Travaux PratiquesTests de chimiosensibilité in vitro :     un test de phénotypage           Milijaona Randrianarivelojosia...
…, il est impératif de surveiller la sensibilité/résistance dePlasmodium sp aux antipaludiques, notamment dans lespays d’e...
Evaluation de la sensibilité de        P. falciparum aux antipaludiques                                                   ...
Evaluation de l’efficacité des traitements                   Test in vivo                  (traitement et                 ...
Evaluation de l’efficacité thérapeutique des               antipaludiquesProtocoles d’étude- WHO/CDS/CSR/EPH/2002.17- WHO/...
Evaluation de la chimiosensibilité de       P. falciparum in vitro                                          Test de       ...
Test de chimiosensibilité in vitro                      Examen microscopique                      OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. ...
Quand aura « facilement » les anticorps, …                                                                       Min      ...
Différentes étapes du test de chimiosensibilité                  in vitro (1)                            Réception des    ...
Différentes étapes du test de chimiosensibilité in                    vitro (2)                            Milieu de cultu...
Différentes étapes du test dechimiosensibilité in vitro (3)                  Mise en culture            Incubation pendant...
Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine tritiée                 dans l’ADN du parasiteHypoxanthine-3H      + ...
Différentes étapes du test de chimiosensibilité                 in vitro (4)                               Collecte du con...
Différentes étapes du test de chimiosensibilité in                    vitro (5)                   Comptage de la radioacti...
Comptage de radioactivité après un test                  d’antipaludogramme : illustration                      Chloroquin...
Pfcrt, marqueur de résistance P. falciparum             à la chloroquine                      MAL7P1.27 (www.plasmoDB.org)...
Pfdhfr, marqueur de résistance de P. falciparum             à la pyriméthamine                              59            ...
Détections des mutations des             marqueurs de résistance Génotype                        PCR/séquençage mutant + :...
Stratégie de surveillance (1)Analyse des rapports émanant des structures de santé debase, de district, provinciales …Suivi...
Stratégie de surveillance (2)    (Randrianarivelojosia et al, 2002)
Pratique de radioprotection    et utilisation de produits tritiés                 Exemple du GRP de l’IPM                 ...
Pourquoi la technique isotopique ?Paludisme : problème de santé publique ; avec risquede résistance des parasites, notamme...
Surveillance de la chimiosensibilité desparasite du paludisme à MadagascarCollaboration entre Ministère de la Santé et du ...
Surveillance de la sensibilité du parasiteTests in vitroDétection des mutations au niveau des marqueursgénétiques de la ré...
Source de rayonnement utiliséeHypoxanthine tritiéeSource non scellée, aqueuse, rayonnements β-Faible activitéPériode longu...
Mise en culture des parasitesMise en culture pendant 48 heures de sang parasité(parasites viables dans un échantillon de s...
IPM : Pratique de la radioprotectionDeux personnes compétentes en radioprotectionGestion des produits et des déchets ; pro...
Moyens de protectionIndividuelle : Port des gants et blouse est obligatoire,masque lors de la dilution des déchets liquide...
Gestions des déchets radioactifs à l’IPMLiquides : Stockage dans des bidons plastiques dans lasalle radioactive en attente...
Autorisation, contrôle, inspection, rigueurLimitation de quantité manipulée : activité annuelle (totale)utilisée = 6,4.108...
Prochain SlideShare
Chargement dans…5
×

Anti-paludogramme - Tests de chimiosensibilité in vitro : un test de phénotypage

286 vues

Publié le

Anti-paludogramme - Tests de chimiosensibilité in vitro : un test de phénotypage - Travaux pratiques de la 2e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - ANDRIANANTENAINA Hery - RANDRIANARIVELOJOSIA Milijaona - RASON Marie-Ange

Publié dans : Santé & Médecine
0 commentaire
0 j’aime
Statistiques
Remarques
  • Soyez le premier à commenter

  • Soyez le premier à aimer ceci

Aucun téléchargement
Vues
Nombre de vues
286
Sur SlideShare
0
Issues des intégrations
0
Intégrations
2
Actions
Partages
0
Téléchargements
4
Commentaires
0
J’aime
0
Intégrations 0
Aucune incorporation

