Manuel de formation au diagnostic biologique du paludisme - Conférence du 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Didier MENARD et Vincent THONIER

1. atelier.paludisme@pasteur.mg http://www.pasteur.mg/Atelier-Palu/
MANUEL DE FORMATION
AU DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
DU PALUDISME
5ème Edition de l’Atelier Paludisme
Session 2007
19 Février au 31 Mars 20056
Dr Didier Ménard
Unité de Recherche sur le Paludisme
Institut Pasteur de Madagascar

2. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
DU PALUDISME
Il comprend plusieurs étapes
- ETAPE 1-
Prélèvement du malade
- ETAPE 2-
Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince
- ETAPE 3-
Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du paludisme
Si la recherche est négative : Conclure par « Examen négatif, Absence de
Plasmodium »
Si la recherche est positive, passer à l’étape 4
- ETAPE 4-
Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse
et le frottis mince
- ETAPE 5-
Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse (si il y a peu de
parasites) ou sur le frottis mince (si il y a beaucoup de parasites)
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3. - ETAPE 1-
Prélèvement du malade
Matériel nécessaire
Lames de verre propres
Lancette stérile
Méthanol ou Ethanol
Coton hydrophile
Crayon gras ou stylo graveur
Méthode
Chez les enfants et adultes, la piqûre
se fait au niveau du 3ème ou 4ème
doigt de la main gauche, sur le côté
qui est moins sensible que le bout
du doigt
Chez les nourrissons de moins de 6
mois, la piqûre se fait au niveau du
talon ou du gros orteil.
Nettoyer l'endroit choisi d'abord
avec un tampon de coton imbibé
d'alcool, puis avec un tampon sec
pour enlever toute trace d'alcool.
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4. Piquer d'un coup sec et rapide.
Essuyer la première goutte de sang
avec un tampon de coton sec
De la main droite : prendre une lame
en la tenant par les bords.
De la main gauche : presser le doigt
piqué pour faire sortir une goutte de
sang.
Prendre une 2ème lame et recueillir
une seconde goutte de sang en la
mettant délicatement en contact avec
une extrémité de la lame
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5. - ETAPE 2-
Préparation et coloration de la goutte épaisse et du
frottis mince
Préparation de la goutte épaisse
Faire un étalement épais, au centre de la lame.
Étaler le sang avec le coin d'une lame propre, jusqu'à épaississement uniforme.
Les étalements trop minces ou trop épais ne se colorent pas bien.
Au bout de la lame, inscrire au crayon gras le numéro du malade.
Laisser sécher à l'air pendant au moins 10 minutes, par exemple sur un plan de
travail ensoleillé, à condition de protéger l'étalement contre les mouches et la
poussière.
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6. Préparation du frottis mince
Tenir la lame d'une main. De l'autre, poser le bord de la lame rodée juste en avant
de la goutte de sang.
Faire glisser la lame rodée jusqu'à ce qu'elle touche la goutte de sang.
Laisser le sang se répartir tout le long du bord de la lame rodée.
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7. Pousser la lame rodée jusqu'au bout de la lame d'étalement, d'un mouvement doux
et régulier (tout le sang doit être réparti avant que l'on atteigne le bout de la lame.
Vérifier que l'étalement est bien fait (voir dessin A) :
- il ne doit pas présenter de lignes transversales ou horizontales
- il doit être lisse aux extrémités, et non irrégulier ou strié, comme sur le dessin B
- il ne doit pas être trop long ni trop épais
- il doit être étalé uniformément
Un séchage correct est capital pour conserver la qualité de l'étalement, surtout dans
les pays à climat humide. Sécher en agitant rapidement à 5 cm environ d'une lampe
à alcool allumée ; sur le côté de la lampe, un peu au-dessus de la flamme (mais
jamais directement au-dessus).
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8. Inscrire sur la lame le nom et le numéro du malade. Écrire au crayon gras sur la
partie épaisse de l'étalement, qui n'est pas utilisée pour l'examen.
