Résistance et réponse    thérapeutique      Jacques Le BrasCentre National de RéférenceChimiosensibilité du Paludisme     ...
Classification des antimalariques selon          leur point d’impact                 GAMETOCYTOCIDES : Formes             ...
Des médicaments efficaces,        sans danger, de faible coût= la chloroquine et les antifoliniques (proguanil et   pyrimé...
Chimiorésistance : définition • Capacité d’une souche d ’agent pathogène à se multiplier ou à survivre en présence de conc...
Pourquoi le paludisme (à falciparum)          est chimiorésistant ?• Production de la chimio-resistance : mutation(s),• Us...
Particularités du génome de           Plasmodium falciparum- Forte divergence du génome nucléaire : utilisation deA/T dans...
Utilisation des antipaludiques                      Quinine Injection                  ?      (2 millions)                ...
Le profil pharmacocinétique individueld ’un médicament contribue à la sélection        des parasites résistantsCI90       ...
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Accumulation de CQ, inhibition de la digestion de l’hémoglobine plasmapH 7,4 CQ = 1                                       ...
Voies des Pyrimidines des Plasmodium                humains      atovaquone           CO2 + aspartate           dihydrooro...
P. falciparum  Di Hydro Folate Reductase                        Ser108AsnAla16Val            Ile164Leu Cys59Arg           ...
Mutations de la DHFR de P. falciparum,performances de l’enzyme et résistances  Mutation              Cinétique      Kinhib...
Fitness (potentiel reproducteur)• Utiliser des antipaludiques qui forcentPlasmodium à accumuler 2 mutations ouplus pour su...
Mortalité du paludisme & chloroquino-                     résistance                  Taux de mortalité attribuable au pal...
Spread of chloroquine     resistance                        16
Nécessité de la surveillance de la           résistance Surveiller quoi ?(résistances cliniques, de souche, génétiques) Su...
CHIMIOSENSIBILITE      Tests in vivo        DosagesTests de culture in vitro  Tests in silico (PCR)                       ...
Tests in vivo OMS 01 : interprétationEchec thérapeutique précoce (ETP) : apparition dunpaludisme grave à J1, 2 ou 3 + para...
Efficacité de la chloroquine en fonction         de l ’âge à Madagascar               10 mg/kg en une dose          60    ...
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marqueurs génétiques opérationnels de la      résistance de P. falciparumpyriméthamine : Ser -> Asn au codon 108 de la DHF...
Proportions de mutants pyriméthamine-R etchloroquine-R à Dielmo, Sénégal, 1990 - 1999       70       60        %S108N (pyr...
Diversité génétique des        populations de P. falciparum• Les hôtes hébergent souvent plusieurs  génotypes plasmodiaux•...
Evaluation de la polyclonalité de  P.falciparum au cours du traitement de          voyageurs par la quinine• sans bénéfice...
Problématique1- Pouvoir comparer l’isolat avant et après  traitement2- Pouvoir détecter et quantifier un clone  résistant ...
Patients- 21 adultes    fébriles,   P.f au retour de pays  endémique,- protocole IMEA, agréé CCPPRB,- hospitalisation cour...
À chaque prélèvement,• Frottis et goutte épaisse,• Extraction de l’ADN à partir de 100 µl de  culot,• Amplification msp-2 ...
Analyse quantitative de fragments d ’ADN :                  electrophorégrammes       Ratio du mélange de parasites PfHB3+...
Réponse thérapeutique à la quinine :                                    infection à 1 clone                               ...
Réponse thérapeutique à la quinine :                                                                             infection...
Quantification des fragments MSP2 soustraitement à la quinine : infection ≥ 6 clones                                      ...
Conclusion 1• Le mono-parasitisme est l’exception,• linoculation de souches S et R est fréquente,• impossible d’exclure la...
Où est le paludisme (à falciparum)           chimiorésistant ?• Dans toute l’Afrique tropicale :    différences significat...
Stratégies        • Vieux méicaments             – Rotation ?             – Association ?        • nouveaux             – ...
Antimalariques disponibles face à la résistance• sulfadoxine -pyriméthamine (Fansidar®)             1• amodiaquine (Camoqu...
L’Afrique après la                                                                     H2N             O O     N          ...
Amodiaquine-artésunatevs. Amodiaquine chez 941 enfants en Afrique   % guérison   Amodiaquine* Amodiaquine*    ∆     p     ...
