. ovale
  27. 27. 2.3.a Diagnostic Moléculaire 1. Amplification spécifique de genre 1 2 3 4 5 6 Pf Pv Po PM Pri Sec
  28. 28. 2.3.a Diagnostic Moléculaire 2. Amplifications spécifiques d’espèce V M F O
  29. 29. 2.3.a Diagnostic Moléculaire Avantages Petit prélèvement : «blood spot» ADN utilisable pour génotypage, clonage … Caractérisation fine par séquençage Bonne sensibilité : 1-3 parasites par µl Bonne spécificité : proche de 100 % Détection de formes parasitaires atypiques Etudes rétrospectives Partiellement automatisable Semi-quantitatif
  30. 30. 2.3.a Diagnostic Moléculaire Inconvénients Temps nécessaire pour l’analyse Coût Equipement Bonne technicité (contaminations)
  31. 31. 2.3.b Sondes Moléculaires Principe Extraction ADN «Spotting » Dénaturation / neutralisation Hybridation avec des sondes marquées Lecture Commentaires Séquences répétées SSurRNA, rep 20 ou Tel Quantités importantes d’ADN
  32. 32. Comparaison des méthodes Parasites Ag parasitaires ADNMéthodes Microscopie QBC HRPII pLDH PCRExpertise +++ ++ - - ++++Equipement + +++ - - ++++Temps ++ + - - ++++Diagnostic despèce +++ + Pf Pf /non Pf ++++Adaptation terrain + - ++++ ++++ -Enquêtes +++ - - - ++++Quantification ++++ + - - ++Sensibilité +++ +++ ++ ++ ++++Spécificité +++ + + ++ ++++Standardisation Meth +++ ++ ++ ++ +Coût (USD) 0,05 2,0-4,0 2 2 2 Points forts Points faibles Intermédiaire
  33. 33. 3. Diagnostic sérologique Principe : Recherche d’anticorps spécifiques Détection du complexe ag/ac par 1 . Immunofluorescence indirecte 2 . Elisa 3 . Radioimmunoanalyse 4 . Test sérologique sur bandelette
  34. 34. 3.1 IF indirecte Parasites fixés à l’airou à l’acétone Dilutions du sérum Anti-anticorpsfluorescent Mesure de l’extinctionde la fluorescence :titre en Ac spécifiques
  35. 35. 3.2 ELISA Ag parasitaire brut, ou fraction purifiée,ou peptide synthétique Dilutions du sérum Anti-anticorps marqué par un enzyme Révélation de l’activité enzymatique Mesure des DO Titre en anticorps spécifiques par rapport à un seuil.
  36. 36. 3. 3 ELISA Exemple d’inhibition de la réactivité d’anticorps spécifiques Anti-CSP par le peptide synthétique homologue Pf et par le peptide hétérologue Pm correspondant
  37. 37. 3. 3 RIA Comparable aux autres tests dans laconception : Gamme de dilutions des sérums Anti-anticorps marqué avec isotope * Mesure des cpm Titre en Ac spécifiques par rapport à un seuil
  38. 38. 3.3 Dipsticks pour sérologie Format « dipstick » Détection qualitative des Ac spécifiques dans le sang, plasma ou sérum. Spécifique pour Pv et Pf Sensibilisation du support avec les Ag CSP et MSP1 Enquêtes épidémiologiques
  39. 39. 3.4 Utilité de la sérologie ? Pas d’intérêt pour le diagnostic sauf : Criblage des donneurs de sang Complément d’information chez un patient suspecté de paludisme mais avec gouttes épaisses négatives Diagnostic d’espèce rétrospectif
  40. 40. PISTES DE RECHERCHEAméliorations possibles Tests rapides Lecture quantitative Caractérisation des espèces Améliorer la sensibilité et la spécificité Instaurer un contrôle qualité Développer une banque de réactifs pour tester la qualité des « dispticks » Combiner sur la même bandelette un diagnostic paludisme et Dengue
  41. 41. PISTES DE RECHERCHEAméliorations possibles PCR Standardiser la méthode Développer un kit PCR de diagnostic Automatiser la méthode pour des études à grande échelle
  42. 42. PISTES DE RECHERCHERecherche Tests rapides Etudier la persistances des antigènes HRPII et pLDH après le traitement. Etudier le polymorphisme HRPII et pLDH chez des parasites sauvages. Développer d’autres systèmes antigéniques pour la détection spécifique des stades asexués et sexués
  43. 43. PISTES DE RECHERCHERecherche Tests rapides Evaluer la possibilité de mise au point d’un test rapide pour déterminer la sensibilité d’un isolats à un médicament Etudier la durée de validité des « dipsticks » dans les conditions du terrain

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