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9. Coloration de la goutte épaisse
Matériel nécessaire
Éprouvette de 50 ml
Pipette en verre de 5 ml
Poire en caoutchouc
Bac à coloration
Agitateur
Pinces à lame
Râtelier à lames
Minuterie
Colorant de Giemsa
Eau du robinet ou de pluie
Préparation du Giemsa à 4 %
Remplir le bac à coloration avec 48 ml d’eau du robinet ou de pluie
Ajouter 2 ml de colorant de Giemsa à l’aide d’une pipette plastique
Mélanger à l’aide d’un agitateur
NB : La solution de Giemsa à 4 % ne se conserve que 2 jours
Coloration des lames
Plonger les lames à colorer dans la cuve à coloration contenant la solution de
Giemsa à 4 %
Laisser colorer pendant 20 minutes
Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet
Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale
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10. Coloration du frottis mince
Matériel nécessaire
Coloration rapide Kit RAL 555 (3 x 100 ml)
Recharge fixateurs RAL 555
Recharge Eosine RAL 555
Recharge Bleu RAL 555
Coloration des lames
Plonger 30 secondes la lame dans le fixateur (flacon 1)
Plonger 30 secondes la lame dans l’éosine (flacon 2)
Rincer la lame à l’eau du robinet
Plonger la lame 2 minutes dans le bleu (flacon 3)
Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet
Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale
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11. - ETAPE 3-
Examen de la goutte épaisse à la recherche des
parasites du paludisme
L'examen d'une goutte épaisse est basé sur l'observation microscopique de 100
champs de bonne qualité. C'est-à-dire que l'on ne peut pas déclarer le prélèvement
négatif avant d'avoir examiné 100 champs sans parasite.
Technique d'examen des gouttes épaisses
1. Mettre de l'huile à immersion sur la goutte épaisse.
2. Amener l'objectif à immersion 100 x au-dessus de la zone sélectionnée de la
goutte épaisse.
3. Abaisser l'objectif jusqu'à ce qu'il entre en contact avec l'huile.
4. S'assurer que la zone choisie a bien la qualité requise et examiner la lame sur 100
champs avec l'objectif à immersion. Ne déplacer la lame que d'un champ à la fois,
en suivant le schéma ci-dessus. Corriger la mise au point fine avec la vis
micrométrique.
5. Pour vous aider, utilisez un compteur manuel pour compter le nombre de champs
examinés.
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12. A l'examen, vous devez observer :
La goutte épaisse est formée d'un grand nombre d'hématies
déshémoglobinisées rassemblées en paquets.
Lors de la coloration de la goutte épaisse, l'eau de la solution de Giemsa agit sur les
globules rouges non fixés : le contenu des cellules se dissout alors dans l'eau.
Les leucocytes et les plaquettes présentent un aspect très semblable à ce que l'on
observe dans un frottis. Comme ils n'ont pas été étalés par le frottis, les globules
blancs paraissent plus petits, avec un cytoplasme plus compact autour du noyau.
Hématies
N : Neutrophile
E : Éosinophile
L : Lymphocyte
P : Plaquettes
Dans les gouttes épaisses, les parasites, comme les globules blancs, apparaissent plus
petits que dans les frottis. Il vous faudra sans doute regarder avec beaucoup d'attention
avant de les apercevoir. Vous devrez refaire la mise au point fine avec la vis
micrométrique chaque fois que vous changez de champ. Vous observerez ainsi la goutte
épaisse dans différents plans horizontaux.
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13. Les fins anneaux de cytoplasme apparaissent parfois interrompus ou incomplets. C'est
l'aspect normal des trophozoïtes dans les gouttes épaisses.
De même l'absence d'hématie peut également rendre difficile l'observation des
granulations de Schüffner ; en fait, dans les parties les plus épaisses de la goutte il est
parfois impossible de les voir. On peut cependant souvent observer le «fantôme» des
globules rouges entourant les parasites dans les parties les plus fines, en général au bord
de la goutte épaisse, ce qui aide à poser le diagnostic.
Remarque : Il est impossible d'observer les taches de Maurer avec P. falciparum dans
une goutte épaisse.