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Atovaquone-proguanil (A-P) taux de      guérison à J28 ou J35      Pays        A-P         comparateur        PGabon      ...
artémisinine             (=O) → dihydroartémisinine (-OH)      → artémether (-OCH3) → artésunate (-O-succinyl)• Sesquiterp...
luméfantrine• Benflumétol (1993). Pas absorbée chez le sujet à jeun  (t1/2 72-120h). La débutyl-luméfantrine, 5 à 8 fois p...
Chimio-prophylaxie des groupes à risque                                  Cnrcp   44
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Résistance et réponse thérapeutique - Conférence de la 1ère édition du Cours international « Atelier Paludisme » - LE BRAS Jacques

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Résistance et réponse thérapeutique

  1. 1. Résistance et réponse thérapeutique Jacques Le BrasCentre National de RéférenceChimiosensibilité du Paludisme Cnrcp
  2. 2. Classification des antimalariques selon leur point d’impact GAMETOCYTOCIDES : Formes sexuées et formes hépatiques SCHIZONTICIDES : Formes endoérythrocytaires asexuées - lysosomotropes - antimétabolites - inhibiteurs de la respiration parasitaire - antibiotiques Cnrcp 2
  3. 3. Des médicaments efficaces, sans danger, de faible coût= la chloroquine et les antifoliniques (proguanil et pyriméthamine) ... jusqu’à ce que la résistance de P. falciparum se soit généralisée dans les années 80 ;• seules alternatives accessibles en 2003 pour le traitement des résistances : pyriméthamine- sulfadoxine, amodiaquine, artémisinine ;• urgence : évaluer de nouveaux antipaludiques. Cnrcp 3
  4. 4. Chimiorésistance : définition • Capacité d’une souche d ’agent pathogène à se multiplier ou à survivre en présence de concentrations d’un médicament qui détruit normalement les parasites de la même espèce ou prévient leur multiplication.• Résistance de P falciparum aux antipaludiques : toute fièvre après 72h de traitement avec une persistance de la même souche de P. falciparum que la souche initiale. Cnrcp 4
  5. 5. Pourquoi le paludisme (à falciparum) est chimiorésistant ?• Production de la chimio-resistance : mutation(s),• Usage massif des antipaludiques : 2 x 109 cp de chloroquine en 1978 en Afrique,• Le profil pharmacocinétique individuel d ’un médicament contribue à la sélection des parasites résistants (MQ > QU) Cnrcp 5
  6. 6. Particularités du génome de Plasmodium falciparum- Forte divergence du génome nucléaire : utilisation deA/T dans les codons : 82% (P. vivax : 67%).- Génome mitochondrial conservé : 90% d ’identitéentre les espèces plasmodiales.- Eucaryote à cycle haploïde mais méiose normale (laprogénie est distribuée selon Hardy-Weinberg ).- Polymorphisme de séquences répétées. Cnrcp 6
  7. 7. Utilisation des antipaludiques Quinine Injection ? (2 millions) Sulfadoxine - Pyrimethamine ? (18 millions) Chloroquine (134 millions)auto-traitement Centres de santé 7
  8. 8. Le profil pharmacocinétique individueld ’un médicament contribue à la sélection des parasites résistantsCI90 [quinine] [méfloquine] CI10 1 2 3----7 14 21 jours Cnrcp 8
  9. 9. Résistance aux médicaments dans le paludisme• Deux mécanismes de base de résistance ont étédécrits chez P. falciparum : l’altération de l’affinité de liaison des enzymes du parasite (pyriméthamine). le transport altéré du médicament (chloroquine), Cnrcp 9
  10. 10. Accumulation de CQ, inhibition de la digestion de l’hémoglobine plasmapH 7,4 CQ = 1 cytosol noyau érythrocytaire pH 6,8 76t Pfcrt k76 CQ + CQH+ = 5 vacuole pH 7,2 Cnrcp digestive CQ CQ + CQH+ = 20 pH 5,2 CQ cytoplasme CQ + CQH+ = 600 parasitaire Pfcrt muté détermine la CQ-R 10