Aucune remarque pour cette diapositive

Anti-paludogramme - Tests de chimiosensibilité in vitro : un test de phénotypage

  1. 1. Travaux PratiquesTests de chimiosensibilité in vitro : un test de phénotypage Milijaona Randrianarivelojosia milijaon@pasteur.mg Avec le concours de Dr Marie Ange Rason et de M. Herilalaina Andrianantenaina
  2. 2. …, il est impératif de surveiller la sensibilité/résistance dePlasmodium sp aux antipaludiques, notamment dans lespays d’endémie. P. falciparum P. vivax peuvent être résistant aux drogues P. malariae P. ovale
  3. 3. Evaluation de la sensibilité de P. falciparum aux antipaludiques Test de chimiosensibilité Echantillon Tests in vitro de sang Génotypage (marqueurs de résistance) Test in vivo(traitement et suivi)
  4. 4. Evaluation de l’efficacité des traitements Test in vivo (traitement et suivi)
  5. 5. Evaluation de l’efficacité thérapeutique des antipaludiquesProtocoles d’étude- WHO/CDS/CSR/EPH/2002.17- WHO/MAL96.1077 Augmentation de taux d’échec: Alerte !Médicaments- molécules préconisées par la politique nationale- molécules autorisées sur le marché et utilisées dans un paysDosage de taux plasmatique des médicamentset/ou des métabolites
  6. 6. Evaluation de la chimiosensibilité de P. falciparum in vitro Test de chimiosensibilité Echantillon Tests in vitro de sang Génotypage (marqueurs de résistance)
  7. 7. Test de chimiosensibilité in vitro Examen microscopique OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001 Phénotype résistant + : Colorimétrique (Elisa) Alarme ! Moreno et al, 2001 : LDH Noedl et al, 2002 : HRPII Méthode isotopique Desjardins et al, 1979; Le Bras & Deloron, 1983Mise en culture des parasites viables Cytométrie en flux Pattanapanyasat et al, 1997
  8. 8. Quand aura « facilement » les anticorps, … Min Concentration de drogue Maxdes tests seront faisables dans des structures hospitalières (périphériques)
  9. 9. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (1) Réception des prélèvements Plaques de culture à fond plat prémédicamentées
  10. 10. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (2) Milieu de culture RPMI ; Sérum humain AB+ (ou albumax); Hypoxanthine-3H Suspension parasitaire Lavage du culot de globules rouges parasités (GRP) ; préparation et distribution de la suspension de GRP sous la hotte
  11. 11. Différentes étapes du test dechimiosensibilité in vitro (3) Mise en culture Incubation pendant 42h à 37°C; atmosphère humide; en microaérophilie Congélation et décongélation des plaques de culture
  12. 12. Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine tritiée dans l’ADN du parasiteHypoxanthine-3H + ADN plasmodial (au début du ADN plasmodial test) marqué au tritium
  13. 13. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (4) Collecte du contenu des puits sur un filtre en fibre de verre
  14. 14. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (5) Comptage de la radioactivité (cpm) à l’aide du Microbeta Calcul des CI50 (concentration inhibitrice 50%) et des CI90 des antipaludiques
  15. 15. Comptage de radioactivité après un test d’antipaludogramme : illustration Chloroquine Amodiaquine Mefloquine Quinine Faibleconcentration A 3019 3126 3174 3221 3053 3288 2593 2464 3185 2963 3017 3174 B 2582 2951 2315 875 1006 870 2472 2446 2484 2570 2772 2608 C 1737 1767 1685 102 100 110 1678 1552 1557 1526 1716 1732 D 482 415 595 120 106 101 702 651 541 695 762 795 E 164 138 192 82 77 85 112 122 119 218 327 276 F 96 133 94 90 73 75 66 72 87 110 155 131 G 90 108 3040 78 104 3340 105 76 3552 111 122 2943 Forteconcentration H 103 100 3276 101 114 3045 77 104 3187 113 135 3017 Cellules colorées en jaune = témoin (i.e. puits sans antipaludiques)
  16. 16. Pfcrt, marqueur de résistance P. falciparum à la chloroquine MAL7P1.27 (www.plasmoDB.org) (Fidock et al, 2000)
  17. 17. Pfdhfr, marqueur de résistance de P. falciparum à la pyriméthamine 59 51 Drug/substrate 108 NADP 164 pfDHFR