Les espèces plasmodiales dans les gouttes épaisses
Plasmodium falciparum
Trophozoïtes jeunes, en croissance, et/ou gamétocytes matures
généralement visibles
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
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14. Plasmodium vivax
Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner dans les fantômes des
érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
Plasmodium ovale
Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner nettement visibles
dans les fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
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15. Plasmodium malariae
Tous les stades sont visibles
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
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16. - ETAPE 4 -
Identification des espèces de Plasmodium sur la
goutte épaisse et le frottis mince
En cas de résultat positif, il est nécessaire d’examiner le frottis mince pour déterminer
le ou les espèce(s) en cause.
Examen du frottis mince
Pour examiner un frottis, procéder de façon systématique et normalisée :
Mettre la lame sur la platine.
Placer l'objectif 100 x à immersion au-dessus du bord du frottis, à mi-distance de ses
deux extrémités.
Mettre une goutte d'huile à immersion à cet endroit.
Abaisser l'objectif à immersion jusqu'à ce qu'il soit en contact avec l'huile.
Examiner le frottis de la façon suivante pour déterminer le ou les espèce(s) en cause.
Identification des espèces plasmodiales
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17. Les parasites découverts dans le sang en sont à différents stades de
développement
Les hématies parasitées peuvent rester identiques ou changer de couleur ou de forme,
ou encore contenir des granulations roses (granulations de Schüffner).
Il existe 4 espèces de plasmodium.
En République Centrafricaine, l’espèce prédominante est P. falciparum. P. malariae est
fréquente, P. ovale est rare.
Attention : on peut trouver plusieurs espèces associées chez un même malade.
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18. Plasmodium falciparum
Trophozoïte jeune
Stade fréquent
Cytoplasme : petit anneau fin, bleu pâle, sans granulations
Chromatine : 1 ou 2 petits grains rouges
Trophozoïte adulte
Stade fréquent
Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, ou aspect en virgule, ou en point
d'exclamation
Schizonte
Très rare
Pratiquement jamais trouvés dans les étalements de sang (sauf dans les cas très graves)
Mérozoites : 18 à 32
Pigment: brun foncé ou noir
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19. Gamétocyte
Stade assez fréquent
Forme : banane, croissant ou faux
Couleur : bleu (mâle) ou bleu soutenu (femelle)
Noyau : rose-rouge
Pigment : quelques grains bleu- noir situés au centre du cytoplasme, ou dispersés
Hématie
De taille normale
Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes.
Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.
Densité parasitaire
Souvent très élevée
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20. Plasmodium malariae
Trophozoïte jeune
Stade fréquent
Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, avec quelques grains de pigments noirs
Chromatine : 1 grosse tâche rouges
Trophozoïte adulte
Stade fréquent
Cytoplasme : soit tâche compacte, arrondie, bleu foncé, avec de nombreux grains de
pigment noirs, soit disposé en bande (étalements minces seulement).
Chromatine : tâche ronde ou bande rouge
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21. Schizonte
Stade assez fréquent
Mérozoites : 8 à 10
Chacun est une grosse tâche rouge entourée d’un peu de cytoplasme pâle.
Ils peuvent avoir une disposition irrégulière (forme jeune) ou être disposés en couronne
(forme adulte
Gamétocyte
Stade assez fréquent
Forme : grand, ovale ou arrondi
Couleur : bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle)
Noyau : une tâche ronde de chromatine rouge contre un bord
Pigment : gros grains noirs dans le cytoplasme
Hématie
De taille et forme normales
Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes.
Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.
Densité parasitaire
Faible
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22. Plasmodium vivax
Trophozoïte jeune
Stade fréquent
Cytoplasme : anneau bleu assez gros, à contour irrégulier
Chromatine : 1 grain rouge, assez gros
Trophozoïte adulte
Stade peu fréquent
Cytoplasme : large tâche bleue, irrégulière (quelque fois divisée en 2, 3 ou 4), avec de
petits grains de pigment brun-orange.
Chromatine : une tâche rouge
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23. Schizonte
Stade assez fréquent
Mérozoites : 12 à 18 gros grains rouges compacts, posés sur le cytoplasme bleu pâle
Gamétocyte
Stade fréquent
Femelle : ovale ou arrondi, bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle)
Noyau triangulaire rouge soutenu, souvent placé à une extrémité; nombreux grains
de pigments orange dans le cytoplasme.