  11. 11. Voies des Pyrimidines des Plasmodium humains atovaquone CO2 + aspartate dihydroorotate ubiquinone H2 cytochrome 1/2 O2 DHOD orotate ubiquinone cytochrome H2 H2O UDP dUTP GTP dUDP dTMP ADN pteridine dUMP TS pABA DHPS dihydropteroate DHF N5,N10-CH3THF sulfadoxine THF DHFRpyriméthamine, cycloguanil Cnrcp 11
  12. 12. P. falciparum Di Hydro Folate Reductase Ser108AsnAla16Val Ile164Leu Cys59Arg Asn51Ile Cnrcp 12
  13. 13. Mutations de la DHFR de P. falciparum,performances de l’enzyme et résistances Mutation Cinétique Kinhib (nM) (Kcat/Km) pyrim. cyclog. sauvage 6,8 1,5 2,6 S108N 3,7 13 15 S108N + C59R 0,18 72 82 S108N + C59R + I164L 0,17 383 1141 Sirawaraporn, 1997 13
  14. 14. Fitness (potentiel reproducteur)• Utiliser des antipaludiques qui forcentPlasmodium à accumuler 2 mutations ouplus pour survivre pourrait restreindre ledéveloppement de la résistance.• L’idée d’accumulation progressive demutations de résistance correspond à cequ’on observe in vitro mais sa réalité et sonintérêt clinique restent à confirmer. Cnrcp 14
  15. 15. Mortalité du paludisme & chloroquino- résistance Taux de mortalité attribuable au paludisme à Mlomp, Sénégal (Trape et al., 1998) 6Mortalité du 0-4 anspaludisme (pour 4mille par an) 2 5-9 ans 0 1985-89 1990-92 1993-95 L’émergence de la chloroquino-R dans une zone sous chimio-prophylaxie de masse a un impact démontré sur la mortalité attribuable au paludisme Cnrcp 15
  16. 16. Spread of chloroquine resistance 16
  17. 17. Nécessité de la surveillance de la résistance Surveiller quoi ?(résistances cliniques, de souche, génétiques) Surveiller où ?(Pays, région, ville, quartier)Surveiller qui ?(malades ou porteurs, résidents ou voyageurs)Surveiller quand ?(périodicité) Cnrcp 17
  18. 18. CHIMIOSENSIBILITE Tests in vivo DosagesTests de culture in vitro Tests in silico (PCR) Cnrcp 18
  19. 19. Tests in vivo OMS 01 : interprétationEchec thérapeutique précoce (ETP) : apparition dunpaludisme grave à J1, 2 ou 3 + parasitémie ;fièvre à J2 avec une parasitémie > à J0 ;fièvre à J3 + parasitémie ;parasitémie J3 = ou > 25% de J0.Echec thérapeutique tardif (ETT) : paludisme grave +parasitémie entre J4 et 14, sans ETP ;fièvre + parasitémie entre J4 et 14 sans ETP.Echec parasitologique tardif (EPT) : parasites sans fièvreentre J4 et 14 sans ETP ni ECTRéponse clinique et parasitol. adéquate (RCPA). Cnrcp 19
  20. 20. Efficacité de la chloroquine en fonction de l ’âge à Madagascar 10 mg/kg en une dose 60 RCPA 40 ETT N° cas 20 ETP 0 0-5 ans 5-14 ans 15 ans+ Cnrcp 20
  21. 21. Cnrcp 21
  22. 22. Cnrcp 22
  23. 23. marqueurs génétiques opérationnels de la résistance de P. falciparumpyriméthamine : Ser -> Asn au codon 108 de la DHFR ;cycloguanil : Ser -> Asn au niveau du codon 108 +Cys -> Arg au niveau du codon 59 de la DHFR (S108N +C59R) ;pyriméthamine-sulfadoxine : DHFR S108N + C59R + N51I +mutations en 437 et 540 de la DHPS présentes dans 70%des échecs cliniques à SP ;chloroquine : K -> T au codon 76 de la CRT (nécessaire maispas suffisant ; ex. au Mali, diviser par 2,1-2,8 pour prédirela R clinique). Cnrcp 23
  24. 24. Proportions de mutants pyriméthamine-R etchloroquine-R à Dielmo, Sénégal, 1990 - 1999 70 60 %S108N (pyrim-R) 50 %S108N (CQ-R) %K76T 40 30 20 10 0 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 Traitement Traitement chloroquine puis quinine sdx-pyriméthamine IP & Cnrcp 24