  18. 18. Détections des mutations des marqueurs de résistance Génotype PCR/séquençage mutant + : Alarme ! PCR nichée mutation spécifique Utilisation des sondesAmplification par PCR PCR/RFLP (Ranford-Cartwright et al, 2002)
  19. 19. Stratégie de surveillance (1)Analyse des rapports émanant des structures de santé debase, de district, provinciales …Suivi de cohortes (sites sentinelles)Mise en place de réseau (national, régional, …)…
  20. 20. Stratégie de surveillance (2) (Randrianarivelojosia et al, 2002)
  21. 21. Pratique de radioprotection et utilisation de produits tritiés Exemple du GRP de l’IPM par Marie Ange Rason mieange@pasteur.mgAvec le concours de Dr Milijaona Randrianarivelojosia et de Madagascar-INSTN
  22. 22. Pourquoi la technique isotopique ?Paludisme : problème de santé publique ; avec risquede résistance des parasites, notamment de P.falciparum, aux droguesIntérêt en santé publique : surveiller la sensibilitéou résistance de l’agent causal du paludisme auxdrogues
  23. 23. Surveillance de la chimiosensibilité desparasite du paludisme à MadagascarCollaboration entre Ministère de la Santé et du PlanningFamilial et l’Institut Pasteur de MadagascarAvec une standardisation de la techniqueBut : doter Madagascar (et la sous région de l’OcéanIndien) d’un outil d’évaluation de l’efficacité desantipaludiques
  24. 24. Surveillance de la sensibilité du parasiteTests in vitroDétection des mutations au niveau des marqueursgénétiques de la résistance qui implique uneamplification par PCR des gènes d’intérêt (techniqueisotopique ou non-isotopique)Antipaludogramme utilisant le technique de marquageisotopique avec l’hypoxanthine tritiée pour l’étude de lasensibilité de Plasmodium falciparum aux antipaludiques
  25. 25. Source de rayonnement utiliséeHypoxanthine tritiéeSource non scellée, aqueuse, rayonnements β-Faible activitéPériode longue (12,4 ans)Précurseur d’acides nucléiques et est incorporée dansl’ADN pendant la phase de division des cellules.
  26. 26. Mise en culture des parasitesMise en culture pendant 48 heures de sang parasité(parasites viables dans un échantillon de sang veineux)dans du milieu de culture + hypoxanthine tritiée, et enprésence de différentes concentrations d’antipaludiques,Paramètre utilisée pour classer selon la sensibilité : CI50% ou concentration inhibitrice du médicament qui inhibeà 50% la croissance du parasite.
  27. 27. IPM : Pratique de la radioprotectionDeux personnes compétentes en radioprotectionGestion des produits et des déchets ; protectionsindividuelles et collectivesProcédures disponibles ; répartition de taches (etseules les personnes autorisées peuventmanipuler l’hypoxanthine tritiée)
  28. 28. Moyens de protectionIndividuelle : Port des gants et blouse est obligatoire,masque lors de la dilution des déchets liquidesCollective : Hotte à flux laminaire pour la culture, hottede chimie pour la collecte, salle spéciale pour laradioactivité, matériels à usage unique, pipetteautomatique, microplaques, papier aluminium etabsorbant, balisage des portes d’entrées, poubellesspéciales, plateaux récupérateurs.
  29. 29. Gestions des déchets radioactifs à l’IPMLiquides : Stockage dans des bidons plastiques dans lasalle radioactive en attente des contrôles par Madagascar-INSTN avant le rejetSolides : Compacter et stocker dans des fûts métalliquesqui sont supportés par des bois carrés, dans une fossebétonnée dans l’enceinte de l’IPM.
  30. 30. Autorisation, contrôle, inspection, rigueurLimitation de quantité manipulée : activité annuelle (totale)utilisée = 6,4.108 < 1,2.1010 Bq (LAI)Contrôle régulier de surface (détection de contaminationdes plans de travail)Autorisation d’utilisation délivrée par Madagascar-INSTN(et nous avons eu un projet IAEA)Inspection fréquente/collaboration des officiers deradioprotection de l’INSTN-MadagascarSuivi médical (annuel) du personnel

×