Mâle : arrondi, bleu clair
Noyau central rond, rouge clair; quelques
grains de pigments orange dans le cytoplasme
Hématie
Grosses granulations de Schüffner, souvent colorées en rose, surtout autour des
trophozoïtes adultes.
Densité parasitaire
Moyenne
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24. Plasmodium ovale
Trophozoïte jeune
Cytoplasme : anneau régulier, bleu soutenu
Chromatine : 1 grain rouge de taille moyenne
Trophozoïte adulte
Cytoplasme : tâche ronde compacte, très bleue avec quelques grains de pigment bruns.
Chromatine : une grosse tâche rouge
Schizonte
Mérozoites : 8 à 14 grosses tâches rouges en couronne, autour d’un amas central de
grains de pigments bruns.
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25. Gamétocyte
Stade fréquent
Forme : grand, ovale ou arrondi bleu soutenu
Noyau : une tâche ronde
Pigment : quelques grains bruns dans le cytoplasme
Différent de P. vivax par son pigment brun et de P. malariae par la présence de grains
de Schüffner
Hématie
Peut paraître ovale, avec des extrémités irrégulières
Grosses granulations de James rouges, facilement visibles.
Densité parasitaire
Moyenne
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26. - ETAPE 5-
Estimation de la densité parasitaire sur la goutte
épaisse ou sur le frottis mince
En cas de résultat positif, il est nécessaire d’estimer la densité parasitaire car la gravité de
l’infection palustre est liée au nombre d’hématies parasitées.
Un paludisme à P. falciparum est considéré comme sévère quand le nombre d’hématies
parasitées est supérieur à 100 000 par µl, l’accès pernicieux est probable au-delà de 150
000 par µl. Une parasitémie supérieur à 400 000 par µl est un élément de très mauvais
pronostic
Sur la goutte épaisse
On estime la densité parasitaire sur la goutte épaisse
quand le nombre de parasite est faible.
Le calcul de la densité parasitaire va être établit par rapport aux leucocytes. Il suffit de
compter le nombre de parasites que l’on voit et de compter au moins 200 leucocytes.
On peut s’aider pour cela d’un compteur de cellules. On estime que le nombre moyen
de leucocytes est de 8000 par µl.
Le calcul du nombre de parasites par µl est
8000 x Nombre de parasites comptés
Nombre de parasites par µl =
Nombre de leucocytes comptés
Le pourcentage d’hématies parasitées peut en être déduit en prenant comme nombre
moyen d’hématies, 4 500 000 par µl :
Nombre de parasites par µl
Pourcentage d’hématies parasitées =
45000
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27. Exemple :
On compte 358 parasites et 205 leucocytes sur la lame
Le nombre de parasites par µl est donc : (8000 x 358) / 205 = 13 971 par µl
Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : 13 971 / 45 000 = 0,31 %
Sur le frottis mince
On estime la densité parasitaire sur le frottis mince
quand le nombre de parasite est élevé.
On compte le nombre d’hématies parasitées par rapport au nombre d’hématies saines et
on établit le pourcentage d’hématies parasitées.
Il suffit pour cela de compter dans 3 à 4 champs microscopiques, choisis au hasard mais
éloignés les uns des autres, le nombre d’hématies (au minimum de 1000 hématies) et
le nombre d’hématies parasitées.
NB : un champ microscopique à l’immersion (x 100) contient entre 150 et 300 hématies
Environ 150 hématies Environ 300 hématies
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28. Le pourcentage d’hématies parasitées est donc :
Nombre d’hématies parasitées x 100
Pourcentage d’hématies parasitées =
Nombre d’hématies saines
Le nombre de parasites par µl peut être calculé en prenant comme nombre moyen
d’hématies, 4 500 000 par µl :
Nombre de parasites par µl = % d’hématies parasitées x 45 000
Exemple :
On compte 16 hématies parasitées sur 5 champs microscopiques d’environ 300
hématies.
Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : (16 x 100) / 1500 = 1,06 %
Le nombre de parasites par µl est donc : 1,06 x 45 000 = 48 000 par µl
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