  25. 25. Diversité génétique des populations de P. falciparum• Les hôtes hébergent souvent plusieurs génotypes plasmodiaux• Cette complexité est un obstacle important pour le contrôle du paludisme, en particulier pour : – les traitements – les vaccins – l’épidémiologie – les études physio-pathologiques Cnrcp 25
  26. 26. Evaluation de la polyclonalité de P.falciparum au cours du traitement de voyageurs par la quinine• sans bénéfice individuel direct,• mettre en évidence lexistence de différents clones de P. falciparum chez des patients avant la prise de lantipaludique et au cours du traitement,• étudier leur évolution à laide des techniques de biologie moléculaire adaptées (PCR quantitative). Cnrcp 26
  27. 27. Problématique1- Pouvoir comparer l’isolat avant et après traitement2- Pouvoir détecter et quantifier un clone résistant minoritaire ou temporaire Cnrcp 27
  28. 28. Patients- 21 adultes fébriles, P.f au retour de pays endémique,- protocole IMEA, agréé CCPPRB,- hospitalisation courte,- quinine 8 mg/kg/8h en IV,- 10 prélèvements Hi, H2, H4, H12, H24, H36, H48, H60, H72 et H96- Hi (diagn.) et H2 sont séparés de 6 à 8h Cnrcp 28
  29. 29. À chaque prélèvement,• Frottis et goutte épaisse,• Extraction de l’ADN à partir de 100 µl de culot,• Amplification msp-2 et analyse de fragments Cnrcp 29
  30. 30. Analyse quantitative de fragments d ’ADN : electrophorégrammes Ratio du mélange de parasites PfHB3+Pf3D7 : 98/2 amorces marqueur de taille interne HB3 3D7 MSP2 Ratio du mélange PfHB3/Pf3D7 : 2/98 98 ± 0.3 2,2 ± 0.44 30
  31. 31. Réponse thérapeutique à la quinine : infection à 1 clone Patient 18 Camerounais, 3 sem au pays 6Log(Nbre de parasites/µl) 5 Clone a 4 3 2 1 0 Hi H0H4 H24 H48 H72 H96 Heures de prélèvements Cnrcp 31
  32. 32. Réponse thérapeutique à la quinine : infections à 3 clones P a t ie n t 1 7 : F lu c t u a t io n s d e s c lo n e s Patient 13 : Fluctuations des clones Ivoirien, 4 sem au pays 6 Malien, 2 sem au pays 6 Log(Nbre de parasites/µl)Log (Nbre de parasites/µl) 5 C lo n e a 5 Clone a C lo n e b Clone b 4 4 C lo n e c Clone c 3 3 2 2 1 1 0 0 Hi H4 H 12 H2 4 H3 6 H4 8 H6 0 H7 2 H9 6 Hi H2H4 H12 H24 H36 H48 H60 H72 H96 H e u r e s d e p r é lè v e m e n ts Heures de prélèvements Patient 15 : Fluctuations des clones Patient 19 : Fluctuations des clones 6 Comorien, 2 sem au pays 6 Camerounais, 2 sem au pays Log(Nbre de parasites/µl) 5 Clone a Clone a Log(Nbre de parasites/µl) 5 Clone b Clone b 4 4 Clone c Clone c 3 3 2 2 1 1 0 Hi H4 H24 H96 0 Hi H4 H36 H96 Heures de prélèvements Heures de prélèvements Cnrcp 32
  33. 33. Quantification des fragments MSP2 soustraitement à la quinine : infection ≥ 6 clones Patient 10 Clone a : mutant dhfr & crt 6 Clone b : mutant dhfr & crt Log(Nbre de parasites/µl) 5 Clone c : mutant dhfr, sauvage crt 4 Clone d : sauvage dhfr Clone e : sauvage dhfr, sauvage crt 3 Plasma : 2 chloroq=67ng/ml proguan=0 1 → 0 Hi H4 H24 H48 H72 H96 Heures de prélèvements Cnrcp 33
  34. 34. Conclusion 1• Le mono-parasitisme est l’exception,• linoculation de souches S et R est fréquente,• impossible d’exclure la présence d’une souche résistante sur le prélèvement avant traitement,• intérêt potentiel d’analyser les parasites résiduels en cours de traitement,• s’il est démontré que la gravité est liée à la charge de parasites séquestrés : → la chimioprophylaxie diminue le risque de gravité si un partie de l’inoculum est sensible Cnrcp 34
  35. 35. Où est le paludisme (à falciparum) chimiorésistant ?• Dans toute l’Afrique tropicale : différences significatives de fréquence et niveaux de résistance• Dans les forêts d’Asie du Sud-Est et de Papouasie: faible n° d’épisodes par individu et forte pression médicamenteuse,• En Amérique, en bordure des rivières d’Amazonie, pas de résistance en Amérique Centrale Cnrcp 35
  36. 36. Stratégies • Vieux méicaments – Rotation ? – Association ? • nouveaux – Seuls ? – Associés ? Cnrcp 36
  37. 37. Antimalariques disponibles face à la résistance• sulfadoxine -pyriméthamine (Fansidar®) 1• amodiaquine (Camoquin®, Flavoquine®) 2• méfloquine (Lariam®) 10• artéméther (Paluther®) 10• quinine 50• halofantrine (Halfan®) 300• associations : –méfloquine + artémether (ou artesunate) 10 –dapsone+proguanil (ou chlorproguanil-LapDap®) 10 –quinine + cycline (ou clindamycin) 100 –artémether + luméfantrine (Riamet®,coartem®) 300, 20 –atovaquone + proguanil (Malarone®) 300 Cnrcp 37
  38. 38. L’Afrique après la H2N O O N N N S Cl NH2 N chloroquine :H 2N N O H2C H O C H3 CH3 amodiaquine ou CH3 SULFADOXINE P Y R IM E T H A M IN E sulfadoxine-pyriméthamine (SP, Fansidar®) • À peine plus coûteuses que la chloroquine, • les autres traitements antipaludiques coûtent plus que la dépense annuelle en médicament par individu dans beaucoup de pays africains, • SP première ligne thérapeutique dans 5 pays d ’Afrique de l ’Est, • seconde ligne dans les autres pays d ’Afrique. Cnrcp 38
  39. 39. Amodiaquine-artésunatevs. Amodiaquine chez 941 enfants en Afrique % guérison Amodiaquine* Amodiaquine* ∆ p -artésunate** Sénégal J14 94% 95% -0,3% 0,91 Sénégal J28 82% 81% 1,8% 0,7 Gabon J14 100% 98% 2,3% 0,15 Gabon J28 89% 77% 11,4% 0,043 Kenya J14 91% 74% 17,1% <0,0001 Kenya J28 70% 41% 28,8% <0,0001 *10mg/kg/j x 3j; **4 mg/kg/j x3j Adjuik, Lancet, 2002 39
  40. 40. Cl atovaquone O OH• O Hydroxynaphthoquinone (1982), large spectre dactivité antiprotozoaire;• biodisponibilité 22%, clairance plus lente dans les populations africaines (t1/2 73h) que dans les populations asiatiques (t1/2 31h), action schizonticide lente (TDP 60h) ;• sélection de mutants résistants très rapide chez P. falciparum : 30% de rechutes, dautant plus fréquentes que la charge parasitaire était élevée ;• potentialisation avec le proguanil (indépendamment de l’action de son métabolite) ;• association atovaquone-proguanil en traitement (1g + 400 mg/jx3) ou prophylaxie (250 mg + 100 mg/j) (Malarone®). Cnrcp 40
  41. 41. Atovaquone-proguanil (A-P) taux de guérison à J28 ou J35 Pays A-P comparateur PGabon 87% Amodiaquine 72% 0,02Zambie 100% Sulfad.-pyrim. 99% NSBrésil 98,7% Q-tétrac. 100% NSPhilippines 100% Chloroq.-sulfad.- < 0,05 pyrim. 87,5%Thaïlande 100% Méfloquine 86% < 0,02France 95* 100% Halofantrine 100%*TDP A-P 63h, H 48h (p=0,02), vomissts A-P > H (p=0,001) Cnrcp 41
  42. 42. artémisinine (=O) → dihydroartémisinine (-OH) → artémether (-OCH3) → artésunate (-O-succinyl)• Sesquiterpène-lactone (qinghaosu), absorption rapide mais incomplète par voie orale ou IM (biodisponibilité 32%); clairance rapide (t1/2 = 3-10h) ;• dosage d’artémether : 1,5 mg/kg/j IM x 5 (non curatif chez les non immuns) ;• action rapide ;• bien tolérée chez l’homme ;• Pas de chimiorésistance demontrée. CNRCP 42
  43. 43. luméfantrine• Benflumétol (1993). Pas absorbée chez le sujet à jeun (t1/2 72-120h). La débutyl-luméfantrine, 5 à 8 fois plus active que la molécule parente, est produite par la CYP3A4 des microsomes hépatiques. La cinétique du métabolite n’est pas connue.• Action similaire à la méfloquine et l’halofantrine (TDP 54h).• Allongement de l’espace QTc, ne semble pas dose dépendant.• Association artémether-luméfantrine en traitement 80mg+480mg x2/j x 3 (Riamet®, Coartem®, 2000). Cnrcp 43
  44. 44. Chimio-prophylaxie des groupes à risque Cnrcp 44

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